Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par national Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (à L. T.), Epstein Family Foundation Award (à N. D. P.C.), et NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. En outre, ce projet a été financé en tout ou en partie avec des fonds fédéraux de l’Institut national du cancer, National Institutes of Health, dans le cadre du contrat no du Consortium de biologie chimique. HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas nécessairement l’approbation du gouvernement des États-Unis. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des Instituts nationaux de la santé.

1. Préparation de la culture cellulaire et des reagents
<ol><li>Formuler une bouteille de 500 mL de supports de croissance avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1x antibiotique/antimicotique, 20 mM HEPES et 1 mM de pyruvate de sodium. Conserver à 4 °C.</li>
	<li>Décongeler les reagents cellulaires de décalage thermique (réageni EA, tampon de lyse et substrat) à partir de bouteilles de bouillon d’origine congelées.</li>
	<li>Distribuez les reagents et tampons sous forme d’aliquots de 2 mL et stockez-les à -20 ?...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tyrosine+Phosphatases:+Time+to+End+the+Stigma.">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li><li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction.">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li><li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase.">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li><li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+phosphatase+Shp2+(PTPN11)+in+cancer.">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li><li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li><li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li><li>Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).</li><li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PTPN11,+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2,+cause+Noonan+syndrome.">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1.">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li><li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases:+next-generation+drugs.">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li><li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase.">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li><li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+PTPome+in+human+disease.">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li><li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors.">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li><li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors.">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li><li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets:+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development.">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li><li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases.">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li><li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors.">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases.">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

Nous avons présenté un test d’engagement cible qui peut confirmer la liaison directe de petites molécules à la phosphatase SHP2 dans les cellules. L’analyse peut faire la distinction entre les inhibiteurs de faible et de haute affinité et, surtout, confirmer un manque de puissance par les inhibiteurs allosteriques du type SHP099 pour le mutant oncogène SHP2-E76K gof. Une force de cet essai miniaturisé est sa capacité à être intégrée dans une campagne de dépistage des inhibiteurs du SHP2. La capacité de ...

