Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (a L. T.), Epstein Family Foundation Award (a N. D. P.C.) e NSC Cancer Center Support Grant P30CA030199. Inoltre, questo progetto è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, nell'ambito del contratto n. del consorzio di biologia chimica. HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani, né la menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.

1. Preparazione della coltura cellulare e dei reagenti
<ol><li>Formulare una bottiglia da 500 ml di mezzi di crescita con siero bovino fetale al 10%, 1x antibiotico/antimicotico, 20 mM HEPES e 1 mM di piruvato di sodio. Conservare a 4 °C.</li>
	<li>Scongelare i reagenti di spostamento termico cellulare (reagente EA, tampone di lysis e substrato) da bottiglie di magazzino originali congelate.</li>
	<li>Erogare reagenti e tamponare come aliquote da 2 mL e conservare a -20 °C. NOTA: Evitare il congelamento/scongelame...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tyrosine+Phosphatases:+Time+to+End+the+Stigma.">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li><li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction.">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li><li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase.">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li><li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+phosphatase+Shp2+(PTPN11)+in+cancer.">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li><li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li><li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li><li>Neel, B. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors.">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases.">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

Abbiamo presentato un saggio di coinvolgimento target in grado di confermare il legame diretto di piccole molecole alla fosfatasi SHP2 nelle cellule. Il saggio può discriminare tra inibitori a bassa e alta affinità e, cosa importante, confermare una mancanza di potenza da parte degli inibitori allosterici del tipo SHP099 per il mutante oncogenico GOF SHP2-E76K. Un punto di forza di questo test miniaturizzato è la sua capacità di essere integrato in una campagna di screening inibitore SHP2. La capacità del saggio di ...

