Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Vi takker medlemmer av Eyo-laboratoriet for å diskutere ideene som presenteres i dette manuskriptet. Vi takker Dr. Justin Rustenhoven fra Kipnis Lab ved University of Virginia for gaven til NG2DsRed mus33. Dette arbeidet støttes av finansiering fra National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health til U.B.E (K22 NS104392).

Alle tiltak er i samsvar med retningslinjene som er fastsatt og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
1. Mus forberedelse for kranial vindu implantasjon
MERK: Ulike transgene muselinjer med blomstrende koder er egnet for bildebehandling.
<ol><li>Bruk CX3CR1GFP/+ mus26 til å visualisere microglia in vivo. Vanligvis brukes unge til unge voksne 4 til 10 uker gamle mus som veier 17-25 g....

Bruk av in vivo to-foton imaging har åpnet muligheter til å utforske overflod av cellulære interaksjoner og dynamikk som oppstår i den sunne hjernen. Innledende studier fokusert på å bruke den åpne skallen craniotomy tilnærming til bilde nevronale dendritter av både akutt og kronisk imaging37,38. Dette kan også brukes til å belyse nevroimmune interaksjoner i hjernen. Denne protokollen beskriver en metode for pålitelig avbildning av fluorescerende merk...

Sentralnervesystemet (CNS) styres av et komplekst samspill mellom ulike bosatte celletyper, inkludert nevroner, glia og fartøyrelaterte celler. Tradisjonelt ble nevrale celler studert i isolert, co-kultivert1,2,3,4,5 (in vitro) eller utskåret hjernevev (ex vivo)6,7,8,9,10 sammenhenger. Det er imidlertid behov for å ytterligere forstå nevralcelleatferd og interaksjoner i det innfødte miljøet til den intakte hjernen in vivo. I denne protokollen beskriver vi en metode for å kartlegge in vivo-områder av interesse og nøyaktig re-bilde disse områdene i fremtidige bildeøkter for å spore de komplekse interaksjonene mellom de ulike CNS-celletypene over lengre perioder.
Utviklingen av in vivo imaging tilnærminger har gitt betydelige gevinster for riktig forståelse av nevrale funksjon11,12,13,14,15. Spesielt gir disse tilnærmingene flere fordeler fremfor tradisjonelle in vitro- og ex vivo-tilnærminger. For det første har in vivo-bildesystemer fysiologisk relevante celle- og vevskomponenter som vaskulaturen med hele repertoaret av cellulære interaksjoner for å gi en fullstendig forståelse av nevrale nettverksfysiologi. For det andre tyder nylige funn på at når de fjernes fra sitt opprinnelige miljø, mister visse nevrale celler (som microglia) viktige egenskaper ved sin identitet og dermed fysiologi16,17 som kan bevares i in vivo-innstillingen. For det tredje gir in vivo-bildesystemer mulighet for stabile langsgående undersøkelser av uker til måneder til å studere CNS cellulære interaksjoner. Til slutt, gitt det økende beviset for bidrag fra det perifere immunsystemet18,,19 og mikrobiomet20,21 i CNS fysiologi, gir in vivo-systemer en plattform for å avhøre slike bidrag og effekter på CNS-celler. Dermed tilnærminger som bruker langsgående in vivo imaging å studere nevro-immun fysiologi og interaksjoner i friske, skadde, og syke tilstander er et flott komplementært tillegg til tradisjonelle tilnærminger.
I denne protokollen beskriver vi en pålitelig tilnærming til bilde forskjellige celletyper i hjernen, inkludert microglia, nevroner og NG2+ celler som eksempler. To tilnærminger for å visualisere nevrale celler in vivo er utviklet: den tynnede skallen tilnærming og den åpne skallen med en kranievindu tilnærming. Selv om tynnet skallen tilnærminger er i bruk og foretrekkes fordi de overvinne noen av ulempene ved den åpne skallen tilnærming som glial celle aktivering, høyere enn fysiologiske ryggraden dynamikk og bruk av anti-inflammatoriske midler22,23,24,25, tynnet skallen tilnærminger viser også noen kritiske ulemper. For det første er tynningsprosedyren en svært delikat prosedyre som mange forskere finner vanskelig å perfeksjonere, spesielt når re-tynning er nødvendig. Dette er tilfelle fordi det ofte er vanskelig for eksperimenterere å fastslå at de har tynnet skallen til en ~ 20 μm dybde. For det andre, for tilstrekkelige sammenligninger mellom mus, må tynning være identisk, og en rekke tynningssuksess mellom bildeøkter eller mus kan komplisere visualisering av nevrale strukturer. For det tredje, når de brukes til langsgående avbildning, kan dyr med tynnede hodeskaller bare brukes til et begrenset antall økter når re-tynning av skallen er ansatt. Forth, siden noen av beinvevet fortsatt gjenstår, kan klarhet i dybden av bildebehandling bli kompromittert fra den tynnede skallen tilnærming slik at for stor visualisering av mer overfladisk, men ikke så mye med dypere regioner. I lys av dette kan ikke dypere hjernestrukturer som hippocampus, med hell avbildet med den tynnede skallentilnærmingen. Disse hensynene øker behovet for alternative og komplementære tilnærminger som kan overvinne disse bekymringene.
Alternativ til den tynnet skallen tilnærming, den åpne skallen vindu implantasjon tilnærming bruker en prosedyre der skallen er erstattet med en optisk klart glass deksler. Dette gir mulighet for et nesten ubegrenset antall bildeøkter. Videre, gitt utskifting av skallen med glassdekslerslip, gir denne metoden et klart visningsvindu av fluorescerende merkede hjerneceller i omfattende perioder fra timer til måneder, og kan derfor brukes til å studere celleaktivitet og interaksjoner som er relevante for fysiologi, aldring og patologi.
Samlet sett beskriver vi trinn som kan følges for å gjøre implantat kroniske kraniale vinduer gjennom en stereotaxic kraniotomi som muliggjør in vivo-avbildning av hjerneområder av interesse. Vi beskriver også hvordan den brutto stabile hjernevaskulaturen eller de fluorescerende merkede dendrittene kan brukes til å generere et grovt eller fint kart, henholdsvis av hjernens interesseområder. Denne tilnærmingen kan deretter brukes til gjentatt bildebehandling over flere økter. Betydningen av denne teknikken ligger derfor i sin evne til å avbilde de langsiktige endringene eller stasis i hjerneelementer, inkludert arrangement, morfologi og interaksjoner av de forskjellige cellulære typene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coverglass (3mm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&#38;qid=1583856837&#38;s=pet-supplies&#38;sr=8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demi Ultra LED Curing Light System</td>
			<td>Dental Health Products, Inc</td>
			<td>910860-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Osada: www.osadausa.edu</td>
			<td>EXL-M40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill Bit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Henry Schien</td>
			<td>1338333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBond Total Etch (Primer glue)</td>
			<td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td>
			<td>66040094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>81-88-9 (R6626)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetris Evoflow glue (Final glue)</td>
			<td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td>
			<td>#595956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Brav Mini+</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0&#38;hvadid=167141013968&#38;hvpos=&#38;hvnetw=g&#38;hvrand=12368793083893626704&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvqmt=&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint=&#38;hvlocphy=9008337&#38;hvtargid=pla-332197544154&#38;psc=1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

