Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Мы благодарим сотрудников лаборатории Eyo за обсуждение идей, представленных в этой рукописи. Мы благодарим д-ра Джастина Rustenhoven из лаборатории Кипнис в Университете Вирджинии за подарок NG2DsRed мышей33. Эта работа поддерживается за счет финансирования из Национального института неврологических расстройств и инсульта Национального института здравоохранения в U.B.E (K22 NS104392).

Все шаги в соответствии с руководящими принципами, установленными и утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Вирджинии.
1. Подготовка мыши для имплантации окна черепа
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные трансгенные ?...

Появление in vivo двух-фотон изображений открыл возможности для изучения множества клеточных взаимодействий и динамики, которые происходят в здоровом мозге. Первоначальные исследования сосредоточены на использовании открытого черепа краниотомии подход к изображению нейрональных денд...

Центральная нервная система (ЦНС) регулируется сложным взаимодействием взаимодействий между различными типами клеток-резидентов, включая нейроны, глию и клетки, связанные с сосудами. Традиционно, нервные клетки были изучены в изолированных, совместно культивируется1,2,3,4,,5 (in vitro) или вырезанной ткани мозга (ex vivo)6,7,8,9,10 контекстов.4 Тем не менее, необходимо дальнейшее понимание поведения нейронных клеток и взаимодействий в родной среде нетронутыми мозга in vivo. В этом протоколе мы описываем метод картирования регионов, представляющих интерес in vivo, и точно переохотвердем эти регионы в будущих сеансах визуализации для отслеживания сложных взаимодействий между различными типами клеток ЦНС в течение длительных периодов времени.
Развитие подходов к визуализации in vivo дало значительные выгоды для правильного понимания нервной функции11,,12,,13,,14,,15. В частности, эти подходы дают ряд преимуществ по сравнению с традиционными подходами in vitro и ex vivo. Во-первых, в vivo системы визуализации имеют физиологически соответствующие компоненты клеток и тканей, такие как сосуды с полным репертуаром клеточных взаимодействий, чтобы обеспечить полное понимание физиологии нейронной сети. Во-вторых, последние результаты показывают, что при удалении из их родной среды, некоторые нервные клетки (например, микроглии) теряют важные особенности их идентичности и, таким образом, физиологии16,17, которые могут быть сохранены в in vivo настройки. В-третьих, in vivo системы визуализации предоставляют возможность для стабильных продольных исследований от нескольких недель до нескольких месяцев для изучения ЦНС клеточного взаимодействия. Наконец, учитывая растущие данные о вкладах от периферической иммунной системы18,19 и микробиома20,21 в физиологии ЦНС, in vivo системы обеспечивают платформу для допроса таких вкладов и воздействия на клетки ЦНС. Таким образом, подходы, которые используют продольные in vivo изображения для изучения нейро-иммунной физиологии и взаимодействия в здоровых, раненых и больных состояний являются большим дополнением к традиционным подходам.
В этом протоколе мы описываем надежный подход к изображению различных типов клеток в головном мозге, включая микроглии, нейроны и клетки NG2в качестве примеров. Разработаны два подхода к визуализации нервных клеток in vivo: истонченный подход черепа и открытый череп с подходом к черепному окну. Хотя разбавленный череп подходы используются и предпочтительнее, потому что они преодолевают некоторые из недостатков открытого подхода черепа, таких как активация глиальных клеток, выше, чем физиологическая динамика позвоночника и использование противовоспалительных агентов22,23,24,,25, разбавленный череп подходы также показывают несколько критических недостатков. Во-первых, процедура истончения является очень деликатной процедурой, которую многие исследователи трудно усовершенствовать, особенно когда необходимо повторное утончение. Это так, потому что часто трудно для экспериментаторов, чтобы убедиться, что они истончили череп до глубины 20 мкм. Во-вторых, для адекватных сравнений между мышами, истончение должно быть идентичным и различные истончение успеха между изображений сессий или мышей может осложнить визуализацию нервных структур. В-третьих, при использовании для продольной визуализации, животные с истонченными черепами могут быть использованы только для ограниченного числа сеансов при повторном разжижении черепа. В-четвертых, так как некоторые из костной ткани все еще остается, ясность в глубине изображения может быть скомпрометирована от истонченного подхода черепа позволяет большой визуализации более поверхностным, но не так много с более глубокими регионами. В свете этого, более глубокие структуры мозга, такие как гиппокамп, не могут быть успешно изображены с истонченным подходом черепа. Эти соображения высовы воспитывают необходимость в альтернативных и взаимодополняющих подходах, которые могли бы преодолеть эти озабоченности.
Альтернатива истонченным подходом черепа, открытый подход к имплантации окна черепа использует процедуру, в которой череп заменяется оптически ясным стеклом. Это позволяет почти неограниченное количество сеансов визуализации. Кроме того, при замене черепа на стекло крышки, этот метод позволяет четкое окно просмотра флуоресцентно помечены клетки мозга в течение длительных периодов от нескольких часов до месяцев и, следовательно, могут быть использованы для изучения активности клеток и взаимодействий, которые имеют отношение к физиологии, старения и патологии.
В целом, мы подробно шаги, которые могут следовать, чтобы сделать имплантат хронических черепных окон через стереотаксисную краниотомию, что позволяет in vivo изображения областей мозга, представляющих интерес. Мы также описываем, как чрезвычайно стабильная сосуды мозга или флуоресцентно помеченные дендриты могут быть использованы для создания грубой или тонкой карты, соответственно, областей мозга, представляющих интерес. Этот подход может быть использован для повторного изображения в течение нескольких сессий. Важность этого метода, таким образом, заключается в его способности образ долгосрочных изменений или застой в элементах мозга, включая расположение, морфология, и взаимодействия различных клеточных типов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coverglass (3mm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&#38;qid=1583856837&#38;s=pet-supplies&#38;sr=8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demi Ultra LED Curing Light System</td>
			<td>Dental Health Products, Inc</td>
			<td>910860-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Osada: www.osadausa.edu</td>
			<td>EXL-M40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill Bit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Henry Schien</td>
			<td>1338333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBond Total Etch (Primer glue)</td>
			<td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td>
			<td>66040094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>81-88-9 (R6626)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetris Evoflow glue (Final glue)</td>
			<td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td>
			<td>#595956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Brav Mini+</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0&#38;hvadid=167141013968&#38;hvpos=&#38;hvnetw=g&#38;hvrand=12368793083893626704&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvqmt=&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint=&#38;hvlocphy=9008337&#38;hvtargid=pla-332197544154&#38;psc=1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