La fosforilazione della tirosina svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale nellecelle 1,2. Questa modifica post-traslazionale è catalizzata da proteina tirosina chinasi (PTT) e invertita da proteina tirosina fosfatasi (PTP). Pertanto, la funzione PTK o PTP aberrante porta a molte malattie umane ereditarie o acquisite3,4,5,6. La Src-omologia 2 (SH2) contenente il dominio fosfatasi 2 (SHP2) è un PTP di tipo non recettore ampiamente espresso codificato dal proto-oncogene PTPN117 ed è un regolatore chiave di numerosi processi fisiologici che comportano la trasduzione del segnale tramite attivazione delle vie di segnalazione Ras/ Raf / ERK, PI3K / Akt o JAK / STAT8. Normalmente, l'attività SHP2 è strettamente regolata al fine di prevenire la segnalazione aberrante. In condizioni basali SHP2 è autoibitato dal suo dominio SH2 N-terminale, che blocca l'accesso al sito attivo all'interno del dominio della fosfatasi catalitica (Figura 1A)9,10. Al momento dell'attivazione cellulare, le proteine leganti fosforilate della tirosina reclutano SHP2, facendolo adottare la sua conformazione attiva, in cui il sito attivo è ora accessibile ai suoi substrati. In molti tumori l'attività SHP2 è elevata. Mutazioni del guadagno di funzione somatico (GOF) in PTPN11 sono state identificate principalmente nelle leucemie e impediscono il legame del dominio N-SH2 al dominio fosfatasi, con conseguente SHP2 costitutivamente attivo (Figura 1B)11. Le mutazioni gof germinali in PTPN11 sono responsabili di ~ 50% dei casi di sindrome di Noonan, un disturbo dello sviluppo con un aumento del rischio di malignità12. Nei tumori solidi, dove le mutazioni di PTPN11 sono rare, maggiori livelli di proteine leganti fosforilate portano ad una maggiore attività SHP2 (Figura 1C). SHP2 è anche importante per la segnalazione del checkpoint immunitario, poiché i recettori del checkpoint come BTLA o PD-1 reclutano SHP2 per defosforilato le molecole di segnalazione della chiave, impedendo l'attivazionedelle cellule immunitarie 13,,14,,15.
Indirizzare i PTP con piccole molecole è stata una sfida, perché il sito attivo dei PTP è altamente conservato e altamente carico; gli inibitori che prendono di mira il sito attivo sono spesso potenti, ma mostrano scarsa selettività e biodisponibilità orale16,,17,,18,,19,,20,,21,,22. Infatti, molti inibitori di SHP2 segnalati soffrono di scarsa selettività e mancanza di efficacia nelle cellule23. Recentemente, sono stati segnalati inibitori allosterici di SHP2 con buona potenza e eccellente selettività (ad esempio, SHP09924 e RMC-455025) e hanno suscitato un rinnovato interesse per gli inibitori di SHP2. I composti a base di SHP099 e RMC-4550 sono attualmente in fase I studi clinici per trattare tumori solidi con attivazione del percorso della tirosina chinasi recettore (RTK)26,,27. Sebbene innovativi, questi composti sono inefficaci contro molti dei mutanti oncogenici SHP2 che guidano la leucemogenesi in un numero significativo di pazienti con cancro delsangue 28,29,30. Questa mancanza di potenza dei composti simili a SHP099 verso le varianti oncogeniche SHP2 deriva dal loro meccanismo allosterico unico, in quanto inibiscono l'attività SHP2 legando e stabilizzando la conformazione inattiva e chiusa, che viene interrotta nei mutanti SHP2. Inoltre, sulla base di un recente rapporto31, i meccanismi di resistenza adattativa nei pazienti trattati con inibitori simili a SHP099 sono del tutto concepibili. Di conseguenza, lo sviluppo di inibitori SHP2 di nuova generazione che prendono di mira il suo stato attivo e aperto è oggetto di intense ricerche.
La caratterizzazione di nuovi inibitori SHP2 nelle cellule è un aspetto essenziale del processo di ottimizzazione del piombo. Criticamente, l'impegno target comprovato dell'inibitore in condizioni fisiologiche fornisce un ulteriore livello di fiducia nel fatto che le risorse per la chimica medicinale siano utilizzate in modo efficiente su composti con promettente efficacia cellulare. In passato, sono stati sviluppati diversi metodi per valutare il legame degli inibitori di piccole molecole ai loro obiettivi, principalmente per le chinasi proteiche32. Per sviluppare un test di coinvolgimento del bersaglio cellulare SHP2, abbiamo utilizzato un saggio di spostamento termico cellulare33. Questo saggio, simile al saggio di spostamento termico in vitro (PTS) per le proteine34, monitora la stabilità termica della proteina bersaglio, che è tipicamente alterata dal legame di piccole molecole. Il saggio originale è un saggio a bassa produttività che utilizza anticorpi per quantificare i livelli proteici bersaglio. In alternativa, abbiamo scelto una variante recentemente riportata del saggio di spostamento termico che utilizza un saggio di complementazione dei frammenti enzimatici β-galattosidasi (EFC)(Figura 2)35. Per questi esperimenti, la proteina di interesse è espressa nelle cellule come una proteina di fusione N o C-terminale che porta un tag ProLabel migliorato (ePL, un frammento di 42 amminoacidi di β-galattosidasi). Le cellule vengono quindi trasferite in piastre compatibili con PCR a 384 pozzi e incubate con composti di interesse. Un termociclo viene utilizzato per applicare un gradiente di temperatura alle cellule, le cui proteine si denaturano e si aggregano man mano che la temperatura aumenta in base alla loro stabilità termica. La capacità di un composto candidato di legare e stabilizzare la proteina di interesse si tradurrà in una maggiore stabilità termica di quella proteina. Pertanto, a seguito della lisi delle cellule, le proteine taggate che sono state stabilizzate da un composto candidato rimarranno in soluzione a temperature più elevate rispetto alle proteine taggate delle cellule incubate con il controllo del veicolo. L'accettore enzimatico Reporter (EA) è in grado di integrare le proteine solubili taggate ePL, risultando in un'attività rilevabile β-galattosidasi utilizzando un substrato di luminescenza.
Recentemente abbiamo sviluppato un robusto test di spostamento termico cellulare per SHP2 di tipo selvaggio (SHP2-WT) e una frequente variante oncogenica SHP2 (SHP2-E76K) in un formato miniaturizzato 384-well36. Qui, reportiamo un protocollo dettagliato di questo saggio, che rileva in modo affidabile l'impegno del bersaglio da parte degli inibitori SHP2 nelle cellule e dimostra un alto grado di correlazione tra la potenza dell'inibitore e i dati dello spostamento termico cellulare. Il flusso di lavoro generale dei saggi è illustrato nella figura 3. La nostra piattaforma utilizza proteine di fusione ePL-SHP2 a lunghezza intera taggate n-terminale. Per la generazione dei corrispondenti plasmidi di espressione pICP-ePL-N-SHP2-WT e pICP-ePL-N-SHP2-E76K, fare riferimento alla nostra recente pubblicazione36. Questo test può essere eseguito utilizzando un gradiente termico per stabilire profili termici SHP2 e determinare le temperature di fusione SHP2 in presenza o assenza di inibitore. Una volta stabiliti i profili termici, può anche essere eseguito in condizioni isotermiche, consentendo la valutazione della dose-risposta dell'inibitore. Entrambi i tipi di esperimenti sono descritti di seguito.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

