Name: precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Vi tackar medlemmar i Eyo labbet för att diskutera de idéer som presenteras i detta manuskript. Vi tackar Dr Justin Rustenhoven från Kipnis Lab vid University of Virginia för gåvan av NG2DsRed möss33. Detta arbete stöds av finansiering från National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health till U.B.E (K22 NS104392).

Alla steg är i enlighet med de riktlinjer som fastställts och godkänts av institutionella Animal Care and Use Committee vid University of Virginia.
1. Mus förberedelse för kranial fönster implantation
OBS: Olika transgena muslinjer med fluorescerande taggar är lämpliga för avbildning.
<ol><li>Använd CX3CR1GFP/+ möss26 för att visualisera mikroglia in vivo. Vanligtvis används unga till unga vuxna 4 till 10 veckor gaml...

Tillkomsten av in vivo två foton imaging har öppnat möjligheter att utforska den uppsjö av cellulära interaktioner och dynamik som uppstår i den friska hjärnan. Inledande studier fokuserade på att använda den öppna skallen craniotomy strategi för bild neuronala dendriter av både akut och kronisk avbildning37,38. Detta kan också användas för att belysa neuroimmun interaktioner i hjärnan. Detta protokoll beskriver en metod för tillförlitlig avbild...

Det centrala nervsystemet (CNS) styrs av ett komplext samspel mellan olika inhemska celltyper inklusive nervceller, glia och kärl-associerade celler. Traditionellt studerades neurala celler i isolerade, co-odlade1,2,,3,,4,5 (in vitro) eller strukits hjärnvävnad (ex vivo)6,7,8,9,10 sammanhang. Emellertid, Det finns behov av att ytterligare förstå neurala cellen beteende och interaktioner i den inhemska miljön i den intakta hjärnan in vivo. I det här protokollet beskriver vi en metod för att kartlägga in vivo-regioner av intresse och exakt återskapa dessa regioner i framtida bildsessioner för att spåra de komplexa interaktionerna mellan de olika CNS-celltyperna under längre tidsperioder.
Utvecklingen av in vivo imaging metoder har gett betydande vinster för korrekt förståelse av neural funktion11,12,13,14,15. Närmare bestämt ger dessa metoder flera fördelar jämfört med traditionella in vitro- och ex vivo-metoder. För det första har in vivo bildsystem fysiologiskt relevanta cell- och vävnadskomponenter såsom vaskulaturen med hela repertoaren av cellulära interaktioner för att ge en fullständig förståelse av neurala nätverksfysiologi. För det andra, nya rön tyder på att när de tas bort från sin inhemska miljö, vissa neurala celler (såsom microglia) förlorar viktiga funktioner i sin identitet och därmedfysiologi 16,17 som kan bevaras i in vivo inställningen. För det tredje, in vivo bildsystem ger möjlighet till stabila longitudinella undersökningar av veckor till månader för att studera CNS cellulära interaktioner. Med tanke på de ökande bevisen för bidrag från det perifera immunsystemet18,,19 och mikrobiomet20,,21 i CNS fysiologi, ger in vivo-system en plattform för att förhöra sådana bidrag och effekter på CNS-celler. Således, metoder som använder längsgående in vivo imaging att studera neuro-immun fysiologi och interaktioner i friska, skadade och sjuka tillstånd är ett bra komplement till traditionella metoder.
I detta protokoll beskriver vi en tillförlitlig metod för bild olika celltyper i hjärnan inklusive mikroglia, nervceller och NG2+ celler som exempel. Två metoder för att visualisera neurala celler in vivo har utvecklats: den tunnade skallen strategi och den öppna skallen med en kranial fönster strategi. Även tunnas skalle metoder används och är att föredra eftersom de övervinna några av nackdelarna med den öppna skallen strategi såsom glia cell aktivering, högre än fysiologiska ryggraden dynamik och användning av antiinflammatoriska medel22,23 ,24,,25, tunnas skalle metoder visar också några kritiska nackdelar.24 För det första är gallringsproceduren ett mycket känsligt förfarande som många forskare har svårt att fullända, särskilt när det är nödvändigt att gallring. Detta beror på att det ofta är svårt för försöksmän att konstatera att de har tunnat skallen till ett ~ 20 μm djup. För det andra, för adekvata jämförelser mellan möss, gallring skulle behöva vara identiska och en mängd gallring framgång mellan imaging sessioner eller möss kan komplicera visualisering av neurala strukturer. För det tredje, när de används för longitudinell avbildning, kan djur med tunna skallar endast användas för ett begränsat antal sessioner när återförtunnande av skallen används. Forth, eftersom en del av benvävnaden fortfarande kvarstår, klarhet på djupet av bildframställning kan äventyras från den tunnade skallen strategi möjliggör stor visualisering av mer ytliga men inte så mycket med djupare regioner. Mot bakgrund av detta kan djupare hjärnstrukturer som hippocampus inte framgångsrikt avbildas med den tunnade skallen. Dessa överväganden ger upphov till behovet av alternativa och kompletterande tillvägagångssätt som skulle kunna övervinna dessa farhågor.
Alternativ till den tunnade skallen strategi, den öppna skallen fönster implantation tillvägagångssätt använder ett förfarande där skallen ersätts med ett optiskt klart glas täcket. Detta möjliggör ett nästan obegränsat antal bildsessioner. Dessutom, med tanke på byte av skallen med glas täcket, denna metod möjliggör en tydlig visning fönster fluorescerande taggade hjärnceller under långa perioder från timmar till månader och därför kan användas för att studera cellaktivitet och interaktioner som är relevanta för fysiologi, åldrande och patologi.
Sammantaget detalj vi steg som kan följas för att göra implantat kronisk kranial fönster genom en stereotaxic craniotomy som möjliggör in vivo imaging av hjärnan regioner av intresse. Vi beskriver också hur den grovt stabila hjärnan vasculature eller fluorescerande märkta dendriter kan användas för att generera en grov eller en fin karta, respektive av hjärnan regioner av intresse. Den här metoden kan sedan användas för upprepad avbildning under flera sessioner. Vikten av denna teknik ligger därför i dess förmåga att avbilda de långsiktiga förändringarna eller stasis i hjärnans element inklusive arrangemang, morfologi, och interaktioner av de olika cellulära typer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coverglass (3mm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&#38;qid=1583856837&#38;s=pet-supplies&#38;sr=8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demi Ultra LED Curing Light System</td>
			<td>Dental Health Products, Inc</td>
			<td>910860-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Osada: www.osadausa.edu</td>
			<td>EXL-M40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill Bit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Henry Schien</td>
			<td>1338333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBond Total Etch (Primer glue)</td>
			<td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td>
			<td>66040094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>81-88-9 (R6626)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetris Evoflow glue (Final glue)</td>
			<td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td>
			<td>#595956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Brav Mini+</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0&#38;hvadid=167141013968&#38;hvpos=&#38;hvnetw=g&#38;hvrand=12368793083893626704&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvqmt=&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint=&#38;hvlocphy=9008337&#38;hvtargid=pla-332197544154&#38;psc=1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice

Det centrala nervsystemet (CNS) regleras av ett komplext samspel mellan neuronala, glia, stromala och vaskulära celler som underlättar dess korrekta funktion. Även om studera dessa celler i isolering in vitro eller tillsammans ex vivo ger användbar fysiologisk information; framträdande funktioner i neural cellfysiologi kommer att saknas i sådana sammanhang. Därför finns det ett behov av att studera neurala celler i deras inhemska in vivo-miljö. Protokollet beskrivs här beskriver repetitiva in vivo två foton imaging av neurala celler i gnagare cortex som ett verktyg för att visualisera och studera specifika celler under längre tidsperioder från timmar till månader. Vi beskriver i detalj användningen av den grovt stabila hjärnan vasculature som en grov karta eller fluorescerande märkta dendriter som en fin karta över utvalda hjärnan regioner av intresse. Med hjälp av dessa kartor som en visuell nyckel visar vi hur neurala celler kan flyttas exakt för efterföljande repetitiva in vivo imaging. Med hjälp av exempel på in vivo imaging av fluorescerande märkta mikroglia, nervceller och NG2+ celler, detta protokoll visar förmågan hos denna teknik för att möjliggöra repetitiva visualisering av cellulära dynamik i samma hjärnan plats under längre tidsperioder, som ytterligare kan bidra till att förstå de strukturella och funktionella svar av dessa celler i normal fysiologi eller följande patologiska förolämpningar. Vid behov kan detta tillvägagångssätt kopplas till funktionell avbildning av neurala celler, t.ex. Detta tillvägagångssätt är särskilt en kraftfull teknik för att visualisera den fysiska interaktionen mellan olika celltyper av CNS in vivo när genetiska musmodeller eller specifika färgämnen med distinkta fluorescerande taggar för att märka de celler av intresse finns tillgängliga.

