Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Agradecemos aos membros do laboratório Eyo por discutirem as ideias apresentadas neste manuscrito. Agradecemos ao Dr. Justin Rustenhoven do Laboratório Kipnis da Universidade da Virgínia pelo presente de ratos NG2DsRed 33. Este trabalho é apoiado por financiamento do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC do Instituto Nacional de Saúde para a U.B.E (K22 NS104392).

Todas as etapas estão de acordo com as diretrizes estabelecidas e aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia.
1. Preparação do rato para implantação de janelas cranianas
NOTA: Várias linhas de mouse transgênicas com etiquetas florescente são adequadas para imagens.
<ol><li>Use mouses CX3CR1GFP/+ 26 para visualizar microglia in vivo. Normalmente, são usados camundongos d...

O advento da imagem in vivo de dois fótons abriu oportunidades para explorar a infinidade de interações celulares e dinâmicas que ocorrem no cérebro saudável. Estudos iniciais se concentraram no uso da abordagem da craniotomia do crânio aberto para dendritos neuronais de imagem por imagem aguda e crônica37,38. Isso também pode ser usado para elucidar interações neuroimunes no cérebro. Este protocolo descreve um método para a imagem confiável de cél...

O sistema nervoso central (SNC) é regido por uma complexa interação entre vários tipos de células residentes, incluindo neurônios, glia e células associadas a vasos. Tradicionalmente, as células neurais eram estudadas em tecidos cerebrais isolados, co-cultivados1,,2,,3,,4,5 (in vitro) ou tecido cerebral exsequipado (ex vivo)6,,7,,8,,9,,10 contextos. No entanto, é necessário entender melhor o comportamento das células neurais e as interações no ambiente nativo do cérebro intacto in vivo. Neste protocolo, descrevemos um método para mapear regiões in vivo de interesse e reimagem precisamente essas regiões em futuras sessões de imagem para acompanhar as interações complexas entre os vários tipos de células CNS ao longo de longos períodos de tempo.
O desenvolvimento de abordagens de imagem in vivo proporcionou ganhos significativos para a compreensão adequada da função neural11,,12,,13,14,,15. Especificamente, essas abordagens oferecem várias vantagens em relação às abordagens in vitro e ex vivo tradicionais. Primeiro, os sistemas de imagem in vivo possuem componentes fisiologicamente relevantes de células e tecidos, como a vasculatura com o repertório completo das interações celulares para proporcionar uma compreensão completa da fisiologia da rede neural. Em segundo lugar, achados recentes sugerem que, quando removidas de seu ambiente nativo, certas células neurais (como a microglia) perdem características importantes de sua identidade e,portanto,fisiologia16,17 que podem ser preservadas no cenário in vivo. Em terceiro lugar, os sistemas de imagem in vivo oferecem a oportunidade de investigações longitudinais estáveis de semanas a meses para estudar as interações celulares do CNS. Finalmente, dadas as evidências crescentes de contribuições do sistema imunológico periférico18,19 e do microbioma20,21 na fisiologia do CNS, os sistemas in vivo fornecem uma plataforma para interrogar tais contribuições e efeitos sobre as células CNS. Assim, abordagens que empregam imagens longitudinais in vivo para estudar fisiologia neuroi imune e interações em estados saudáveis, feridos e doentes são uma grande adição complementar às abordagens tradicionais.
Neste protocolo, descrevemos uma abordagem confiável para a imagem de diferentes tipos de células no cérebro, incluindo microglia, neurônios e células NG2+ como exemplos. Duas abordagens para visualizar células neurais in vivo foram desenvolvidas: a aproximação do crânio diluído e o crânio aberto com uma aproximação da janela craniana. Embora abordagens finas do crânio estejam em uso e sejam preferidas porque superam algumas das desvantagens da abordagem do crânio aberto, como ativação celular gliana, dinâmica da coluna vertebral mais alta que fisiológica e o uso de agentes anti-inflamatórios22,,23,,24,,25, abordagens finas do crânio também mostram algumas desvantagens críticas. Em primeiro lugar, o procedimento de afinamento é um procedimento muito delicado que muitos pesquisadores acham difícil de aperfeiçoar especialmente quando o diluir é necessário. Este é o caso porque muitas vezes é difícil para os experimentadores verificar que eles diminuíram o crânio a uma profundidade de ~20 μm. Em segundo lugar, para comparações adequadas entre camundongos, o afinamento precisaria ser idêntico e uma variedade de sucesso de afinamento entre sessões de imagem ou camundongos poderia complicar a visualização de estruturas neurais. Em terceiro lugar, quando empregados para imagens longitudinais, animais com crânios finos só podem ser usados para um número limitado de sessões quando o diluir do crânio é empregado. Por diante, uma vez que parte do tecido ósseo ainda permanece, a clareza em profundidade da imagem pode ser comprometida a partir da abordagem do crânio diluído permitindo uma grande visualização de regiões mais superficiais, mas não tanto com regiões mais profundas. À luz disso, estruturas cerebrais mais profundas, como o hipocampo, não podem ser imagens com sucesso com a aproximação do crânio diluído. Essas considerações levantam a necessidade de abordagens alternativas e complementares que possam superar essas preocupações.
Alternativa à abordagem do crânio diluído, a abordagem de implantação da janela aberta do crânio usa um procedimento no qual o crânio é substituído por uma mancha de vidro opticamente clara. Isso permite um número quase ilimitado de sessões de imagem. Além disso, dada a substituição do crânio pelo deslizamento de tampa de vidro, este método permite uma janela de visualização clara de células cerebrais fluorescentes marcadas por longos períodos de horas a meses e, portanto, pode ser empregado para estudar a atividade celular e interações relevantes para fisiologia, envelhecimento e patologia.
No geral, detalhamos etapas que podem ser seguidas para fazer o implante de janelas cranianas crônicas através de uma craniotomia estereotaxa que permite imagens in vivo de regiões cerebrais de interesse. Também descrevemos como a vasculatura cerebral grosseiramente estável ou os dendritos fluorescentes rotulados poderiam ser usados para gerar um mapa grosseiro ou fino, respectivamente, das regiões cerebrais de interesse. Esta abordagem pode então ser usada para imagens repetidas ao longo de várias sessões. A importância dessa técnica, portanto, reside em sua capacidade de imaginar as mudanças ou estase a longo prazo em elementos cerebrais, incluindo o arranjo, morfologia e interações dos diferentes tipos celulares.

