Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (an L. T.), Epstein Family Foundation Award (an N. D. P.C.) und NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Darüber hinaus wurde dieses Projekt ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, im Rahmen des Chemical Biology Consortium Contract No finanziert. HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

1. Herstellung von Zellkultur und Reagenzien
<ol><li>Formulieren Sie eine 500 ml Flasche Wachstumsmedien mit 10% fetalem Rinderserum, 1x Antibiotikum/Antimicotika, 20 mM HEPES und 1 mM Natriumpyruvat. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Tauen Sie zelluläre thermische Schichtreagenzien (EA-Reagenz, Lysepuffer und Substrat) aus gefrorenen Original-Lagerflaschen.</li>
	<li>Reagenzien und Puffer als 2 ml Aliquots abgeben und bei -20 °C lagern. HINWEIS: Vermeiden Sie Einfrieren/Tauen für die Reproduzierbarkeit und verwenden S...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

Wir haben einen Ziel-Engagement-Assay vorgestellt, der die direkte Bindung kleiner Moleküle an die SHP2-Phosphatase in Zellen bestätigen kann. Der Test kann zwischen niedrigen und hohen Affinitätshemmern unterscheiden und, was wichtig ist, einen Mangel an Wirksamkeit durch die allosterischen Inhibitoren des SHP099-Typs für die GOF onkogene SHP2-E76K Mutant bestätigen. Eine Stärke dieses miniaturisierten Assays ist seine Fähigkeit, in eine SHP2-Hemmer-Screening-Kampagne integriert zu werden. Die Fähigkeit des Assa...

