Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (til L. T.), Epstein Family Foundation Award (til N. D. P.C.), og NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Derudover er dette projekt blevet finansieret helt eller delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Chemical Biology Consortium Contract No. HHSN261200800001E. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis de synspunkter eller politikker Department of Health and Human Services, heller ikke omtale af handelsnavne, kommercielle produkter eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.

1. Udarbejdelse af cellekultur og reagenser
<ol><li>Formulere en 500 ml flaske vækstmedier med 10% føtal kvæg serum, 1x antibiotika / antimikotisk, 20 mM HEPES, og 1 mM natriumpyruvat. Opbevares ved 4 °C.</li>
	<li>Optø cellulære termiske skift reagenser (EA reagens, lysis buffer, og substrat) fra frosne originale lagerflasker.</li>
	<li>Dispensere reagenser og buffer som 2 ml aliquots og opbevares ved -20 °C. BEMÆRK: Undgå at fryse/tø for reproducerbarhed, og brug kun det reagensvolumen, der kræves til a...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tyrosine+Phosphatases:+Time+to+End+the+Stigma.">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li><li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction.">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li><li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase.">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li><li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+phosphatase+Shp2+(PTPN11)+in+cancer.">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li><li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li><li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li><li>Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).</li><li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PTPN11,+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2,+cause+Noonan+syndrome.">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1.">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li><li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases:+next-generation+drugs.">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li><li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase.">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li><li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+PTPome+in+human+disease.">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li><li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors.">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li><li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors.">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li><li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets:+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development.">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li><li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases.">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li><li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors.">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases.">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

Vi har præsenteret et mål engagement assay, der kan bekræfte direkte binding af små molekyler til SHP2 fosfatase i celler. Analysen kan diskriminere mellem lav- og højaffinitetshæmmere og, hvad der er vigtigt, bekræfte en mangel på styrke fra de allosteriske hæmmere af SHP099-typen for den gof onkogenic SHP2-E76K-mutant. En styrke af denne miniaturiseret analyse er dens evne til at blive integreret i en SHP2-hæmmer screening kampagne. Analysens evne til at bekræfte intracellulær binding til SHP2 af ukendt kem...

Tyrosinphosphorylation spiller en vigtig rolle i signaltransduktion i celler1,2. Denne post-translationelle modifikation er katalyseret af protein tyrosin kinaser (PTKs) og vendt af protein tyrosin fosfataser (PtPs). Derfor, afvigende PTK eller PTP funktion fører til mange arvelige eller erhvervede menneskeligesygdomme 3,4,5,6. Den Src-homologi 2 (SH2) domæne-holdige fosfatase 2 (SHP2) er en bredt udtrykt ikke-receptor type PTP kodet af proto-oncogene PTPN117 og er en central regulator af mange fysiologiske processer, der involverer signal transduktion ved aktivering af Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt, eller JAK / STAT signalering veje8. Normalt er SHP2-aktivitet stramt reguleret for at forhindre afvigende signalering. Under basale forhold er SHP2 automatisk fanget af sit N-terminal SH2-domæne, som blokerer adgangen til det aktive sted inden for det katalytiske fosfatasedomæne (Figur 1A)9,10. Ved celleaktivering rekrutterer tyrosinfosforholdige bindende proteiner SHP2, hvilket får det til at vedtage sin aktive kropsbygning, hvor det aktive sted nu er tilgængeligt for dets underlag. I mange kræftformer SHP2 aktivitet er forhøjet. Somatiske gain-of-function -mutationer (GOF) i PTPN11 er hovedsageligt blevet identificeret i leukæmi og forhindrer binding af N-SH2-domænet til fosfatasedomænet, hvilket resulterer i konstituerende aktiv SHP2 (Figur 1B)11. Kønsskifte GOF mutationer i PTPN11 er ansvarlige for ~ 50% af tilfælde af Noonan syndrom, en udviklingsforstyrrelse med en øget risiko for malignitet12. I faste tumorer, hvor PTPN11 mutationer er sjældne, fører større niveauer af fosforylerede bindende proteiner til øget SHP2-aktivitet (Figur 1C). SHP2 er også vigtigt for immun checkpoint signalering, som checkpoint receptorer såsom BTLA eller PD-1 rekruttere SHP2 til dephosphorylate nøgle signalering molekyler, forhindrer immuncelleaktivering13,14,15.