La phosphorylation de la tyrosine joue un rôle important dans la transduction du signal dansles cellules 1,2. Cette modification post-translationnelle est catalysée par des kinases de tyrosine protéique (PTKs) et inversée par des phosphatases de tyrosine protéique (PPR). Par conséquent, la fonction aberrante de PTK ou de PTP mène à beaucoup de maladies humaineshéritées ou acquises 3,,4,,5,,6. Le Src-homology 2 (SH2) contenant du domaine phosphatase 2 (SHP2) est un PTP de type non récepteur largement exprimé codé par le PTPN117 proto-oncogène et est un régulateur clé de nombreux processusphysiologiquesqui impliquent la transduction du signal par activation des voies de signalisation Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt ou JAK/STAT. Normalement, l’activité SHP2 est étroitement réglementée afin d’éviter la signalisation aberrante. Dans des conditions basales, SHP2 est autoinhibited par son domaine SH2 N-terminal, qui bloque l’accès au site actif dans le domaine catalytique de phosphatase (Figure 1A)9,10. Lors de l’activation cellulaire, les protéines liant la tyrosine phosphorylatées recrutent le SHP2, ce qui lui fait adopter sa conformation active, dans laquelle le site actif est désormais accessible à ses substrats. Dans de nombreux cancers, l’activité SHP2 est élevée. Des mutations somatiques de gain de fonction (GOF) dans PTPN11 ont été identifiées principalement dans les leucémies et empêchent la liaison du domaine de N-SH2 au domaine de phosphatase, ayant pour résultat le SHP2 constitutif actif (figure 1B)11. Germline GOF mutations dans PTPN11 sont responsables d’environ 50% des cas de syndrome de Noonan, un trouble du développement avec un risque accru de malignité12. Dans les tumeurs solides, où les mutations PTPN11 sont rares, des niveaux plus élevés de protéines liantes phosphorylatées conduisent à une activité SHP2 améliorée (Figure 1C). SHP2 est également important pour la signalisation de point de contrôle immunitaire, car les récepteurs de point de contrôle tels que BTLA ou PD-1 recrutent SHP2 pour déphosphorylate molécules de signalisation clés, empêchant l’activation des cellulesimmunitaires 13,14,15.
Cibler les PNP avec de petites molécules a été un défi, parce que le site actif des PNP est fortement conservé et très chargé; les inhibiteurs qui ciblent le site actif sont souvent puissants, mais présentent une faible sélectivité et biodisponibilité orale16,17,18,19,20,21,22. En effet, beaucoup d’inhibiteurs rapportés de SHP2 souffrent de la sélectivité pauvre et du manque d’efficacité dans lescellules 23. Récemment, des inhibiteurs allosteriques de SHP2 avec la bonne puissance et l’excellente sélectivité ont été rapportés (par exemple, SHP09924 et RMC-455025)et ont suscité l’intérêt renouvelé pour des inhibiteurs de SHP2. Les composés basés sur SHP099 et RMC-4550 sont actuellement en phase I essais cliniques pour traiter les tumeurs solides avec récepteur tyrosine kinase (RTK) activation de la voie26,27. Bien que révolutionnaires, ces composés sont inefficaces contre de nombreux mutants oncogènes SHP2 qui conduisent la leukemogenèse chez un nombre important de patients atteints d’un cancer dusang 28,29,30. Ce manque de puissance des composés de type SHP099 vers les variantes oncogènes SHP2 provient de leur mécanisme allosterique unique, car ils inhibent l’activité SHP2 en liant et en stabilisant la conformation inactive et fermée, qui est perturbée chez les mutants SHP2. En outre, basé sur un rapport récent31, les mécanismes adaptatifs de résistance dans les patients traités avec des inhibiteurs SHP099-like sont tout à fait concevables. Par conséquent, le développement d’inhibiteurs SHP2 de prochaine génération qui ciblent son état actif et ouvert fait l’objet d’intenses recherches.
La caractérisation de nouveaux inhibiteurs du SHP2 dans les cellules est un aspect essentiel du processus d’optimisation du plomb. L’engagement cible éprouvé de l’inhibiteur dans des conditions physiologiques fournit un niveau supplémentaire de confiance que les ressources pour la chimie médicinale sont efficacement déployées sur des composés avec l’efficacité cellulaire prometteuse. Dans le passé, plusieurs méthodes pour évaluer la liaison des inhibiteurs de petites molécules à leurs cibles ont été développées, principalement pour les kinases protéiques32. Pour développer un essai cellulaire d’engagement de cible de SHP2, nous avons utilisé un essai cellulaire de décalage thermique33. Cet essai, semblable à l’analyse in vitro de décalage thermique (PTS) pour les protéines34,surveille la stabilité thermique cible de protéine, qui est typiquement modifiée par la liaison des petites molécules. L’analyse originale est un test de faible débit qui utilise des anticorps pour quantifier les niveaux de protéines cibles. Alternativement, nous avons choisi une variante récemment rapportée de l’essai de décalage thermique qui utilise un essai de complémentation de fragment d’enzyme de β-galactosidase (EFC) essai (figure 2)35. Pour ces expériences, la protéine d’intérêt est exprimée dans les cellules comme une protéine de fusion N- ou C-terminal portant une étiquette prolabel améliorée (ePL, un fragment d’acide aminé de 42 β-galactosidase). Les cellules sont ensuite transférées dans des plaques compatibles PCR de 384 puits et incubées avec des composés d’intérêt. Un thermocycleur est utilisé pour appliquer un gradient de température sur les cellules, dont les protéines dénoaturent et s’agrègent à mesure que la température augmente en fonction de leur stabilité thermique. La capacité d’un composé candidat de lier et de stabiliser la protéine d’intérêt se traduira par une stabilité thermique accrue de cette protéine. Par conséquent, à la suite de la lyse des cellules, les protéines étiquetées qui ont été stabilisées par un composé candidat resteront en solution à des températures plus élevées que les protéines étiquetées des cellules incubées avec le contrôle du véhicule. L’accepteur d’enzymes reporter (EA) est capable de compléter les protéines solubles étiquetées ePL, ce qui entraîne une activité détectable de β-galactosidase à l’aide d’un substrat de luminescence.
Nous avons récemment développé un essai cellulaire robuste de décalage thermique pour le SHP2 sauvage-type (SHP2-WT) et une variante oncogène fréquente de SHP2 (SHP2-E76K) dans un format miniaturisé de 384 puits36. Ici, nous rapportons un protocole détaillé de cet essai, qui détecte de manière fiable l’engagement cible par les inhibiteurs de SHP2 dans les cellules et démontre un degré élevé de corrélation entre la puissance d’inhibiteur et les données cellulaires de décalage thermique. Le flux de travail général d’analyse est illustré à la figure 3. Notre plate-forme utilise des protéines de fusion ePL-SHP2 en phase terminale N. Pour la génération des plasmides d’expression pICP-ePL-N-SHP2-WT et pICP-ePL-N-SHP2-E76K, veuillez consulter notre récente publication36. Cet essai peut être effectué à l’aide d’un gradient thermique pour établir des profils thermiques SHP2 et déterminer les températures de fusion du SHP2 en présence ou en l’absence d’inhibiteur. Une fois que les profils thermiques ont été établis, il peut également être effectué dans des conditions isothermales, permettant l’évaluation de dose-réponse d’inhibiteur. Les deux types d’expériences sont décrits ci-dessous.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