Tyrosin-Phosphorylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion in den Zellen1,2. Diese posttranslationale Modifikation wird durch Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs) katalysiert und durch Protein-Tyrosinphosphatasen (PTP) umgekehrt. Daher führt abnorme PTK- oder PTP-Funktion zu vielen vererbten oder erworbenen menschlichen Krankheiten3,4,5,6. Die Src-homology 2 (SH2) domänenhaltige Phosphatase 2 (SHP2) ist ein weit verbreiteter Nicht-Rezeptor-Typ PTP, der vom Proto-Onkogen PTP117 kodiert wird und ein wichtiger Regulator zahlreicher physiologischer Prozesse ist, die Signaltransduktion durch Aktivierung der Ras/Raf/ERK,PI3K/Akt oder JAK/STAT-Signalwege8beinhalten. Normalerweise ist die SHP2-Aktivität streng reguliert, um eine abnorme Signalisierung zu verhindern. Unter basalen Bedingungen wird SHP2 durch seine N-Terminal-DOMÄNE SH2 automatisch gehemmt, die den Zugriff auf den aktiven Standort innerhalb der katalytischen Phosphatase-Domäne blockiert (Abbildung 1A)9,10. Bei der Zellaktivierung rekrutieren Tyrosinphosphorylbindungsproteine SHP2, wodurch es seine aktive Konformation annimmt, bei der die aktive Stelle nun für ihre Substrate zugänglich ist. Bei vielen Krebsarten ist die SHP2-Aktivität erhöht. Somatische Gain-of-Function-Mutationen (GOF) in PTPN11 wurden hauptsächlich bei Leukämien identifiziert und verhindern die Bindung der N-SH2-Domäne an die Phosphatase-Domäne, was zu konstitutiv aktivem SHP2 (Abbildung 1B)11 führt. Germline GOF-Mutationen in PTPN11 sind verantwortlich für 50% der Fälle von Noonan-Syndrom, eine Entwicklungsstörung mit einem erhöhten Risiko für Malignität12. Bei soliden Tumoren, bei denen PTPN11-Mutationen selten sind, führen höhere Konzentrationen phosphorylierter Bindungsproteine zu einer verbesserten SHP2-Aktivität (Abbildung 1C). SHP2 ist auch wichtig für die Immun-Checkpoint-Signalisierung, da Checkpoint-Rezeptoren wie BTLA oder PD-1 SHP2 rekrutieren, um wichtige Signalmoleküle zu dephosphorisieren und die Aktivierung von Immunzellen zu verhindern13,14,15.
Die Ausrichtung von PTPs mit kleinen Molekülen war eine Herausforderung, da die aktive Stelle von PTPs hochkonserviert und hoch aufgeladen ist; Inhibitoren, die auf die aktive Stelle abzielen, sind oft potent, weisen jedoch eine schlechte Selektivität und orale Bioverfügbarkeitauf 16,17,18,19,20,21,22. Tatsächlich leiden viele berichtete SHP2-Hemmer an schlechter Selektivität und mangelnder Wirksamkeit in den Zellen23. Kürzlich wurden allosterische Inhibitoren von SHP2 mit guter Potenz und ausgezeichneter Selektivität berichtet (z. B. SHP09924 und RMC-455025) und haben erneutes Interesse an SHP2-Inhibitoren geweckt. Verbindungen auf Basis von SHP099 und RMC-4550 befinden sich derzeit in klinischen Phase-I-Studien zur Behandlung solider Tumoren mit Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) Signalwegaktivierung26,27. Während wegweisend, Diese Verbindungen sind unwirksam gegen viele der SHP2 onkogene Erbmutanten, die Leukemogenese bei einer signifikanten Anzahl von Blutkrebspatienten28,29,30. Dieser Mangel an Potenz von SHP099-ähnlichen Verbindungen gegenüber den sHP2 onkogenen Varianten ergibt sich aus ihrem einzigartigen allosterischen Mechanismus, da sie die SHP2-Aktivität hemmen, indem sie die inaktive, geschlossene Konformation binden und stabilisieren, die in SHP2-Mutanten gestört wird. Darüber hinaus sind auf der Grundlage eines aktuellen Berichts31adaptive Resistenzmechanismen bei Patienten, die mit SHP099-ähnlichen Inhibitoren behandelt wurden, durchaus denkbar. Folglich ist die Entwicklung von SHP2-Inhibitoren der nächsten Generation, die auf ihren aktiven, offenen Zustand abzielen, Gegenstand intensiver Forschung.
Die Charakterisierung neuartiger SHP2-Inhibitoren in Zellen ist ein wesentlicher Aspekt des Lead-Optimierungsprozesses. Entscheidend ist, dass das bewährte Zielengagement des Inhibitors unter physiologischen Bedingungen ein zusätzliches Maß an Vertrauen dafür bietet, dass Ressourcen für die medizinische Chemie effizient auf Verbindungen mit vielversprechender zellulärer Wirksamkeit eingesetzt werden. In der Vergangenheit wurden mehrere Methoden zur Beurteilung der Bindung kleiner Molekülinhibitoren an ihre Targets entwickelt, vor allem für Proteinkianasen32. Um einen SHP2-Zellziel-Engagement-Assay zu entwickeln, haben wir einen zellulären thermischen Schichttest33verwendet. Dieser Assay, ähnlich wie der In-vitro-Thermoshift-Assay (PTS) für Proteine34, überwacht die thermische Stabilität des Zielproteins, die typischerweise durch die Bindung kleiner Moleküle verändert wird. Der ursprüngliche Assay ist ein Test mit niedrigem Durchsatz, der Antikörper nutzt, um den Zielproteinspiegel zu quantifizieren. Alternativ haben wir uns für eine kürzlich gemeldete Variante des thermischen Schicht-Assays entschieden, die eine β-Galactosidase-Enzymfragmentkomplementierung (EFC) verwendet (Abbildung 2)35. Für diese Experimente wird das Protein von Interesse in Zellen als N- oder C-terminales Fusionsprotein mit einem verbesserten ProLabel-Tag (ePL, einem 42-Aminosäure-Fragment von β-Galactosidase) ausgedrückt. Die Zellen werden dann auf 384-Well-PCR-kompatible Platten übertragen und mit verbindungen von Interesse inkubiert. Ein Thermocycler wird verwendet, um einen Temperaturgradienten auf die Zellen anzuwenden, deren Proteine denaturieren und aggregieren, wenn die Temperatur aufgrund ihrer thermischen Stabilität steigt. Die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung, das Protein von Interesse zu binden und zu stabilisieren, führt zu einer erhöhten thermischen Stabilität dieses Proteins. Daher bleiben nach der Lyse der Zellen die getaggten Proteine, die durch eine Kandidatenverbindung stabilisiert wurden, bei höheren Temperaturen in Lösung als markierte Proteine von Zellen, die mit Fahrzeugkontrolle inkubiert werden. Reporter-Enzym-Akzeptor (EA) ist in der Lage, die löslichen ePL-markierten Proteine zu ergänzen, was zu einer nachweisbaren β-Galactosidase-Aktivität mit einem Lumineszenzsubstrat führt.
Wir haben vor kurzem einen robusten zellulären thermischen Schichttest für Wildtyp SHP2 (SHP2-WT) und eine häufige SHP2 onkogene Variante (SHP2-E76K) in einem miniaturisierten 384-Well-Format36entwickelt. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll dieses Assays, das das Zielengagement von SHP2-Inhibitoren in Zellen zuverlässig erkennt und einen hohen Grad an Korrelation zwischen Inhibitor-Potenz und zellulären thermischen Schichtdaten aufzeigt. Der allgemeine Assay-Workflow ist in Abbildung 3dargestellt. Unsere Plattform verwendet N-terminalmarkierte ePL-SHP2-Fusionsproteine in voller Länge. Zur Erzeugung der entsprechenden pICP-ePL-N-SHP2-WT und pICP-ePL-N-SHP2-E76K Expressionsplasmide finden Sie in unserer aktuellen Publikation36. Dieser Test kann mit einem thermischen Gradienten durchgeführt werden, um SHP2-Thermoprofile zu erstellen und SHP2-Schmelztemperaturen in Gegenwart oder Abwesenheit von Inhibitoren zu bestimmen. Sobald thermische Profile erstellt wurden, kann es auch unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden, so dass Inhibitor Dosis-Wirkungs-Bewertung. Beide Arten von Experimenten werden im Folgenden beschrieben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