Центральная нервная система (ЦНС) регулируется сложным взаимодействием нейронных, глиальных, стромальных и сосудистых клеток, которые облегчают его надлежащую функцию. Хотя изучение этих клеток в изоляции in vitro или вместе ex vivo предоставляет полезную физиологическую информацию; в таких контекстах будут упущены основные особенности физиологии нервных клеток. Поэтому необходимо изучать нервные клетки в их родной среде in vivo. Протокол подробно здесь описывает повторяющиеся vivo двух-фотон изображения нервных клеток в коре грызунов в качестве инструмента для визуализации и изучения конкретных клеток в течение длительных периодов времени от часов до нескольких месяцев. Мы подробно описываем использование чрезвычайно стабильного сосуда мозга как грубой карты или флуоресцентно помеченных дендритов как тонкая карта избранных областей мозга, представляющих интерес. Используя эти карты в качестве визуального ключа, мы показываем, как нервные клетки могут быть точно перемещены для последующего повторяющихся изображений in vivo. Используя примеры in vivo изображений флуоресцентно-маркированных микроглии, нейронов и NG2- клеток, этот протокол демонстрирует способность этой техники, чтобы повторяющиеся визуализации клеточной динамики в том же месте мозга в течение длительных периодов времени, что может еще больше помочь в понимании структурных и функциональных реакций этих клеток в нормальной физиологии или после патологических оскорблений. При необходимости такой подход может быть связан с функциональной визуализацией нервных клеток, например, с визуализацией кальция. Этот подход является особенно мощным методом визуализации физического взаимодействия между различными типами клеток ЦНС in vivo, когда генетические модели мыши или конкретные красители с различными флуоресцентными тегами для обозначения клеток, представляющих интерес, доступны.