Målretning af PtPs med små molekyler har været en udfordring, fordi det aktive sted for PtPs er stærkt bevaret og stærkt opladet; hæmmere, der er målrettet mod det aktive sted, er ofte potente , men udviser dårlig selektivitet og oral biotilgængelighed16,17,18,19,20,21,22. Faktisk lider mange rapporterede SHP2-hæmmere af dårlig selektivitet og manglende effekt icellerne 23. For nylig er der rapporteret allosteriske hæmmere af SHP2 med god styrke og fremragende selektivitet (f.eks.24 25 Forbindelser baseret på SHP099 og RMC-4550 er i øjeblikket i fase I kliniske forsøg til behandling af faste tumorer med receptor tyrosin kinase (RTK) pathway aktivering26,27. Mens banebrydende, disse forbindelser er ineffektive mod mange af de SHP2 onkogene mutanter, der driver leukemogenese i et betydeligt antalblodkræftpatienter 28,,29,30. Denne mangel på styrken af SHP099-lignende forbindelser mod SHP2 oncogenic varianter stammer fra deres unikke allosteriske mekanisme, da de hæmmer SHP2 aktivitet ved at binde og stabilisere den inaktive, lukkede kropsbygning, som forstyrres i SHP2 mutanter. Yderligere, baseret på en nyligrapport 31, adaptive resistens mekanismer hos patienter behandlet med SHP099-lignende hæmmere er ganske tænkeligt. Derfor er udviklingen af næste generation af SHP2-hæmmere, der er målrettet sin aktive, åbne tilstand, genstand for intens forskning.
Karakteriseringen af nye SHP2-hæmmere i celler er et væsentligt aspekt af blyoptimeringsprocessen. Kritisk, bevist mål engagement af inhibitor under fysiologiske forhold giver en ekstra grad af tillid til, at ressourcer til medicinsk kemi er effektivt indsat på forbindelser med lovende cellulære effekt. Tidligere er der udviklet flere metoder til vurdering af bindingen af små molekylehæmmere til deres mål, primært for proteinkinaser32. For at udvikle en SHP2 cellulære mål engagement assay, vi udnyttede en cellulær termisk skiftassay 33. Denne analyse, svarende til in vitro termisk skift (PTS) analyse for proteiner34, overvåger målet protein termisk stabilitet, som typisk ændres ved binding af små molekyler. Den oprindelige analyse er en lav throughput assay, der udnytter antistoffer til at kvantificere mål proteinniveauer. Alternativt valgte vi en nyligt rapporteret variant af den termiske skiftanalyse, der anvender en β-galactosidase enzymfragment komplementering (EFC) assay(Figur 2)35. For disse eksperimenter udtrykkes det interesseprotein, der er af interesse, i celler som et N- eller C-terminal fusionsprotein med et forbedret ProLabel-mærke (ePL, et 42 aminosyrefragment af β-galactosidase). Celler overføres derefter til 384-brønd PCR-kompatible plader og inkuberes med interesseforbindelser. En termocykmager anvendes til at anvende en temperaturgradient på cellerne, hvis proteiner vil protese og samle som temperaturen stiger baseret på deres termiske stabilitet. En kandidatforbindelses evne til at binde og stabilisere proteinet af interesse vil resultere i en øget termisk stabilitet af dette protein. Derfor, efter lysis af cellerne, de mærkede proteiner, der er blevet stabiliseret af en kandidat sammensatte vil forblive i opløsning ved højere temperaturer end mærkede proteiner af celler inkuberet med køretøjet kontrol. Reporter enzym acceptor (EA) er i stand til at supplere de opløselige ePL-mærkede proteiner, hvilket resulterer i påviselige β-galactosidase aktivitet ved hjælp af en luminescens substrat.