Sentralnervesystemet (CNS) reguleres av et komplekst samspill mellom nevronale, glial, stromal og vaskulære celler som letter riktig funksjon. Selv om det å studere disse cellene isolert in vitro eller sammen ex vivo gir nyttig fysiologisk informasjon; fremtredende trekk ved nevralcellefysiologi vil bli savnet i slike sammenhenger. Derfor er det behov for å studere nevrale celler i deres innfødte in vivo miljø. Protokollen som er beskrevet her beskriver repeterende in vivo to-foton av nevrale celler i gnagercortex som et verktøy for å visualisere og studere bestemte celler over lengre perioder fra timer til måneder. Vi beskriver i detalj bruken av den grovt stabile hjernevaskulaturen som et grovt kart eller fluorescerende merket dendritter som et fint kart over utvalgte hjerneområder av interesse. Ved hjelp av disse kartene som en visuell nøkkel, viser vi hvordan nevrale celler kan nøyaktig flyttes for etterfølgende repeterende in vivo-bildebehandling. Ved hjelp av eksempler på in vivo-avbildning av fluorescerende merket microglia, nevroner og NG2+ celler, viser denne protokollen evnen til denne teknikken for å tillate repeterende visualisering av cellulær dynamikk i samme hjerneplassering over lengre tidsperioder, som kan ytterligere bidra til å forstå de strukturelle og funksjonelle svarene til disse cellene i normal fysiologi eller følge patologiske fornærmelser. Der det er nødvendig, kan denne tilnærmingen kobles til funksjonell avbildning av nevrale celler, for eksempel med kalsiumavbildning. Denne tilnærmingen er spesielt en kraftig teknikk for å visualisere den fysiske interaksjonen mellom ulike celletyper av CNS in vivo når genetiske musemodeller eller spesifikke fargestoffer med distinkte fluorescerende koder for å merke cellene av interesse er tilgjengelige.