För att visualisera mikroglial dynamik in vivo användes dubbla transgena CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-möss. Thy1-YFP H-linjen används i motsats till Thy1-GFP M-linjen för att undvika florescenceöverlappning av mikroglia (GFP) och nervceller (YFP). Alternativa metoder skulle kunna använda en reporterlinje där mikroglia är märkta med tdTomato och sedan Thy1-GFP M-linjen kan användas. En nackdel med H-linjen är att YFP etiketter en hel del nervceller och etiketten ökar med ökande ålder (personlig...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice at JoVE.com

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Detta protokoll beskriver en kronisk hjärnskålen fönster implantation teknik som kan användas för longitudinell avbildning av neuro-glio-vaskulära strukturer, interaktioner och funktion i både friska och sjuka villkor. Det fungerar som ett komplement till den transkraniella bildbehandling strategi som, även om det ofta föredras, besitter vissa kritiska begränsningar.

Exakt brain mapping att utföra repetitiva In Vivo Imaging av neuro-immun dynamik hos möss

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Detta protokoll visar hur In Vivo Two-Photon mikroskopi kan användas för att göra repetitiva visualisering av cellulär dynamik, på samma hjärna plats under längre tidsperioder. Fördelen med denna teknik är att, det gör det möjligt att bilden de långsiktiga förändringarna i cellulära element i hjärnan, inklusive arrangemang, morfologi, och fysiska interaktioner mellan olika celltyp av CNS. Denna teknik kan vara särskilt användbart för att framkalla cell-cell interaktioner, cell dynamik, och morfologiska förändringar under hjärnans plasticitet, och neurodegeneration.Börja med att förbereda en ung eller ung vuxen, fyra till 10 veckor gammal, en CX3CR1 GFP heterozygote mus, som väger 17 till 25 gram, för en kranial fönster implantation. Efter att ha sövt musen, använd en hårtrimmer för att raka håret på huvudet, mellan öronen, ungefär, från ögonhöjd, till toppen av halsregionen. Flytta musen till stereotaktisk kirurgi stationen, näsa kon, och stabilisera huvudet med hjälp av örat barer.Underhåll musen på värmeplattan, under hela proceduren. Smörj båda ögonen med oljesalva, injicera sedan 100 mikroliter av 0,25%bupivakain, och 100 mikroliter på fyra milligram per milliliter dexametason, subkutant vid snittstället. Vänta minst fem minuter innan du fortsätter.Blöd det rakade huvudet, med tre växlande svabbprover av betadin, och 70%alkohol. Gör sedan ett mittlinjeskalp snitt med ett kirurgiskt blad eller en sax. Sträcker sig från baksidan av skalle regionen, mellan öronen, till frontalområdet mellan ögonen.Skär den återstående huden för att exponera skallen. Blöda bindväven som ligger mellan hårbotten och den underliggande skallen med 3%väteperoxid, och lokalisera hjärnan området som ska avbildas med stereotaktiska koordinater. Borra en cirkulär öppning, cirka fyra millimeter in i skallen, med hjälp av en tandborrkrona.Under borrning, regelbundet fuktade skallen med steril saltlösning och bomullspinner för att kyla hjärnan. Rensa bort benskräp och mjuka upp skallbenet. När du är klar, ta försiktigt bort denna del av skallen med spetsiga tyts.Efter skallen avlägsnas, försiktigt placera en liten täckglas, fuktad med saltlösning i kraniotomi. Torka av överflödig saltlösning med hjälp av en steril torka. Med hjälp av en spetsig applikator, applicera cyanoakrylatlim runt fönstret, och låt den fästa på hjärnan och skallen.Applicera primerlimet på resten av skallen, och bota det med ett härdljus i 20 till 40 sekunder. Skapa en brunn runt fönstret med det slutliga limmet, och bota det med ett härdningsljus i 20 till 40 sekunder. Lim en liten huvudplatta på skallen, på kontralaterala halvklotet, kraniotomi, med primer lim, och sedan med det slutliga limmet, bota både i 20 till 40 sekunder.Efter att musen vaknat, injicera en subkutan dos av buprenorfin SR som postoperativ analgesi, vilket kommer att vara tillräckligt i 72 timmar. Återuppliva musen med extra salt mat för att underlätta en hälsosam återhämtning. Bildbehandling kan utföras redan två veckor efter implantationsoperationen.Använd skruvar för att montera huvudplattan på två-foton mikroskopet skede, som bör bibehållas vid 35 grader Celsius med en värmeplatta. Injicera