Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
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Agradecemos a los miembros del laboratorio de Eyo por discutir las ideas presentadas en este manuscrito. Agradecemos al Dr. Justin Rustenhoven del Laboratorio Kipnis de la Universidad de Virginia por el regalo de ratones NG2DsRed 33. Este trabajo es apoyado por la financiación del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares del Instituto Nacional de Salud a la U.B.E (K22 NS104392).

Todos los pasos están de acuerdo con las pautas establecidas y aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal de la Universidad de Virginia.
1. Preparación del ratón para la implantación de ventanas craneales
NOTA: Varias líneas transgénicas del ratón con etiquetas florescentes son adecuadas para la toma de imágenes.
<ol><li>Utilice ratones CX3CR1GFP/+ 26 para visualizar la microglia in vivo. Por lo genera...

El advenimiento de las imágenes in vivo de dos fotones ha abierto oportunidades para explorar la plétora de interacciones celulares y dinámicas que ocurren en el cerebro sano. Los estudios iniciales se centraron en el uso del enfoque de craneotomía del cráneo abierto para la imagen de las dendritas neuronales por imágenes agudas y crónicas37,,38. Esto también se puede utilizar para dilucidar interacciones neuroinmunes en el cerebro. Este protocolo describ...

El sistema nervioso central (SNC) se rige por una compleja interacción de interacciones entre varios tipos de células residentes, incluyendo neuronas, glia y células asociadas a vasos. Tradicionalmente, las células neurales se estudiaban en contextos aislados, co-cultivados1,,2,3,4,5 (in vitro) o de tejido cerebral extirpado (ex vivo)6,7,,8,9,10. Sin embargo, es necesario comprender mejor el comportamiento de las células neuronales y las interacciones en el entorno nativo del cerebro in vivo in vivo. En este protocolo, describimos un método para asignar regiones in vivo de interés y volver a escuchar con precisión esas regiones en futuras sesiones de imágenes para realizar un seguimiento de las interacciones complejas entre los distintos tipos de células CNS durante largos períodos de tiempo.
El desarrollo de enfoques de imagen in vivo ha proporcionado ganancias significativas para la comprensión adecuada de la función neuronal11,12,13,14,15. Específicamente, estos enfoques proporcionan varias ventajas sobre los enfoques tradicionales in vitro y ex vivo. En primer lugar, los sistemas de imágenes in vivo tienen componentes celulares y tisulares fisiológicamente relevantes, como la vasculatura, con todo el repertorio de interacciones celulares para proporcionar una comprensión completa de la fisiología de la red neuronal. En segundo lugar, los hallazgos recientes sugieren que cuando se eliminan de su entorno nativo, ciertas células neuronales (como la microglia) pierden características importantes de su identidad y, por lotanto,la fisiología16,17 que se pueden conservar en el entorno in vivo. En tercer lugar, los sistemas de imágenes in vivo proporcionan la oportunidad de realizar investigaciones longitudinales estables de semanas a meses para estudiar las interacciones celulares del SNC. Por último, dada la creciente evidencia de las contribuciones del sistema inmunitario periférico18,19 y el microbioma20,21 en la fisiología del SNC, los sistemas in vivo proporcionan una plataforma para interrogar tales contribuciones y efectos en las células del SNC. Por lo tanto, los enfoques que emplean imágenes in vivo longitudinales para estudiar la fisiología neuroinmune y las interacciones en estados sanos, lesionados y enfermos son una gran adición complementaria a los enfoques tradicionales.
En este protocolo, describimos un enfoque confiable para la imagen de diferentes tipos de células en el cerebro, incluyendo microglia, neuronas y NG2+ células como ejemplos. Se han desarrollado dos enfoques para visualizar las células neuronales in vivo: el enfoque del cráneo adelgazado y el cráneo abierto con un enfoque craneal de la ventana. Aunque los enfoques del cráneo adelgazado están en uso y son preferidos porque superan algunas de las desventajas del enfoque del cráneo abierto, como la activación de células gliales, la dinámica de la columna vertebral más alta que fisiológica y el uso de agentes antiinflamatorios22,,23,,24,,25,los enfoques del cráneo adelgazado también muestran algunos inconvenientes críticos. En primer lugar, el procedimiento de adelgazamiento es un procedimiento muy delicado que muchos investigadores encuentran difícil de perfeccionar, especialmente cuando es necesario volver a adelgazar. Este es el caso porque a menudo es difícil para los experimentadores determinar que han adelgazado el cráneo a una profundidad de 20 m. En segundo lugar, para las comparaciones adecuadas entre ratones, el adelgazamiento tendría que ser idéntico y una variedad de éxito de adelgazamiento entre sesiones de diagnóstico por imágenes o ratones podría complicar la visualización de las estructuras neuronales. En tercer lugar, cuando se emplean para imágenes longitudinales, los animales con cráneos adelgazados sólo se pueden utilizar para un número limitado de sesiones cuando se emplea el re-adelgazamiento del cráneo. En adelante, dado que todavía queda parte del tejido óseo, la claridad en profundidad de las imágenes podría verse comprometida a partir del enfoque del cráneo adelgazado, lo que permite una gran visualización de las regiones más superficiales pero no tan profundas. A la luz de esto, las estructuras cerebrales más profundas, como el hipocampo, no se pueden imaginar con éxito con el enfoque del cráneo adelgazado. Estas consideraciones plantean la necesidad de enfoques alternativos y complementarios que puedan superar estas preocupaciones.