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	<tbody>
		<tr>
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			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0726</td>
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		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td>910860-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
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		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td>1338333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td>66040094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

O sistema nervoso central (SNC) é regulado por uma complexa interação de células neuronais, gliais, estrômicas e vasculares que facilitam sua função adequada. Embora estudar essas células isoladamente in vitro ou juntos ex vivo fornece informações fisiológicas úteis; características salientes da fisiologia celular neural farão falta em tais contextos. Portanto, há a necessidade de estudar células neurais em seu ambiente in vivo nativo. O protocolo aqui detalhado descreve a imagem repetitiva in vivo de duas fótons de células neurais no córtex roedor como uma ferramenta para visualizar e estudar células específicas durante longos períodos de tempo de horas a meses. Descrevemos em detalhes o uso da vasculatura cerebral grosseiramente estável como um mapa grosseiro ou dendritos fluorescentes rotulados como um bom mapa de regiões cerebrais selecionadas de interesse. Usando esses mapas como uma chave visual, mostramos como as células neurais podem ser precisamente realocadas para imagens in vivo repetitivas subsequentes. Utilizando exemplos de imagens in vivo de microglia fluorescentes, neurônios e células NG2+ , este protocolo demonstra a capacidade desta técnica de permitir a visualização repetitiva da dinâmica celular na mesma localização cerebral por longos períodos de tempo, que podem ajudar ainda mais na compreensão das respostas estruturais e funcionais dessas células na fisiologia normal ou seguindo insultos patológicos. Quando necessário, essa abordagem pode ser acoplada à imagem funcional de células neurais, por exemplo, com imagem de cálcio. Essa abordagem é especialmente uma técnica poderosa para visualizar a interação física entre diferentes tipos celulares do CNS in vivo quando modelos genéticos de camundongos ou corantes específicos com marcas fluorescentes distintas para rotular as células de interesse estão disponíveis.