Le domaine src-homologie 2 (SH2) contenant de la phosphatase 2 (SHP2), codé par le proto-oncogène PTPN11, est un médiateur clé de la signalisation cellulaire axée sur la tyrosine des récepteurs (RTK), favorisant la survie et la prolifération cellulaires. En outre, SHP2 est recruté par les récepteurs de point de contrôle immunitaire pour inhiber l’activation des cellules B et T. La fonction Aberrante de SHP2 a été impliquée dans le développement, la progression, et la métastase de beaucoup de cancers. En effet, de petits inhibiteurs de la molécule SHP2 ont récemment participé à des essais cliniques pour le traitement de tumeurs solides avec activation de la voie Ras/Raf/ERK, y compris des tumeurs avec quelques mutations oncogènes de Ras. Cependant, la classe actuelle des inhibiteurs de SHP2 n’est pas efficace contre les variantes oncogènes de SHP2 qui se produisent fréquemment dans les leucémies, et le développement de petites molécules spécifiques qui ciblent le SHP2 oncogène fait l’objet de recherches actuelles. Un problème commun avec la plupart des campagnes de découverte de drogue impliquant des protéines cytosoliques comme SHP2 est que les analyses primaires qui conduisent à la découverte chimique sont souvent des analyses in vitro qui ne signalent pas l’engagement cible cellulaire des composés candidats. Pour fournir une plate-forme pour mesurer l’engagement cellulaire de la cible, nous avons développé des analyses thermiques cellulaires SHP2 de type sauvage et mutantes. Ces analyses détectent de manière fiable l’engagement cible des inhibiteurs du SHP2 dans les cellules. Ici, nous fournissons un protocole complet de cet essai, qui fournit un outil précieux pour l’évaluation et la caractérisation des inhibiteurs du SHP2.

L’expérience de gradient thermique pour SHP2-WT a donné lieu à un profil thermique cellulaire sigmoïdal avec une transition de fusion étroite qui est typique et cohérente pour une protéine pliée (Figure 4A). SHP2 se compose de trois domaines indépendants : deux domaines SH2 et le domaine catalytique (Figure 1). Dans la conformation fermée autoinhibited ces domaines s’associent eux-même ; la transition de fusion observée dans l’expérience de pr...