Alternativamente al enfoque del cráneo adelgazado, el enfoque de implantación de la ventana del cráneo abierto utiliza un procedimiento en el que el cráneo se reemplaza con un cubreobjetos de vidrio ópticamente transparente. Esto permite un número casi ilimitado de sesiones de imágenes. Además, dado el reemplazo del cráneo por el cubreobjetos de vidrio, este método permite una ventana de visualización clara de células cerebrales etiquetadas fluorescentemente durante largos períodos de tiempos de horas a meses y, por lo tanto, se puede emplear para estudiar la actividad celular y las interacciones que son relevantes para la fisiología, el envejecimiento y la patología.
En general, detallamos los pasos que se pueden seguir para implantar ventanas craneales crónicas a través de una craneotomía estereotaxica que permite la toma de imágenes in vivo de las regiones cerebrales de interés. También describimos cómo la vasculatura cerebral muy estable o las dendritas etiquetadas fluorescentemente podrían utilizarse para generar un mapa grueso o fino, respectivamente de las regiones cerebrales de interés. Este enfoque se puede utilizar para imágenes repetidas durante varias sesiones. La importancia de esta técnica, por lo tanto, radica en su capacidad para imaginar los cambios a largo plazo o éxtasis en los elementos cerebrales, incluyendo la disposición, morfología, y las interacciones de los diferentes tipos celulares.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Coverglass (3mm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&#38;qid=1583856837&#38;s=pet-supplies&#38;sr=8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demi Ultra LED Curing Light System</td>
			<td>Dental Health Products, Inc</td>
			<td>910860-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Osada: www.osadausa.edu</td>
			<td>EXL-M40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill Bit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Henry Schien</td>
			<td>1338333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBond Total Etch (Primer glue)</td>
			<td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td>
			<td>66040094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>81-88-9 (R6626)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetris Evoflow glue (Final glue)</td>
			<td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td>
			<td>#595956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Brav Mini+</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0&#38;hvadid=167141013968&#38;hvpos=&#38;hvnetw=g&#38;hvrand=12368793083893626704&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvqmt=&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint=&#38;hvlocphy=9008337&#38;hvtargid=pla-332197544154&#38;psc=1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

El sistema nervioso central (SNC) está regulado por una compleja interacción de células neuronales, gliales, estromales y vasculares que facilitan su correcta función. Aunque el estudio de estas células en aislamiento in vitro o juntos ex vivo proporciona información fisiológica útil; características destacadas de la fisiología de las células neurales se perderán en tales contextos. Por lo tanto, hay una necesidad de estudiar las células neuronales en su entorno in vivo nativo. El protocolo detallado aquí describe imágenes repetitivas in vivo de dos fotones de células neuronales en la corteza de roedores como una herramienta para visualizar y estudiar células específicas durante largos períodos de tiempo de horas a meses. Describimos en detalle el uso de la vasculatura cerebral groseramente estable como un mapa grueso o dendritas etiquetadas fluorescentemente como un mapa fino de regiones cerebrales seleccionadas de interés. Usando estos mapas como una clave visual, mostramos cómo las células neuronales se pueden reubicar con precisión para obtener imágenes in vivo repetitivas posteriores. Utilizando ejemplos de imágenes in vivo de microglia, neuronas y células NG2+ con etiqueta fluorescente, este protocolo demuestra la capacidad de esta técnica para permitir la visualización repetitiva de la dinámica celular en la misma ubicación cerebral durante largos períodos de tiempo, que puede ayudar aún más a entender las respuestas estructurales y funcionales de estas células en la fisiología normal o seguir insultos patológicos. Cuando sea necesario, este enfoque se puede acoplar a imágenes funcionales de células neuronales, por ejemplo, con imágenes de calcio. Este enfoque es especialmente una técnica poderosa para visualizar la interacción física entre los diferentes tipos celulares del SNC in vivo cuando están disponibles modelos genéticos de ratón o tintes específicos con etiquetas fluorescentes distintas para etiquetar las células de interés.