Для визуализации микроглиальной динамики in vivo использовались двойные трансгенные CX3CR1GFP/:Thy1YFP мышей. Линия Thy1-YFP H используется в отличие от линии Thy1-GFP M, чтобы избежать перекрытия цветодержания микроглии (GFP) и нейронов (YFP). Альтернативные подходы могут использовать линию репо...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Этот протокол описывает хронический метод имплантации окна черепа, которые могут быть использованы для продольной визуализации нейроглио-сосудистых структур, взаимодействий и функции как в здоровых, так и в больных условиях. Он служит дополнительной альтернативой транскраниальному подходу к визуализации, который, хотя и часто предпочтительнее, обладает некоторыми критическими ограничениями.

Точное картирование мозга для выполнения повторяющихся In Vivo Изображения нейро-иммунной динамики у мышей

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Этот протокол демонстрирует, как двухкоротная микроскопия In Vivo может быть использована для повторной визуализации клеточной динамики в одном и том же месте мозга в течение длительных периодов времени. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет изображение долгосрочных изменений в клеточных элементах мозга, в том числе расположение, морфология, и физическое взаимодействие между различными типа клеток ЦНС. Этот метод может быть особенно полезен в получении клеточно-клеточных взаимодействий, клеточной динамики и морфологических изменений во время пластичности мозга, и нейродегенерации.Начните с подготовки несовершеннолетних или молодых взрослых, от четырех до 10 недель, CX3CR1 GFP heterozygote мыши, которая весит от 17 до 25 граммов, для имплантации черепного окна. После анестезии мыши используйте триммер для бритья волос на голове, между ушами, примерно, от уровня глаз до верхней части области шеи. Перемести мышь на стереотаксическую станцию хирургии, конус носа, и стабилизировать его голову с помощью ушных ушных шей.Поддерживайте мышь на грелке, на протяжении всей процедуры. Смазать оба глаза масляной мази, затем ввести 100 микролитров 0,25%bupivacaine, и 100 микролитров четыре миллиграмма на миллилитр дексаметазон, подкожно на месте разреза. Подождите, по крайней мере пять минут, прежде чем продолжить.Кровотечение бритая голова, с тремя чередующихся тампонов бетадина, и 70% алкоголя. Затем сделайте разрез средней линии головы хирургическим лезвием или ножницами. Простирается от задней части области черепа, между ушами, к лобной области между глазами.Вырежьте оставшуюся кожу, чтобы разоблачить череп. Кровотечение соединительной ткани, расположенной между кожей головы и лежащим в основе черепа с 3%перекисью водорода, и локализовать область мозга, которая будет изображена с стереотаксическими координатами. Просверлите круговое отверстие, примерно четыре миллиметра в череп, используя зубную дрель бит.Во время бурения регулярно смачив череп стерильным солевым раствором и ватными тампонами для охлаждения мозга. Очисти от костного мусора и смягчи кость черепа. После завершения, тщательно удалить эту часть черепа с остроконечными миппами.После удаления черепа аккуратно поместите небольшое стекло крышки, увлажнено солевым раствором в краниотомии. Высушите лишний солевой раствор с помощью стерильной салфетки. Используя остроконечный аппликатор, нанесите клей цианоакрилата вокруг окна и дайте ему прикрепиться к мозгу и черепу.Нанесите грунтовой клей на остальную часть черепа, и вылечить его с лечебным светом в течение 20 до 40 секунд. Создайте колодец вокруг окна с окончательным клеем, и вылечить его с лечебным светом в течение 20 до 40 секунд. Клей небольшой головной пластины на череп, на контралатеральное полушарие, краниотомия, с грунтовки клей, а затем с окончательным клеем, лечение как в течение 20 до 40 секунд.После того, как мышь проснется, ввимите одну подкожная доза бупренорфина SR в качестве послеоперационной анальгезии, которой будет достаточно в течение 72 часов. Оживите мышь с дополнительной соленой пищей, чтобы облегчить здоровое восстановление. Визуализация может быть выполнена уже через две недели после операции по имплантации.Используйте винты, чтобы смонтировать головную пластину на стадии двух фотон микроскопа, который должен поддерживаться при 35 градусах по Цельсию с нагревательной пластиной. Ввините мышь подкожно с 100 микролитров красителя кровеносных сосудов, таких как Родамин B.Gently очистить поверхность черепного окна с ватным тампоном, dabbed в 70% этанола. Положите несколько капель воды или солевого раствора на окно, и опустите объектив в раствор.