La fosfatasi 2 (SH2) contenente dominio Src-omologia 2 (SHP2), codificata dal proto-oncogene PTPN11, è un mediatore chiave della segnalazione cellulare guidata dalla tirosina chinasi recettore (RTK), promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Inoltre, SHP2 viene reclutato dai recettori dei punti di controllo immunitario per inibire l'attivazione delle cellule B e T. La funzione Aberrant SHP2 è stata implicata nello sviluppo, nella progressione e nella metastasi di molti tumori. Infatti, gli inibitori della piccola molecola SHP2 sono recentemente entrati in studi clinici per il trattamento di tumori solidi con attivazione della via Ras / Raf / ERK, compresi i tumori con alcune mutazioni ras oncogeniche. Tuttavia, l'attuale classe di inibitori dell'SHP2 non è efficace contro le varianti oncogeniche SHP2 che si verificano frequentemente nelle leucemie, e lo sviluppo di piccole molecole specifiche che prendono di mira l'SHP2 oncogenico è oggetto di ricerche attuali. Un problema comune con la maggior parte delle campagne di scoperta di farmaci che coinvolgono proteine citosoliche come SHP2 è che i test primari che guidano la scoperta chimica sono spesso saggi in vitro che non riportano l'impegno target cellulare dei composti candidati. Per fornire una piattaforma per misurare l'engagement del bersaglio cellulare, abbiamo sviluppato test di spostamento termico cellulare SHP2 sia di tipo selvaggio che mutante. Questi test rilevano in modo affidabile l'impegno target degli inibitori di SHP2 nelle cellule. Qui, forniamo un protocollo completo di questo saggio, che fornisce uno strumento prezioso per la valutazione e la caratterizzazione degli inibitori di SHP2.

L'esperimento del gradiente termico per SHP2-WT ha portato a un profilo termico cellulare sigmoidale con una stretta transizione di fusione tipica e coerente per una proteina piegata (Figura 4A). SHP2 è costituito da tre domini indipendenti: due domini SH2 e il dominio catalitico (Figura 1). Nella conformazione chiusa automaticamente inibita questi domini si associano automaticamente; la transizione di fusione osservata nell'esperimento del profilo termico rifl...

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Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

La capacità di valutare l'impegno target da parte degli inibitori candidati nelle cellule intatte è fondamentale per la scoperta di farmaci. Questo protocollo descrive un saggio di spostamento termico cellulare in formato 384 che rileva in modo affidabile l'impegno del bersaglio cellulare degli inibitori che prendono di mira SHP2 di tipo selvaggio o le sue varianti oncogeniche.

Valutazione dell'impegno del bersaglio cellulare da parte degli inibitori della fosfatasi SHP2 (PTPN11)