Para visualizar la dinámica microglial in vivo, se utilizaron ratones transgénicos dobles transgénicos CX3CR1GFP/+:Thy1YFP. La línea Thy1-YFP H se utiliza en comparación con la línea Thy1-GFP M para evitar la superposición de florescencia de microglia (GFP) y neuronas (YFP). Los enfoques alternativos podrían utilizar una línea de reportero en la que la microglia se etiqueta con, por ejemplo, tdTomato y luego se puede utilizar la línea Thy1-GFP M. Un inconveniente de la línea H es que YFP ...

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Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Este protocolo describe una técnica crónica de implantación de ventanas craneales que se puede utilizar para imágenes longitudinales de estructuras neuro-glio-vasculares, interacciones y función en condiciones saludables y enfermas. Sirve como una alternativa complementaria al enfoque de imagen transcraneal que, aunque a menudo se prefiere, posee algunas limitaciones críticas.

Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes in vivo repetitivas de dinámica neuroinmunitaria en ratones

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Este protocolo demuestra cómo la microscopía In Vivo Two-Photon se puede utilizar para realizar visualizaciones repetitivas de la dinámica celular, en la misma ubicación cerebral durante períodos de tiempo prolongados. La ventaja de esta técnica es que, hace posible la imagen de los cambios a largo plazo en los elementos celulares del cerebro, incluyendo la disposición, morfología, y las interacciones físicas entre diferentes tipos de células del SNC. Esta técnica puede ser especialmente útil para provocar interacciones células celulares, dinámica celular y cambios morfológicos durante la plasticidad cerebral y la neurodegeneración.Comience preparando a un adulto juvenil o joven, de cuatro a 10 semanas de edad, un ratón de heterocigoto CX3CR1 GFP, que pesa de 17 a 25 gramos, para una implantación de ventanas craneales. Después de anestesiar el ratón, utilice una recortadora de pelo para afeitarse el cabello en su cabeza, entre las orejas, aproximadamente, desde el nivel de los ojos, hasta la parte superior de la región del cuello. Mueva el ratón a la estación de cirugía estereotáctica, cono nasal y estabilice su cabeza usando barras para los oídos.Mantenga el ratón en la almohadilla de calentamiento, durante todo el procedimiento. Lubricar ambos ojos con ung mento de aceite, luego inyectar 100 microlitros de 0.25%bupivacaína, y 100 microlitros de cuatro miligramos por mililitros de dexametasona, por vía subcutánea en el sitio de la incisión. Espere al menos cinco minutos antes de continuar.Sangra la cabeza rapada, con tres hisopos alternos de betadina y 70% de alcohol. Luego haz una incisión del cuero cabelludo de línea media con una cuchilla quirúrgica o unas tijeras. Se extiende desde la parte posterior de la región del cráneo, entre las orejas, hasta el área frontal entre los ojos.Corte la piel restante para exponer el cráneo. Sangra el tejido conectivo situado entre el cuero cabelludo y el cráneo subyacente con peróxido de hidrógeno al 3%, y localiza el área cerebral para ser imagen con coordenadas estereotácticas. Taladre una abertura circular, aproximadamente cuatro milímetros en el cráneo, usando una broca dental.Durante la perforación, regularmente humedeció el cráneo con solución salina estéril y hisopos de algodón para enfriar el cerebro. Limpie los restos óseos y ablanda el hueso del cráneo. Cuando haya terminado, retire cuidadosamente esta porción del cráneo con fórceps puntiagudos.Después de retirar el cráneo, coloque cuidadosamente un pequeño vaso de cubierta, humedecido con solución salina en la craneotomía. Seque el exceso de solución salina con una toallita estéril. Usando un aplicador puntiagudo, aplique pegamento de cianoacrilato alrededor de la ventana, y permita que se adhieran al cerebro y al cráneo.Aplicar el pegamento de imprimación al resto del cráneo, y curarlo con una luz de curado durante 20 a 40 segundos. Crea un pozo alrededor de la ventana con el pegamento final, y cúguelo con una luz de curado durante 20 a 40 segundos. Pega una pequeña placa de cabeza en el cráneo, en el hemisferio contralateral, la craneotomía, con el pegamento de imprimación, y luego