Убедитесь, что лазер выключен, как цель снижается, и нарисовать карту курса для обозначения основных ориентиров кровеносных сосудов, глядя через окуляр. Используйте этот рисунок для определения конкретных областей во время двух фотонной визуализации. Сбор изображений флуоресцентных клеток и сосудов с помощью двух фотонной визуализации.Смотрите текстовую рукопись для параметров изображений, сделайте тщательные заметки с соответствующими координатами, чтобы убедиться, что точные регионы могут быть пересмотрены для последующего изображения. Нарисуйте, как несколько полей зрения в этой первоначальной сессии изображения, В конце изображения, принять мышь со сцены, дайте ему проснуться от анестезии, и вернуть его в свою домашнюю клетку. Используйте полученные заметки и изображения для повторного изображения областей во время последующих сеансов.Этот протокол был использован для визуализации microglial Dynamics In Vivo, на Тайване YFP-H линии мышей. Специфические дендриты, служили стабильными ориентирами для тонкого картирования областей мозга. В то время как дендриты стабильны, некоторые микроглии двигаться ежедневно.Одиночные трансгенные мыши CX3CR1/GFP, были использованы для того чтобы последовать за микроглией на up to 8 неделей. Инъекции родамина B, были использованы для обозначения сосудов, во время каждого сеанса изображения. В то время как сосуд остается стабильно фиксированной, микроглии являются динамическими.CX3CR1/GFP мышей, были использованы для подражания микроглии до и после тяжелых припадков. Структура сосудистой кровати была сохранена, но микроглиальная клеточная сеть, и положение пейзаж был преходящим. В течение 24-48 часов после изъятий наблюдались большие изменения.Двойные трансгенные мыши CX3CR1/GFP и NG2DS-Red использовались для отслеживания микроглии, а NG2 - для положительных клеток In Vivo. Без маркировки сосудов были выявлены микроглии, а также связанные с сосудами паразиты, а также клетки-предшественники олигодендроцитов, или ОПК. Паразиты имеют удлиненные процессы, которые следуют вдоль сосудистой стенки, и OPCs обычно показывают большие тела клеток, которые находятся в паренхиме мозга, вдали от сосудов.При использовании родамина В ярче флуоресценция паразитов можно было отличить от более слабой флуоресценции светитального родамина, несмотря на подобное возбуждение во время визуализации. Ежедневная визуализация показала, что паразиты были стабилико расположены, в то время как OPCs и микроглии были динамичными. Важно внимательно следить за визуализировать область, нарисовать репрезентативную карту, которая была бы максимально точной, и обозначить шаги, предпринятые для достижения других мест в отношении отправной точки.В последующих сеансах визуализации эти шаги, нарисованные вручную карты и изображения, сделанные ранее, будут иметь решающее значение для повторного определения одного и того же местоположения. Этот метод позволил исследователям прояснить нейронно-глиальные взаимодействия, нейроиммуные взаимодействия и нейроклеточную динамику длительных периодов времени как в здоровье, так и в патологии.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Неинвазивная Визуализация лейкоцитов самонаведения и миграции В естественных условиях</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Ортотопическая Модель серозного рака яичников у иммунокомпетентных мышей для В естественных условиях Опухоль изображений и мониторинг иммунного ответа опухоли

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Бактериальные изображений<em&gt; В Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Комплексное 4D визуализация<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Инфекции у мышей

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Метод В естественных изображений отличить острого и хронического воспаления

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной<em&gt; Хламидиоз</em&gt; Вакуоли Динамика роста в живых клетках

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Неинвазивная<em&gt; In Vivo</em&gt; Флуоресцентная оптическая визуализация воспалительной активности ММП с использованием активируемого флуоресцентного средства визуализации

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Долгосрочный в Vivo отслеживания динамики воспалительных клеток внутри куколки дрозофилы

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...