Die vom PTPN11 Proto-Onkogen kodierte Src-Homologie 2 (SH2) ist ein wichtiger Vermittler der Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK)-gesteuerte Zellsignalisierung, die das Überleben und die Proliferation von Zellen fördert. Darüber hinaus wird SHP2 von Immun-Check-Point-Rezeptoren rekrutiert, um die Aktivierung von B- und T-Zellen zu hemmen. Aberrant SHP2 Funktion wurde in die Entwicklung, Progression, und Metastasierung vieler Krebsarten beteiligt. Tatsächlich sind kleine Molekül-SHP2-Inhibitoren kürzlich in klinische Studien zur Behandlung von soliden Tumoren mit Ras/Raf/ERK-Signalwegaktivierung eingetreten, einschließlich Tumoren mit einigen onkogenen Ras-Mutationen. Jedoch, die aktuelle Klasse der SHP2-Inhibitoren ist nicht wirksam gegen die SHP2 onkogene Varianten, die häufig bei Leukämien auftreten, und die Entwicklung von spezifischen kleinen Molekülen, die oncogenic SHP2 zielen, ist das Thema der aktuellen Forschung. Ein häufiges Problem mit den meisten Arzneimittel-Entdeckungskampagnen mit zytosolischen Proteinen wie SHP2 ist, dass die primären Assays, die chemische Entdeckung vorantreiben, oft In-vitro-Assays sind, die nicht über das zelluläre Zielengagement von Kandidatenverbindungen berichten. Um eine Plattform zur Messung des zellulären Zielengagements zu bieten, haben wir sowohl Wildtyp- als auch mutierte SHP2-Zell-Thermoschicht-Assays entwickelt. Diese Assays detektieren zuverlässig die Zielinteraktion von SHP2-Inhibitoren in Zellen. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll dieses Assays zur Verfügung, das ein wertvolles Werkzeug für die Bewertung und Charakterisierung von SHP2-Inhibitoren darstellt.

Das thermische Gradientenexperiment für SHP2-WT führte zu einem sigmoidalen zellulären thermischen Profil mit einem schmalen Schmelzübergang, der typisch und konsistent für ein gefaltetes Protein ist (Abbildung 4A). SHP2 besteht aus drei unabhängigen Domänen: zwei SH2-Domänen und der katalytischen Domäne (Abbildung 1). In der automatisch hemmenden geschlossenen Konformation werden diese Domänen selbst assoziiert; der schmelzübergang, der im thermische...