con el pegamento final, curando ambos durante 20 a 40 segundos.Después de que el ratón se despierte, inyecte una dosis subcutánea de buprenorfina SR como analgesia postoperatoria, que será suficiente durante 72 horas. Revive el ratón con alimentos de sal extra para facilitar una recuperación saludable. Las imágenes se pueden realizar tan pronto como dos semanas después de la cirugía de implantación.Utilice tornillos para montar la placa de cabeza en la etapa del microscopio de dos fotones, que debe mantenerse a 35 grados centígrados con una placa de calentamiento. Inyectar el ratón por vía subcutánea con 100 microlitros de tinte para los vasos sanguíneos, como Rhodamine B.Limpie suavemente la superficie de la ventana craneal con un hisopo de algodón, enloquecido en 70%etanol. Ponga unas gotas de agua o solución salina en la ventana y baje la lente objetivo en la solución.Asegúrese de que el láser está apagado a medida que el objetivo está bajando, y dibuje un mapa del curso para denotar los principales puntos de referencia de los vasos sanguíneos, mientras mira a través del ocular. Utilice este dibujo para identificar las regiones específicas durante las imágenes de dos fotones. Recopile imágenes de células fluorescentes y vasos utilizando imágenes de dos fotones.Consulte el manuscrito de texto para los parámetros de imagen, tome notas cuidadosas con las coordenadas adecuadas para asegurarse de que las regiones precisas se pueden revisar para obtener una imagen posterior. Dibuja como varios campos de visión en esta sesión inicial de imágenes, Al final de la toma de imágenes, saca el ratón del escenario, permite que se despierte de la anestesia y devuélvalo a su jaula de inicio. Utilice las notas e imágenes obtenidas para volver a tomar imágenes de las áreas durante las sesiones posteriores.Este protocolo se utilizó para visualizar Microglial Dynamics In Vivo, en ratones de línea YFP-H de Taiwán. Dendritas específicas, sirvieron como puntos de referencia estables para el mapeo fino de las regiones cerebrales. Mientras que las dendritas son un establo, algunas microglia se mueven diariamente.Los ratones TRANS3CR1/GFP transgénicos individuales, se utilizaron para seguir la microglia durante un máximo de ocho semanas. Las inyecciones de rhodamine B, se utilizaron para etiquetar la vasculatura, durante cada sesión de diagnóstico por imágenes. Mientras que la vasculatura permanece fija estable, la microglia es dinámica.Los ratones CX3CR1/GFP, se utilizaron para seguir la microglia antes y después de las convulsiones graves. Se mantuvo la estructura del lecho vascular, pero la red celular microglial y el paisaje de la posición eran transitorios. Se observaron mayores cambios en las 24 a 48 horas posteriores a las convulsiones.Se utilizaron ratones dobles transgénicos CX3CR1/GFP y NG2DS-Red, para rastrear microglia, y NG2 a células positivas en Vivo. Sin etiquetar la vasculatura, se identificaron microglia, así como parásitos asociados a los vasos, y células precursoras de oligodendrocitos, o OPC. Los parásitos tienen procesos alargados que siguen a lo largo de la pared vascular, y los OPC suelen mostrar cuerpos celulares más grandes que residen en el parénquima cerebral, lejos de la vasculatura.Cuando se utilizó rhodamine B, la fluorescencia más brillante de los parásitos se podía distinguir de la fluorescencia más débil de la rodamina luminal, a pesar de la excitación similar durante la toma de imágenes. Las imágenes diarias mostraban que los parásitos estaban posicionados de forma estable, mientras que los OPC y la microglia eran dinámicos. Es importante hacer una observación cuidadosa del área que se está visualizando, dibujar un mapa representativo que sea lo más preciso posible, y denotar los pasos dados para llegar a los otros lugares con respecto al punto de partida.En las sesiones de imágenes posteriores, estos pasos, los mapas dibujados a mano y las imágenes tomadas anteriormente, serán críticos para identificar las mismas ubicaciones repetidamente. Esta técnica ha permitido a los investigadores dilucidar interacciones neuro-glial, interacciones neuro-inmunes, y dinámica neurocélula de largos períodos de tiempo tanto en la salud como en la patología.

Research

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