Vi har for nylig udviklet en robust cellulær termisk skift assay for wild-type SHP2 (SHP2-WT) og en hyppig SHP2 onkogene variant (SHP2-E76K) i en miniaturiseret 384-godt format36. Her rapporterer vi en detaljeret protokol for denne analyse, som pålideligt registrerer målengagement fra SHP2-hæmmere i celler og viser en høj grad af korrelation mellem inhibitor-styrke og cellulære termiske skiftdata. Den generelle analysearbejdsgang er illustreret i figur 3. Vores platform bruger N-terminalt mærkede fuld længde ePL-SHP2 fusion proteiner. For generering af de tilsvarende pICP-ePL-N-SHP2-WT og pICP-ePL-N-SHP2-E76K udtryk plasmider, henvises til vores seneste publikation36. Denne analyse kan udføres ved hjælp af en termisk gradient til at etablere SHP2 termiske profiler og bestemme SHP2 smeltetemperaturer i tilstedeværelse eller fravær af inhibitor. Når termiske profiler er blevet etableret, kan det også udføres under isotermiske forhold, så inhibitor dosis-respons vurdering. Begge typer af eksperimenter er beskrevet nedenfor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

Den Src-homologi 2 (SH2) domæne-holdige fosfatase 2 (SHP2), kodet af PTPN11 proto-oncogene, er en vigtig mægler af receptor tyrosin kinase (RTK)-drevet celle signalering, fremme celle overlevelse og spredning. Desuden rekrutteres SHP2 af immunkontrolpunktreceptorer for at hæmme B- og T-celleaktivering. Afvigende SHP2 funktion har været involveret i udvikling, progression, og metastase af mange kræftformer. Faktisk, små molekyle SHP2 hæmmere har for nylig indgået kliniske forsøg til behandling af faste tumorer med Ras/Raf/ERK vej aktivering, herunder tumorer med nogle onkogen Ras mutationer. Men, den nuværende klasse af SHP2 hæmmere er ikke effektiv mod SHP2 onkogen varianter, der forekommer ofte i leukæmi, og udviklingen af specifikke små molekyler, der er målrettet onkogene SHP2 er genstand for aktuel forskning. Et fælles problem med de fleste drug discovery kampagner, der involverer cykliske proteiner som SHP2 er, at de primære analyser, der driver kemiske opdagelse er ofte in vitro assays, der ikke rapporterer cellulære mål engagement kandidat forbindelser. For at give en platform til måling af cellulære mål engagement, vi udviklet både vilde-type og mutant SHP2 cellulære termisk skift analyser. Disse analyser registrerer pålideligt målengagementet af SHP2-hæmmere i celler. Her giver vi en omfattende protokol af denne analyse, som giver et værdifuldt værktøj til vurdering og karakterisering af SHP2-hæmmere.

Det termiske gradienteksperiment for SHP2-WT resulterede i en sigmoidal cellulær termisk profil med en smal smeltende overgang, der er typisk og konsistent for et foldet protein (Figur 4A). SHP2 består af tre uafhængige domæner: to SH2-domæner og det katalytiske domæne (Figur 1). I den autoinhibited lukket kropsbygning disse domæner selv-associerede; den smeltende overgang, der blev observeret i det termiske profileksperiment, afspejlede formentlig denne ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Evnen til at vurdere målet engagement af kandidathæmmere i intakte celler er afgørende for lægemiddel opdagelse. Denne protokol beskriver en 384 godt format cellulære termisk skift assay, der pålideligt registrerer cellulære mål engagement af hæmmere rettet mod enten vilde type SHP2 eller dens onkogene varianter.