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Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Die Fähigkeit, das Zielengagement von Kandidateninhibitoren in intakten Zellen zu bewerten, ist entscheidend für die Entdeckung von Arzneimitteln. Dieses Protokoll beschreibt einen 384 gut formatierten zellulären thermischen Schichttest, der zuverlässig die zelluläre Zielinteraktion von Inhibitoren erkennt, die entweder auf Den Wildtyp SHP2 oder seine onkogenen Varianten abzielen.

Bewertung des zellulären Zielengagements durch SHP2 (PTPN11) Phosphatase-Inhibitoren

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Die Tyrosinphosphatase SHP2, ist ein wichtiger Vermittler der zellulären Signalisierung, Förderung des Zellüberlebens und der Proliferation. Mein Team konzentriert sich auf die Suche nach kleinen Molekül-SHP2-Hemmern für die Behandlung von Krebs. Unsere Technik bietet eine schnelle und leistungsfähige Methode, um Zell-Penetrante zu etablieren, sowie Zielengagement von kleinen Molekül-SHP2-Inhibitoren, in Zellen.Dadurch wird sichergestellt, dass Ermittlungsressourcen effizient gesteuert werden. SHP2 als attraktives Ziel für die Krebstherapie. Und mehrere SHP2-Hemmer befinden sich in klinischen Studien.Unsere Technik, um die Entdeckung von Inhibitoren der nächsten Generation mit verbesserten Wirksamkeitsprofilen zu erleichtern. Die Verfahrensweise würden Celeste Romero, wissenschaftliche Mitarbeiterin, und Douglas Sheffler, wissenschaftlicher Assistenzprofessor, aus unserem Labor demonstrieren. Um mit drei Millilitern Zellablösungsreagenz zu beginnen, heK293 T-Zellen von den Platten zu lösen.Verdünnen Sie die Zellen mit 12 Milliliter Wachstumsmedien und sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 1, 400 mal G, für vier Minuten. Setzen Sie den Zellpalate in 10 Milliliter Wachstumsmedien aus und messen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau und einem Zellzähler. Platte 700. 000 exponentiell wachsende Zellen in jeden Brunnen einer sechs Brunnenkulturplatte und bebrütet sie für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Am nächsten Tag zwei Mikrogramm Plasma-DNA in 200 Mikroliter Transfektionspuffer verdünnen. Wirbeln Sie die Plasma-DNA für 10 Sekunden und zentralflieren Sie sie bei 1, 400 mal G für vier Minuten. Fügen Sie der verdünnten DNA vier Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu.Wirbeln Sie es für 10 Sekunden, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Inkubieren Sie die DNA bei 23 Grad Celsius für 10 Minuten, fügen Sie dann die Transfektionsmischung zu den angeschlossenen HEK293 T-Zellen in der sechs Brunnenplatte hinzu und geben Sie die Zellen für weitere 24 Stunden in den Inkubator zurück. Zur Herstellung von Assayplatten, verdünnen Inhibitorlösungen in DMSO, für eine Lagerkonzentration von 10 Millimolar und geben Sie sie in eine 384 gut niedrige Totvolumen-Quellplatte, für den sofortigen Gebrauch.Entdecken Sie das gewünschte Volumen von Inhibitoren oder Fahrzeug, mit einem Flüssigkeitshandler in 384 gut Echtzeit-PCR-Platten bei einem Ziel-Endvolumen von weniger als 0,5%DMSO. Versiegeln Sie die Platten mit einem Plattenversiegeler mit Inertgasspülung. Um die transfizierten Zellen vorzubereiten, brüten Wachstumsmedien vor und verkaufen Ablösungsreagenz in einem 37 Grad Celsius Wasserbad.Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen Sie die Medien vorsichtig aus den Brunnen. Fügen Sie 0,3 Milliliter des Zellablösungsreagenz zu jedem Brunnen hinzu und schaukeln Sie die Platte sanft hin und her, um die Oberfläche des Plattenbodens gründlich zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte bei 23 Grad Celsius für zwei Minuten.Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter Wachstumsmedien hinzu und pipetten Sie die Zellen im Brunnen sanft. Dann übertragen Sie sie in eine 15 Milliliter Falcon Zentrifugenrohr Zentrifuge die Zellen bei 1, 400 mal G für vier Minuten, um die Zellen zu sammeln. Saugen Sie die Medien vorsichtig an, und setzen Sie das Zellpellet in zwei MilliliterWachstumsmedien wieder aus.Stellen Sie sicher, dass die Zelllebensfähigkeit größer als 90 % ist, indem Sie Try Pan Blue und einen Zellzähler verwenden. Verdünnt Zellen auf eine Konzentration von 125 Zellen pro Mikroliter, so dass die Zellen für eine optimale Lebensfähigkeit nicht länger als zwei Stunden in Suspension gehalten werden. Für die Inkubation mit SHP2-Inhibitoren, geben Sie die Zellen in eine sterile Einkanal-Lösung Trog.Zentrifugieren Sie die zuvor vorbereitete 384 gut Echtzeit-PCR-Platte bei 2, 500 mal G für fünf Minuten, dann entfernen Sie die Dichtung und verwenden Sie eine 125 Mikroliter Mehrkanal-Pipette, um fünf Mikroliter der verdünnten Zellen zu den gewünschten Wells hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 42 mal G für 30 Sekunden ohne Deckel, dann befestigen Sie einen Deckel und inkubieren Sie die Platte für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Programmieren Sie den Thermo-Cycler nach Manuskriptrichtungen für den thermischen Profilgradienten oder das isotherme Experiment.Starten Sie das Thermocycler-Wärmepulsprogramm und legen Sie die Assayplatte auf den Thermoblock. Wenn das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Assay-Platte. Ergänzen Sie jeden Brunnen der Assayplatte mit fünf Mikroliterlizenzierten Detektionsmaster-Mix.Zentrifugieren Sie die Platte bei 42 mal G für 30 Sekunden, und lagern Sie sie bei 23 Grad Celsius in der Dunkelheit für 30 bis 60 Minuten. Messen Sie die Chemilumineszenz mit einem Mikroplattenleser mit der optimierten Integrationszeit. Das thermische Gradientenexperiment für den Wildtyp SHP2 führte zu einem sigmoidalen zellulären thermischen Profil mit einem schmalen Schmelzübergang, der typisch für ein gefaltetes Protein ist.Inkubation des wilden Typs SHP2 mit dem allosterischen Inhibitor SHP099, stabilisiert auf das thermische Profil in signifikantem und messbarem Maße. Die Stabilisierung von SHP2, auch mit der Potenz von SHP099 wie allosterische Verbindungen verfolgt. Bei 10 Mikromolaren erzeugte der stärkere RMC-4550 einen höheren Stabilisierungsgrad als SHP099 für Wildtyp SHP2.Aufgrund ihres einzigartigen Mechanismus, SHP099 wie allosterische Inhibitoren sind weniger wirksam gegen viele SHP2 onkogene Mutagene, einschließlich SHP2-E76K. In Übereinstimmung mit diesen bekannten Eigenschaften wird nur eine marginale thermische Stabilisierung von SHP2-E76K durch SHP099 beobachtet. Der Expressionspegel des EPL-Tag-Proteins kann die Signalintensität dramatisch beeinflussen.Thermische Profile für transiente und stabil integrierte Wildtypzellen. unter identischen Asset-Bedingungen angezeigt. Die Normalisierung der unterschiedlichen Kurven ermöglicht vergleichbare thermische Profile und zeigt die große Bandbreite des EFC-Erkennungssystems auf.Nutzung der thermischen Cycler-Fähigkeit, thermische Gradienten auf der kurzen Achse einer 384-Wellplatte zu erzeugen. eine Reihe von isothermen Titrationen kann auf einer einzigen Platte durchgeführt werden. Bei optimaler Temperatur ergab eine isotherme Titration mit einem vollen 10-Punkt-Dosis-Response einen nützlichen EC50 für RMC-4550.Die Prinzipien dieses Vermögenswerts könnten verwendet werden, um den Abbau von Proteinen in Zellen zu überwachen, induziert durch PROTAC-Verbindungen. Wir verwenden zelluläre Thelma-Schichttechnik, um Inhibitoren von mutiertem SHP2 und Leukämien zu entdecken, Medikamente, die spezifisch gegen häufige SHP2-Onkogene Mutagene sind, die einen signifikanten Einfluss auf die Behandlung dieser Krebsarten haben werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Forschung

Krebsforschung

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Verwendung von Mikroarrays zur Vernehmung von Mikroumweltauswirkungen auf zelluläre Phänotypen bei Krebs

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...