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Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

La capacité d’évaluer l’engagement cible par les inhibiteurs candidats dans les cellules intactes est cruciale pour la découverte de médicaments. Ce protocole décrit un test de décalage thermique cellulaire de format 384 qui détecte de façon fiable l’engagement cellulaire des inhibiteurs ciblant soit le SHP2 de type sauvage, soit ses variantes oncogènes.

Évaluation de l’engagement des cibles cellulaires par inhibiteurs de la phosphatase SHP2 (PTPN11)

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

La tyrosine phosphatase SHP2, est un médiateur clé de la signalisation cellulaire, la promotion de la survie cellulaire et la prolifération. Mon équipe se concentre sur la recherche de petites molécules inhibiteurs du SHP2 pour le traitement du cancer. Notre technique fournit une méthode rapide et puissante pour établir des pénétrirants cellulaires, ainsi que l’engagement cible de petites molécules inhibiteurs du SHP2, dans les cellules.Ceci est assuré, les ressources de découverte sont dirigées efficacement. SHP2 comme une cible attrayante pour la thérapie contre le cancer. Et plusieurs inhibiteurs du SHP2.sont en essais cliniques.Notre technique pour faciliter la découverte d’inhibiteurs de prochaine génération avec des profils d’efficacité améliorés. Celeste Romero, assistante de recherche, et Douglas Sheffler, professeur adjoint de recherche, de notre laboratoire, feraient une démonstration à la procédure. Pour commencer à détacher hek293 T-cellules des plaques, en utilisant trois millilitres de réaccélément de détachement cellulaire.Diluer les cellules avec 12 millilitres de supports de croissance, et les recueillir par centrifugation à 1400 fois G, pendant quatre minutes. Resuspendez le palais cellulaire en 10 millilitres de supports de croissance et mesurez la concentration et la viabilité des cellules avec du bleu trypan et un compteur cellulaire. Plaque 700 000 cellules de croissance exponentielle dans chaque puits d’une plaque de culture de six puits et les incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, et 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain, diluer deux microgrammes d’ADN plasmatique en 200 microlitres de tampon transfection. Vortex l’ADN plasmatique pendant 10 secondes et le centraliser à 1400 fois G pendant quatre minutes. Ajouter quatre microlitres de réaccente de transfection à l’ADN dilué.Vortex pendant 10 secondes, et répéter la centrifugation. Incuber l’ADN à 23 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis ajouter le mélange de transfection aux cellules T HEK293 attachées dans la plaque de six puits, et retourner les cellules à l’incubateur pendant encore 24 heures. Pour préparer des plaques d’analyse, diluer les solutions d’inhibiteur dans DMSO, pour une concentration de stock de 10 millimolaires et les distribuer dans une plaque source de 384 puits à faible volume mort, pour une utilisation immédiate.Repérait le volume désiré d’inhibiteurs ou de véhicule, à l’aide d’un gestionnaire liquide dans 384 plaques PCR bien en temps réel à un volume final cible inférieur à 0,5 %DMSO. Sceller les plaques à l’aide d’un scellant à plaque avec purge au gaz inerte. Préparer les cellules transfectées précuber les supports de croissance et vendre le reagent de détachement dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius.Retirer les cellules de l’incubateur et aspirer doucement le média des puits. Ajouter 0,3 millilitres de réaccente de détachement cellulaire à chaque puits et faire basculer doucement la plaque d’avant en arrière pour couvrir complètement la surface du fond de la plaque. Incuber la plaque à 23 degrés Celsius pendant deux minutes.Ajouter un millilitre de supports de croissance à chaque puits, et pipette doucement les cellules dans le puits. Ensuite, transférez-les dans un tube de centrifugeuse Falcon de 15 millilitres Centrifugeuse les cellules à 1400 fois G pendant quatre minutes pour recueillir les cellules. Aspirez doucement le média, puis resuspendez la pastille cellulaire en deux