Vurdering af cellulære målengagement ved SHP2 (PTPN11) Fosfatasehæmmere

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Den tyrosin fosfatase SHP2, er en vigtig mægler af cellulære signalering, fremme celle overlevelse og spredning. Mit team er fokuseret på at finde små molekyle SHP2 hæmmere til behandling af kræft. Vores teknik giver en hurtig og kraftfuld metode til at etablere celle-penetranter, samt mål engagement af små molekyle SHP2 hæmmere, i celler.Dette er forsikrer, opdagelse ressourcer er effektivt rettet. SHP2 som et attraktivt mål for kræftbehandling. Og flere SHP2 hæmmere, er i kliniske forsøg.Vores teknik til at lette opdagelsen af næste generation af hæmmere med forbedrede effektprofiler. Demonstration til procedure ville være Celeste Romero, en forskningsassistent og Douglas Sheffler, en forskning adjunkt, fra vores laboratorium. Til at begynde at løsne HEK293 T-celler fra pladerne ved hjælp af tre milliliter genagens af cellen.Cellerne fortyndes med 12 milliliter vækstmedier, og opsaml dem ved centrifugering ved 1, 400 gange G i fire minutter. Opsaltning af celleganen i 10 milliliter vækstmedier og mål cellernes koncentration og levedygtighed med trypanblå og en celletæller. Plade 700, 000 eksponentielt voksende celler i hver brønd af en seks brønd kultur plade og inkubere dem i 24 timer ved 37 grader Celsius, og 5% kuldioxid.Den næste dag fortyndes to mikrogram plasma-DNA i 200 mikroliter transfektionsbuffer. Vortex plasma-DNA'et i 10 sekunder og centralfuge det på 1, 400 gange G i fire minutter. Der tilsættes fire mikroliter af transinfektionsreage til det fortyndede DNA.Vortex det i 10 sekunder, og gentag centrifugering. Inkuber DNA'et ved 23 grader Celsius i 10 minutter, tilsæt derefter transfektionsblandingen til de vedlagte HEK293 T-celler i de seks brøndplader, og vend cellerne tilbage til kuvøsen i yderligere 24 timer. For at forberede analyseplader, fortyndes inhibitoropløsninger i DMSO, for en bestand koncentration på 10 millimolar og dispensere dem i en 384 godt lav død volumen kildeplade, til øjeblikkelig brug.Spot den ønskede mængde af inhibitorer eller køretøj, ved hjælp af en væske handler i 384 godt real time PCR plader på et mål endelige volumen på mindre end 0,5% DMSO. Forsegle pladerne ved hjælp af en plade sealer med inert gas udrensning. For at forberede de transficerede celler før inkubere vækstmedier og sælge løsrivelse reagens i en 37 grader Celsius vandbad.Fjern cellerne fra inkubatoren og inspirer forsigtigt mediet fra brøndene. Der tilsættes 0,3 milliliter af celleafmonteret reagens til hver brønd, og sten forsigtigt pladen frem og tilbage for grundigt at dække pladebundens overflade. Inkuber pladen ved 23 grader Celsius i to minutter.Tilføj en milliliter vækstmedier til hver brønd, og forsigtigt pipette cellerne i brønden. Derefter overføre dem til en 15 milliliter Falcon centrifuge rør Centrifuge cellerne på 1, 400 gange G i fire minutter for at indsamle cellerne. Forsigtigt aspirere medierne, derefter resuspend cell pellet i to milliliter vækstmedier.Sørg for, at cellens levedygtighed er større end 90 % ved hjælp af prøvepanblå og en celletæller. Cellerne fortyndes til en koncentration på 125 celler pr. mikroliter, så cellerne ikke bliver suspenderet i mere end to timer for optimal levedygtighed. Ved inkubation med SHP2-hæmmere skal cellerne dispenseres til et sterilt enkeltkanalsopløsningstrug.Centrifuge den tidligere forberedte 384 godt real-time PCR plade på 2, 500 gange G i fem minutter, derefter fjerne forseglingen og bruge en 125 mikroliter multi-kanal pipette, at tilføje fem mikroliter af de fortyndede celler til de ønskede Brønde. Centrifuge pladen ved 42 gange G i 30 sekunder uden låg, derefter vedhæfte et låg