For å visualisere mikroglial dynamikk in vivo ble dobbelt transgene CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-mus brukt. Thy1-YFP H-linjen brukes i motsetning til Thy1-GFP M-linjen for å unngå florescence overlapping av microglia (GFP) og nevroner (YFP). Alternative tilnærminger kan bruke en reporterlinje der microglia er merket med f.eks, tdTomato og deretter Thy1-GFP M-linjen kan brukes. En ulempe med H-linjen er at YFP merker mange nevroner og etiketten øker med økende alder (personlig observasjon). M-linjen vis...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Denne protokollen beskriver en kronisk kranial vindu implantasjon teknikk som kan brukes til langsgående avbildning av nevro-glio-vaskulære strukturer, interaksjoner, og funksjon i både sunne og syke forhold. Det fungerer som et komplementært alternativ til den transkranielle bildetilnærmingen som, mens den ofte foretrakk, har noen kritiske begrensninger.

Presis hjernekartlegging for å utføre repeterende in vivo-avbildning av nevro-immun-dynamikk hos mus

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Denne protokollen viser hvordan In Vivo Two-Photon mikroskopi kan brukes til å gjøre repeterende visualisering av cellulær dynamikk, i samme hjerneplassering over lengre tidsperioder. Fordelen med denne teknikken er at det gjør det mulig å bilde de langsiktige endringene i cellulære elementer i hjernen, inkludert arrangement, morfologi og fysiske interaksjoner mellom ulike celletyper av CNS. Denne teknikken kan være spesielt nyttig i å eliciting celle-celle interaksjoner, celledynamikk, og morfologiske endringer under hjernen plastisitet, og neurodegeneration.Begynn med å forberede en ung eller ung voksen, fire til 10 uker gammel, en CX3CR1 GFP heterozygote mus, som veier 17 til 25 gram, for en kranial vinduimplantasjon. Etter bedøving av musen, bruk en hårtrimmer til å barbere håret på hodet, mellom ørene, omtrent fra øyenivå, til toppen av nakkeområdet. Flytt musen til stereotaktisk kirurgi stasjon, nesekjegle, og stabilisere hodet ved hjelp av ørestenger.Hold musen på varmeputen, gjennom hele prosedyren. Smør begge øynene med oljesalve, og injiser deretter 100 mikroliter med 0,25% bupivacaine, og 100 mikroliter på fire milligram per milliliter deksametason, subkutant på snittstedet. Vent minst fem minutter før du fortsetter.Blø det barberte hodet, med tre vekslende vattpinner av betadin, og 70% alkohol. Deretter gjør en midline hodebunn snitt med et kirurgisk blad eller saks. Strekker seg fra baksiden av skallen regionen, mellom ørene, til frontalområdet mellom øynene.Klipp den gjenværende huden for å eksponere skallen. Blø bindevevet som ligger mellom hodebunnen og den underliggende skallen med 3% hydrogenperoksid, og lokalisere hjerneområdet som skal avbildes med stereotaktiske koordinater. Bor en sirkulær åpning, omtrent fire millimeter inn i skallen, ved hjelp av en tannborkrone.Under boring fuktet du regelmessig skallen med steril saltvann og bomullspinner for å kjøle ned hjernen. Fjern beinrester, og myk skallebenet. Når du er ferdig, fjern forsiktig denne delen av skallen med spisse tang.Etter at skallen er fjernet, legg forsiktig et lite dekkglass, fuktet med saltvann i kraniotomien. Tørk av overflødig saltvann ved hjelp av en steril klut. Bruk en spiss applikator, påfør cyanoacrylat lim rundt vinduet, og la den festes til hjernen og skallen.Påfør primerlimet på resten av skallen, og herd det med herdingslys i 20 til 40 sekunder. Lag en brønn rundt vinduet med det endelige limet, og herd det med et herdelys i 20 til 40 sekunder. Lim en liten hodeplate på skallen, på den kontralaterale halvkule, kraniotomien, med primerlimet, og deretter med det endelige limet, herding både i 20 til 40 sekunder.Etter at musen våkner, injiserer du en subkutan dose buprenorfin SR som postoperativ analgesi, som vil være tilstrekkelig i 72 timer. Gjenopplive musen med ekstra saltmat for å lette en sunn gjenoppretting. Bildebehandling kan utføres så tidlig som to uker etter