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

La fosfatasi tirosina SHP2, è un mediatore chiave della segnalazione cellulare, promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Il mio team si concentra sulla ricerca di inibitori SHP2 a piccole molecole per il trattamento del cancro. La nostra tecnica fornisce un metodo rapido e potente per stabilire penetranti cellulari, così come l'impegno bersaglio di inibitori SHP2 di piccole molecole, nelle cellule.Questo è assicurato, le risorse di individuazione sono dirette in modo efficiente. SHP2 come obiettivo attraente per la terapia del cancro. E diversi inibitori dell'SHP2, sono in sperimentazione clinica.La nostra tecnica per facilitare la scoperta di inibitori di nuova generazione con profili di efficacia migliorati. A dimostrare la procedura sarebbero Celeste Romero, assistente di ricerca e Douglas Sheffler, un assistente di ricerca professore, del nostro laboratorio. Per iniziare a staccare le cellule T HEK293 dalle piastre, usando tre millilitri di reagente di distacco cellulare.Diluire le cellule con 12 millilitri di mezzi di crescita e raccoglierle per centrifugazione a 1.400 volte G, per quattro minuti. Rimorsi il palato cellulare in 10 millilitri di mezzi di crescita e misurare la concentrazione e la vitalità delle cellule con tripano blu e un contatore cellulare. Placca 700.000 cellule in crescita esponenziale in ogni pozzo di una piastra di coltura di sei pozzi e incubale per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il giorno dopo, diluire due microgrammi di DNA plasmatico in 200 microlitri di tampone di trasfezione. Vortice il DNA plasmatico per 10 secondi e centralmentefugarlo a 1.400 volte G per quattro minuti. Aggiungere quattro microlitri di reagente di trasfezione al DNA diluito.Vortice per 10 secondi, e ripetere la centrifugazione. Incubare il DNA a 23 gradi Celsius per 10 minuti, quindi aggiungere il mix di trasfezione alle cellule HEK293 T attaccate nella piastra dei sei pozzi e riportare le cellule nell'incubatrice per altre 24 ore. Per preparare piastre di dosaggio, diluire le soluzioni inibitorie in DMSO, per una concentrazione di scorte di 10 millimolare e erogarle in una piastra sorgente a volume morto ben bassa 384, per un uso immediato.Individuare il volume desiderato di inibitori o veicoli, utilizzando un gestore liquido in 384 piastre PCR ben in tempo reale a un volume finale target inferiore allo 0,5%DMSO. Sigillare le piastre utilizzando un sigillare a piastre con spurgo di gas inerte. Per preparare le cellule trasfette pre incubare i mezzi di crescita e vendere reagente di distacco in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.Rimuovere le cellule dall'incubatore e aspirare delicatamente il supporto dai pozzi. Aggiungere 0,3 millilitri del reagente di distacco cellulare a ciascun pozzo e scuotere delicatamente la piastra avanti e indietro per coprire accuratamente la superficie del fondo della piastra. Incubare la piastra a 23 gradi Celsius per due minuti.Aggiungere un millilitro di mezzi di crescita a ciascun pozzo e pipettare delicatamente le cellule nel pozzo. Quindi trasferirli in un tubo di centrifuga Falcon da 15 millilitri Centrifugare le cellule a 1.400 volte G per quattro minuti per raccogliere le cellule. Aspirare delicatamente il supporto, quindi rimospendare il pellet cellulare in due millilitri di mezzi di crescita.Assicurarsi che la vitalità della cella sia maggiore del 90% utilizzando try pan blue e un contatore di cella. Diluire le cellule a una concentrazione di 125 cellule per microlitro, mantenendo le cellule in sospensione per non più di due ore per una vitalità ottimale. Per l'incubazione con inibitori SHP2, erogare le cellule in un trogolo sterile a canale singolo.Centrifugare la piastra PCR 384 ben in tempo reale preparata in precedenza a 2.500 volte G per cinque minuti, quindi rimuovere la guarnizione e utilizzare una pipetta multicanale da 125 microlitri, per aggiungere cinque microlitri delle celle diluite ai pozzi desiderati. Centrifugare la piastra a 42 volte G per 30 secondi senza coperchio, quindi attaccare un coperchio e incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Programmare il ciclore Thermo, secondo le indicazioni manoscritte per il gradiente del profilo termico o l'esperimento isotermico.Avviare il programma di impulsi termici del termociclo e posizionare la piastra di dosaggio sul blocco termico. Al termine del programma, rimuovere la piastra di dosaggio. Integrare ogni pozzo della piastra di dosaggio con cinque microlitri di mix master di rilevamento concesso in licenza.Centrifugare la piastra a 42 volte G per 30 secondi e conservarla a 23 gradi Celsius nell'oscurità per 30-60 minuti. Misura la chemiluminescenza utilizzando un lettore di micropiatte con il tempo di integrazione ottimizzato. L'esperimento del gradiente termico per il tipo selvaggio SHP2, ha portato a un profilo termico cellulare sigmoidale con una stretta transizione di fusione tipica di una proteina piegata.Incubazione di tipo selvatico SHP2 con l'inibitore allosterico SHP099, stabilizzato al profilo termico in misura significativa e misurabile. La stabilizzazione di SHP2, monitorata anche con la potenza di SHP099 come composti allosterici. A 10 micromolari, il più potente RMC-4550, produceva un grado di stabilizzazione maggiore rispetto a SHP099 per il tipo selvaggio SHP2.Grazie al loro meccanismo unico, SHP099 come gli inibitori allosterici sono meno efficaci contro molti mutanti oncogeni SHP2, tra cui SHP2-E76K. Coerentemente con queste proprietà note si osserva solo la stabilizzazione termica marginale di SHP2-E76K da parte di SHP099. Il livello di espressione della proteina tag EPL può influenzare drasticamente l'intensità del segnale.Profili termici per celle di tipo selvatico transitori e stabilmente integrate. in condizioni patrimoniali identiche. La normalizzazione delle curve disparate offre profili termici comparabili, rivelando l'ampia gamma del sistema di rilevamento EFC.Sfruttando la capacità del ciclore termico di produrre gradienti termici sull'asse corto di una piastra di pozzo 384. una serie di titolazioni isotermiche può essere eseguita su una singola piastra. Ad una temperatura ottimale, una titolazione isotermica utilizzando una risposta alla dose completa di 10 punti, ha prodotto un utile EC50, per RMC-4550.I principi di questa risorsa potrebbero essere utilizzati per monitorare la degradazione delle proteine nelle cellule, indotte da composti PROTAC. Stiamo usando la tecnica di spostamento thelma cellulare per scoprire gli inibitori del mutante SHP2 e delle leucemie, farmaci specifici contro i frequenti mutanti oncogenici SHP2 avranno un impatto significativo per il trattamento di questi tumori.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Valutazione della resistenza agli inibitori della tirosina chinasi di un interrogatorio di trasduzione del segnale da matrici di anticorpo

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modello del polmone acellulare e cellulari per lo studio di metastasi del tumore

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Utilizzo di microarray per interrogare l'impatto microambientale sui fenotipi cellulari nel cancro

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caratterizzare i mutanti correlati alla malattia di RAF Family Kinases utilizzando una serie di metodi pratici e fattibili

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...