og inkubere pladen i en time ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Program Thermo cycler, i henhold til manuskript retninger for enten den termiske profil gradient eller isotermisk eksperiment.Start termocyrens varmepulsprogram, og placer analysepladen på den termiske blok. Når programmet er færdigt, skal du fjerne analysepladen. Supplere hver brønd af analysen plade med fem mikroliter af licenseret detektion master mix.Centrifuge pladen ved 42 gange G i 30 sekunder, og gemme den ved 23 grader Celsius i mørke i 30 til 60 minutter. Mål chemiluminescens ved hjælp af en mikropladelæser med den optimerede integrationstid. Den termiske gradient eksperiment for vilde type SHP2, resulterede i en sigmoidal cellulære termisk profil med en smal smeltende overgang, der er typisk for et foldet protein.Inkubation af vild type SHP2 med den allosteriske hæmmer SHP099, stabiliseret til den termiske profil til en betydelig og målbar grad. Stabiliseringen af SHP2, også spores med styrken af SHP099 som allosteriske forbindelser. På 10 mikromolar, den mere potente RMC-4550, produceret en større grad af stabilisering end SHP099 for vilde type SHP2.På grund af deres unikke mekanisme, SHP099 ligesom allosteriske hæmmere er mindre effektive mod mange SHP2 onkogen mutanter, herunder SHP2-E76K. I overensstemmelse med disse kendte egenskaber observeres kun marginal termisk stabilisering af SHP2-E76K ved SHP099. Ekspressionsniveauet for EPL-tagproteinet kan påvirke signalintensiteten dramatisk.Termiske profiler til forbigående og stabilt integrerede vilde celler. under identiske aktivbetingelser vises. Normalisering af de forskellige kurver giver sammenlignelige termiske profiler, der afslører den brede vifte af EFC detektionssystem.Drage fordel af den termiske cycler evne til at producere termiske stigninger på den korte akse af en 384 brønd plade. en række isotermiske titrering kan udføres på en enkelt plade. Ved en optimal temperatur gav en isotermisk titrering med en fuld dosisrespons på 10 point en nyttig EC50 for RMC-4550.Principperne for dette aktiv kan anvendes til at overvåge nedbrydningen af proteiner i celler, der er fremkaldt af PROTAC-forbindelser. Vi bruger cellulære Thelma skift teknik til at opdage hæmmere af mutant SHP2 og leukæmi, lægemidler specifikke mod hyppige SHP2 onkogen mutanter vil have en betydelig indvirkning på behandlingen af disse kræftformer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Vurdering af resistens over for tyrosin Kinase hæmmere af en afhøring af signaltransduktionsveje af antistof Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulær og cellulære Lung Model til at studere Tumor metastaser

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En kromatin Immunoprecipitation analyse til at identificere nye NFAT2 Target gener i kronisk lymfatisk leukæmi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En klumpformet drab Assay af bil T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Brug af Mikroarrays til at afhøre mikromiljø påvirkning af cellulære Phenotyper i Cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering cellelevedygtighed og død i 3D Spheroid kulturer af kræftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakterisere sygdomsrelaterede mutanter af RAF-familie kinaser ved hjælp af et sæt praktiske og gennemførlige metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering af virkningerne af Migrastatiske hæmmere på 3D tumor Spheroid invasion af høj opløsning Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identifikation af Transskription Factor Regulators ved hjælp af Medium-Throughput Screening af Arrayed Biblioteker og en Dual-Luciferase-baserede Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...