implantasjonsoperasjonen.Bruk skruer til å montere hodeplaten på to-foton mikroskop scenen, som skal opprettholdes ved 35 grader Celsius med en varmeplate. Injiser musen subkutant med 100 mikroliter blodkarfargestoff, for eksempel Rhodamine B.Rengjør forsiktig overflaten av kranialvinduet med en bomullspinne, dabbed i 70% etanol. Sett noen dråper vann eller saltvann på vinduet, og senk objektivet inn i løsningen.Sørg for at laseren er slått av som målet er å senke, og tegne et kurskart for å betegne de store blodkar landemerker, mens du ser gjennom okularet. Bruk denne tegningen til å identifisere de spesifikke områdene under to-foton-bildebehandling. Samle bilder av fluorescerende celler og fartøy ved hjelp av to-foton imaging.Se tekstmanuskriptet for bildeparametere, ta forsiktige notater med passende koordinater, for å sikre at de nøyaktige områdene kan besøkes på nytt for en etterfølgende bildebehandling. Tegn som flere synsfelt i denne første bildeøkten, På slutten av bildet, ta musen av scenen, la den våkne opp fra anestesi, og returnere den til sitt hjem bur. Bruk de oppnådde notatene og bildene til å re-imaging områdene under påfølgende økter.Denne protokollen ble brukt til å visualisere Microglial Dynamics In Vivo, i Taiwan YFP-H linje mus. Spesifikke dendritter, fungerte som stabile landemerker for fin kartlegging av hjerneregioner. Mens dendritter er en stabil, noen microglia flytte daglig.Enkelttransgene CX3CR1/GFP-mus, ble brukt til å følge microglia i opptil åtte uker. Injeksjoner av rhodamin B, ble brukt til å merke vaskulaturen, under hver bildebehandlingsøkt. Mens vaskulaturen forblir stabilt fast, er mikroglia dynamisk.CX3CR1/GFP-musene ble brukt til å følge microglia før og etter alvorlige anfall. Den vaskulære sengestrukturen ble opprettholdt, men det mikrogliale mobilnettet, og posisjonslandskapet var forbigående. Større endringer ble observert innen 24 til 48 timer etter anfall.Dobbelttransgene CX3CR1/GFP- og NG2DS-Red-mus ble brukt til å spore microglia og NG2 til positive celler In Vivo. Uten merking av vaskulaturen ble mikroglia samt kar tilknyttede parasitter, og oligodendrocyttforløperceller, eller OPCer, identifisert. Parasitter har langstrakte prosesser som følger langs den vaskulære veggen, og OPCer viser vanligvis større cellelegemer som bor i hjernens parenchyma, vekk fra vaskulaturen.Når rhodamine B ble brukt, kunne den lysere fluorescensen av parasitter skilles fra den svakere fluorescensen av luminal rhodamine, til tross for lignende eksitasjon under avbildning. Daglig avbildning viste at parasitter var stabilt plassert, mens OPCs og microglia var dynamiske. Det er viktig å foreta nøye observasjon av området som visualiseres, å tegne et representativt kart som er så nøyaktig som mulig, og betegne trinnene som er tatt for å nå de andre stedene med hensyn til utgangspunktet.I etterfølgende bildeøkter vil disse trinnene, de håndtegnede kartene og bildene som tidligere ble tatt, være avgjørende for å identifisere de samme stedene gjentatte ganger. Denne teknikken har gjort det mulig for forskere å belyse nevron-glial interaksjoner, nevro-immun interaksjoner, og nevro-celle dynamikk av lengre tidsperioder i både helse og patologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bakteriell Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging av<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infeksjoner i Mus

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo avbildning metode for å skille akutte og kroniske betennelser

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Bruke Fluorescent Proteiner å visualisere og kvantifisere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vekst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescens Optisk Imaging av Inflammatorisk MMP Aktivitet ved hjelp av en aktiverbar fluorescerende Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Langsiktig i Vivo sporing av inflammatoriske celle dynamikken i Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...