Para visualizar a dinâmica microglial in vivo, foram utilizadoscamundongos CX3CR1GFP/+duplo transgênicos. A linha Thy1-YFP H é usada em oposição à linha Thy1-GFP M para evitar a sobreposição de flores de microglia (GFP) e neurônios (YFP). Abordagens alternativas podem usar uma linha de repórteres na qual a microglia é rotulada com, por exemplo, tdTomato e, em seguida, a linha M Thy1-GFP pode ser usada. Uma desvantagem da linha H é que o YFP rotula muitos neurônios e o rótulo aumenta co...

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Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Este protocolo descreve uma técnica crônica de implantação de janelas cranianas que pode ser usada para imagens longitudinais de estruturas neuro-glio-vasculares, interações e função em condições saudáveis e doentes. Serve como uma alternativa complementar à abordagem de imagem transcranária que, embora muitas vezes preferida, possui algumas limitações críticas.

Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Este protocolo demonstra como a microscopia De Dois Fótons in Vivo pode ser usada para fazer visualização repetitiva da dinâmica celular, na mesma localização cerebral por longos períodos de tempo. A vantagem dessa técnica é que, torna possível a imagem das mudanças de longo prazo nos elementos celulares do cérebro, incluindo o arranjo, morfologia e interações físicas entre diferentes tipos celulares do SNC. Essa técnica pode ser especialmente útil na obtenção de interações célula-células, dinâmica celular e alterações morfológicas durante a plasticidade cerebral e neurodegeneração.Comece preparando um adulto juvenil ou jovem, de quatro a 10 semanas de idade, um rato heterozigoto CX3CR1 GFP, que pesa de 17 a 25 gramas, para uma implantação de janela craniana. Depois de anestesiar o camundongo, use um aparador de cabelo para raspar o cabelo na cabeça, entre as orelhas, aproximadamente, do nível dos olhos, até a região superior da região do pescoço. Mova o rato para a estação de cirurgia estereotática, cone de nariz e estabilize a cabeça usando barras de ouvido.Mantenha o mouse na almofada de aquecimento, durante todo o procedimento. Lubrifique ambos os olhos com pomada de óleo, depois injete 100 microlitadores de 0,25% bupivacaína, e 100 microlitres de quatro miligramas por mililitro dexametasona, subcutânea no local da incisão. Espere pelo menos cinco minutos antes de prosseguir.Sangre a cabeça raspada, com três cotonetes alternados de betadina, e 70% de álcool. Em seguida, faça uma incisão de couro cabeludo médio com uma lâmina cirúrgica ou uma tesoura. Estendendo-se da parte de trás da região do crânio, entre as orelhas, até a área frontal entre os olhos.Corte a pele restante para expor o crânio. Sangre o tecido conjuntivo localizado entre o couro cabeludo e o crânio subjacente com peróxido de hidrogênio de 3%, e localize a área cerebral a ser imagens com coordenadas estereotáticas. Perfurar uma abertura circular, aproximadamente quatro milímetros no crânio, usando uma broca dentária.Durante a perfuração, umedeceva regularmente o crânio com soro fisiológico e cotonetes de algodão para resfriar o cérebro. Limpe os detritos ósseos e suavize o osso do crânio. Quando terminar, remova cuidadosamente esta parte do crânio com fórceps pontiagudas.Depois que o crânio for removido, coloque cuidadosamente um pequeno vidro de cobertura, umedecido com soro fisiológico na craniotomia. Seque o excesso de soro fisiológico usando uma limpeza estéril. Usando um aplicador pontiagudo, aplique cola cianoacrilato ao redor da janela, e permita que ele se conecte ao cérebro e ao crânio.Aplique a cola do primer no resto do crânio, e cure-a com uma luz de cura por 20 a 40 segundos. Crie um poço ao redor da janela com a cola final, e cure-a com uma luz de cura por 20 a 40 segundos. Cole uma pequena placa de cabeça no crânio, no hemisfério contralateral, na