millilitres de supports de croissance.Assurez-vous que la viabilité de la cellule est supérieure à 90% en utilisant essayez pan bleu et un compteur cellulaire. Diluer les cellules à une concentration de 125 cellules par microlitre, en gardant les cellules en suspension pendant au plus deux heures pour une viabilité optimale. Pour l’incubation avec des inhibiteurs du SHP2, distribuez les cellules dans une auge stérile de solution à canal unique.Centrifugeuse la plaque PCR bien préparée précédemment en temps réel à 2 500 fois G pendant cinq minutes, puis retirez le joint et utilisez une pipette multicanal de 125 microlitres, pour ajouter cinq microlitres des cellules diluées aux puits désirés. Centrifuger la plaque à 42 fois G pendant 30 secondes sans couvercle, puis fixer un couvercle et incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Programmez le cycleur Thermo, selon les instructions manuscrites pour le gradient de profil thermique ou l’expérience isothermale.Démarrez le programme d’impulsion thermique thermocycler et placez la plaque d’essai sur le bloc thermique. Lorsque le programme est terminé, retirez la plaque d’analyse. Compléter chaque puits de la plaque d’essai avec cinq microlitres de mélange maître de détection sous licence.Centrifugez la plaque à 42 fois G pendant 30 secondes, et stockez-la à 23 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 à 60 minutes. Mesurez la chimioluminescence à l’aide d’un lecteur de microplaque avec le temps d’intégration optimisé. L’expérience de gradient thermique pour le type sauvage SHP2, a abouti à un profil thermique cellulaire sigmoïdal avec une transition de fusion étroite qui est typique pour une protéine pliée.Incubation de type sauvage SHP2 avec l’inhibiteur allosterique SHP099, stabilisée au profil thermique à un degré significatif et mesurable. La stabilisation de SHP2, également suivi avec la puissance de SHP099 comme les composés allotériques. À 10 micromolar, le RMC-4550 plus puissant, a produit un plus grand degré de stabilisation que SHP099 pour le type sauvage SHP2.En raison de leur mécanisme unique, SHP099 comme les inhibiteurs allosteriques sont moins efficaces contre de nombreux mutants oncogènes SHP2, y compris SHP2-E76K. Conformément à ces propriétés connues, seule la stabilisation thermique marginale de SHP2-E76K par SHP099 est observée. Le niveau d’expression de la protéine d’étiquette EPL peut influencer considérablement l’intensité du signal.Profils thermiques pour les cellules de type sauvage transitoires et durablement intégrées. dans des conditions d’actifs identiques sont indiquées. La normalisation des courbes disparates offre des profils thermiques comparables, révélant la large gamme du système de détection EFC.Profitant de la capacité du cycleur thermique pour produire des gradients thermiques sur l’axe court d’une plaque de puits 384. une série de titrations isothermales peut être effectuée sur une seule plaque. À une température optimale, une titration isothermale utilisant une dose-réponse complète de 10 points, a donné un EC50 utile, pour RMC-4550.Les principes de cet actif pourraient être utilisés pour surveiller la dégradation des protéines dans les cellules, induite par les composés PROTAC. Nous utilisons la technique cellulaire de décalage de Thelma pour découvrir des inhibiteurs du SHP2 mutant et des leucémies, les drogues spécifiques contre les mutants oncogènes fréquents de SHP2 auront un impact significatif pour le traitement de ces cancers.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Évaluation de la résistance aux inhibiteurs de Tyrosine Kinase par un interrogatoire des voies de Transduction de Signal par les alignements d’anticorps

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Cellulaire et acellulaire poumon modèle pour étudier les métastases tumorales

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Utilisation de microréseaux pour interroger l'impact microenvironnemental sur les phénotypes cellulaires dans le cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort dans les cultures sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...