musen subkutant med 100 mikroliter av blodkärl färgämne, såsom Rhodamine B. Försiktigt rengöra ytan av kraniet fönster med en bomullspinne, dabbed i 70%etanol. Sätt några droppar vatten eller saltlösning på fönstret, och sänka objektivet i lösningen.Se till att lasern är avstängd som målet är att sänka, och rita en kurs karta för att beteckna de stora blodkärlen landmärken, medan du tittar genom okularet. Använd den här ritningen för att identifiera de specifika regionerna under tvåfotonavbildning. Samla bilder av fluorescerande celler och kärl med hjälp av två-foton bildbehandling.Se textmanuskriptet för bildtagningsparametrar, föra noggranna anteckningar med lämpliga koordinater, för att säkerställa att de exakta regionerna kan åter tas upp för en efterföljande avbildning. Rita som flera synfält i denna första bildbehandling session, I slutet av bildbehandling, ta musen från scenen, låt den vakna upp från anestesi, och returnera den till sitt hem bur. Använd de erhållna anteckningarna och bilderna för att åter avbilda områdena under efterföljande sessioner.Detta protokoll användes för att visualisera Microglial Dynamics In Vivo, i Taiwan YFP-H linje möss. Specifika dendrites, tjänade som stabila landmärken för den fina kartläggningen av hjärnregioner. Medan dendrites är ett stabilt, vissa microglia flytta dagligen.Enstaka transgena CX3CR1/GFP-möss, användes för att följa mikroglia i upp till åtta veckor. Injektioner av rhodamine B, användes för att märka vasculature, under varje bildframställning session. Medan vasculature förblir stabilt fast, mikroglia är dynamiska.CX3CR1/GFP-mössen, användes för att följa mikroglia före och efter svåra anfall. Den vaskulära sängen struktur bibehölls, men mikroglial cellulära nätverket, och position landskapet var övergående. Större förändringar observerades inom 24 till 48 timmar efter anfall.Dubbel transgena CX3CR1/GFP och NG2DS-Red möss, användes för att spåra mikroglia, och NG2 till positiva celler In Vivo. Utan märkning av vasculature, microglia samt fartyg associerade parasiter och oligodendrocyte prekursor celler, eller OPCs, identifierades. Parasiter har avlånga processer som följer längs kärlväggen, och OPCs visar vanligtvis större cellkroppar som finns i hjärnan parenkym, bort från vasculature.När rhodamine B användes, kunde den ljusare fluorescensen av parasiter skiljas från den svagare fluorescensen av luminal rhodamin, trots liknande magnetisering under avbildning. Daglig bildbehandling visade att parasiter var stably placerad, medan OPCs och microglia var dynamiska. Det är viktigt att göra noggrann observation av området som visualiseras, att rita en representativ karta som är så exakt som möjligt, och beteckna de åtgärder som vidtagits för att nå de andra platserna med avseende på utgångspunkten.I efterföljande bildtagningssessioner kommer dessa steg, de handritade kartorna och de bilder som tidigare tagits, att vara avgörande för att identifiera samma platser upprepade gånger. Denna teknik har gjort det möjligt för forskare att belysa neuron-gliaceller interaktioner, neuro-immun interaktioner, och neuro-cell dynamik av längre tidsperioder i både hälsa och patologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Icke-invasiv avbildning av Leukocyt Homing och migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

En Orthotopic Modell av serös äggstockscancer hos immunkompetenta möss In vivo Bildgivande och övervakning av tumör Immunsvar

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminiscent Bakteriell Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging av<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektioner hos möss

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging för att skilja akut och kronisk inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Använda fluorescerande proteiner för att visualisera och kvantifiera<em&gt; Klamydia</em&gt; Vacuole tillväxtdynamiken i levande celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Icke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescence optisk avbildning av inflammatorisk MMP aktivitet Använda en aktiverbar Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Långsiktiga In Vivo -spårning av inflammatoriska celler dynamiken inom Drosophila puppor

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...