craniotomia, com a cola do primer, e depois com a cola final, curando ambos por 20 a 40 segundos.Depois que o rato acordar, injete uma dose subcutânea de buprenorfina SR como analgesia pós-operatória, que será suficiente por 72 horas. Reviva o rato com alimentos salgados extras para facilitar uma recuperação saudável. A imagem pode ser realizada duas semanas após a cirurgia de implantação.Use parafusos para montar a placa da cabeça no estágio do microscópio de dois fótons, que deve ser mantido a 35 graus Celsius com uma placa de aquecimento. Injete subcutâneamente o rato com 100 microlitadores de corante de vasos sanguíneos, como Rhodamine B.Limpe suavemente a superfície da janela craniana com um cotonete, com 70% de etanol. Coloque algumas gotas de água ou soro fisiológico na janela, e baixe a lente objetiva na solução.Certifique-se de que o laser está desligado à medida que o objetivo está diminuindo, e desenhe um mapa de curso para denotar os principais pontos turísticos dos vasos sanguíneos, enquanto olha através da ocular. Use este desenho para identificar as regiões específicas durante a imagem de dois fótons. Colete imagens de células fluorescentes e vasos usando imagens de dois fótons.Consulte o manuscrito do texto para parâmetros de imagem, tome notas cuidadosas com coordenadas apropriadas, para garantir que as regiões precisas possam ser revisitadas para uma imagem subsequente. Desenhe como vários campos de visão nesta sessão inicial de imagem, No final da imagem, tire o rato do palco, permita que ele acorde da anestesia e devolva-o para sua gaiola doméstica. Use as notas e imagens obtidas para re-imagens das áreas durante as sessões subsequentes.Este protocolo foi usado para visualizar a Microglial Dynamics In Vivo, em ratos da linha Taiwan YFP-H. Dendritos específicos, serviram como marcos estáveis para o mapeamento fino das regiões cerebrais. Enquanto os dendritos são estáveis, algumas microglias se movem diariamente.Os camundongos monogênicos CX3CR1/GFP foram usados para seguir microglia por até oito semanas. Injeções de rhodamina B, foram utilizadas para rotular a vasculatura, durante cada sessão de imagem. Enquanto a vasculatura permanece fixa, a microglia é dinâmica.Os camundongos CX3CR1/GFP foram usados para seguir microglia antes e depois de convulsões graves. A estrutura do leito vascular foi mantida, mas a rede celular microglial, e a paisagem de posição eram transitórias. Maiores alterações foram observadas dentro de 24 a 48 horas de convulsões.Camundongos CX3CR1/GFP e NG2DS-Red duplos foram usados para rastrear microglia, e NG2 para células positivas In Vivo. Sem rotular a vasculatura, microglia, bem como parasitas associados a vasos, e células precursoras oligodendrocytos, ou OPCs. Os parasitas têm processos alongados que seguem ao longo da parede vascular, e os OPCs normalmente mostram corpos celulares maiores que residem no parenchyma cerebral, longe da vasculatura.Quando a rhodamina B foi usada, a fluorescência mais brilhante dos parasitas poderia ser distinguida da fluorescência mais fraca da rhodamina luminal, apesar da excitação semelhante durante a imagem. As imagens diárias mostraram que os parasitas estavam posicionados de forma estável, enquanto os OPCs e as microglias eram dinâmicos. É importante fazer uma observação cuidadosa da área que está sendo visualizada, desenhar um mapa representativo o mais preciso possível, e denotar as medidas tomadas para chegar aos demais locais em relação ao ponto de partida.Em sessões de imagem subsequentes, essas etapas, os mapas desenhados à mão e as imagens tiradas anteriormente, serão cruciais na identificação dos mesmos locais repetidamente. Essa técnica permitiu aos pesquisadores elucidar interações neurônio-glial, interações neuroi imunes e dinâmica neurocelular de longos períodos de tempo em saúde e patologia.

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