Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
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この研究は、国立衛生研究所補助金1R21CA195422(L.T.)、エプスタインファミリー財団賞(N.D.P.C.)、NCIがんセンターサポートグラントP30CA030199によって支援されました。さらに、このプロジェクトは、化学生物学コンソーシアム契約No.の下で、国立がん研究所、国立衛生研究所からの連邦資金の全部または一部で資金提供されています。HHSN261200800001E.本書の内容は、必ずしも保健福祉省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商用製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を意味するものではありません。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

1. 細胞培養・試薬の製造
<ol><li>10%の牛血清、1x抗生物質/抗ミコティック、20 mM HEPES、および1 mMのナトリウムピルビン酸を用いて500mLの成長培地を処方する。4 °Cで保管。</li>
	<li>凍結したオリジナルストックボトルから、セルラー熱シフト試薬(EA試薬、溶汁バッファー、基材)を解凍します。</li>
	<li>試薬と緩衝液を2 mLアリコートとして分配し、-20°Cで保管する。 注:再現性のために凍結/解?...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tyrosine+Phosphatases:+Time+to+End+the+Stigma.">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li><li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction.">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li><li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase.">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li><li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+phosphatase+Shp2+(PTPN11)+in+cancer.">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li><li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li><li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li><li>Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).</li><li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PTPN11,+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2,+cause+Noonan+syndrome.">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1.">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li><li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases:+next-generation+drugs.">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li><li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase.">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li><li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+PTPome+in+human+disease.">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li><li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors.">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li><li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors.">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li><li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets:+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development.">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li><li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases.">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li><li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors.">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases.">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

細胞内のSHP2ホスファターゼへの低分子の直接結合を確認できる標的関与アッセイを発表しました。このアッセイは、低親和性阻害剤と高親和性阻害剤を区別し、重要なことに、GOF発癌性SHP2-E76K変異体に対するSHP099型のアロステリック阻害剤による効力の欠如を確認することができる。この小型アッセイの強みは、SHP2阻害剤スクリーニングキャンペーンに統合される能力です。未知の化学物?...

チロシンリン酸化は、細胞11,2におけるシグナル伝達において重要な役割を果たす。この翻訳後修飾は、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)によって触媒され、タンパク質チロシンホスファターゼ(Ptps)によって逆転されます。したがって、異常PTKまたはPTP機能は、多くの遺伝または獲得したヒト疾患33、4、5、64,5,6につながる。Src相モロジー2(SH2)ドメイン含有ホスファターゼ2(SHP2)は、プロトオンコジーンPTPN117によってコードされる広く発現された非受容体型PTPであり、Ras/Raf/ERK、PI3K/Akt、またはJAK/STATシグナル伝達経路の活性化によるシグナル伝達を伴う多数の生理学的プロセスの主要な調節因子である。通常、SHP2活性は異常なシグナル伝達を防ぐために厳しく調節される。基礎条件下ではSHP2はそのN末端SH2ドメインによって自動抑制され、触媒ホスファターゼドメイン内の活性部位へのアクセスをブロックする(図1A)9、10。9,10Figure 1A細胞活性化の際、チロシンリン酸化結合タンパク質はSHP2をリクルートし、活性な立体構造を採用し、活性部位がその基質にアクセスできるようになりました。多くの癌においてSHP2活性が上昇している。PTPN11における体細胞機能利得(GOF)突然変異は、主に白血病において同定されており、N-SH2ドメインのホスファターゼドメインへの結合を防止し、構成的に活性なSHP2(図1B)11を生じる。11PTPN11における生殖細胞系GOF突然変異は、ヌーナン症候群の症例の50%を担い、悪性腫瘍のリスクが高い発達障害である12。PTPN11変異がまれである固形腫瘍では、リン酸化結合タンパク質のレベルが高いほどSHP2活性が増強される(図1C)。SHP2は免疫チェックポイントシグナル伝達にも重要であり、BTLAやPD−1などのチェックポイント受容体は主要なシグナル伝達分子を脱リン酸化してSHP2をリクルートし、免疫細胞活性化13、14、1514,15を予防する。13
低分子のPtPsを標的にすることは、PtPsの活性部位が高度に保存され、高い荷電性を有するため、困難でした。活性部位を標的とする阻害剤は、しばしば強力であるが、不十分な選択性および経口バイオアベイラビリティ1616、17、18、19、20、21、22を示す。,17,18,19,20,21,22実際、報告された多くのSHP2阻害剤は、細胞23における選択性の低下と有効性の欠如に苦しんでいる。最近、優れた効力と優れた選択性を有するSHP2のアロステリック阻害剤(例えば、SHP09924およびRMC-455025)が報告され、SHP2阻害剤への新たな関心を引き起こしている。SHP099およびRMC-4550に基づく化合物は、現在、第I相臨床試験中に、受容体チロシンキナーゼ(RTK)経路活性化26,27,27で固形腫瘍を治療する。画期的な一方で、これらの化合物は、血液癌患者28、29、30,29,30のかなりの数の血液癌患者で白血病を駆動するSHP2発癌性変異体の多くに対して効果がない。SHP2発癌性変異体に対するSHP099様化合物の効力の欠如は、SHP2変異体で破壊される不活性で閉じた立体構造を結合して安定化させることによってSHP2活性を阻害するため、そのユニークなアロステリック機構に由来する。また、最近の報告31に基づいて、SHP099様阻害剤で治療された患者における適応抵抗機構は、かなり考えられる。その結果、その活性、開放状態を標的とする次世代SHP2阻害剤の開発は、激しい研究の対象となっている。
細胞内の新規SHP2阻害剤の特性評価は、リード最適化プロセスの不可欠な側面である。重要なことに、生理学的条件下での阻害剤の実証された標的関与は、薬用化学のリソースが有望な細胞有効性を有する化合物に効率的に展開されるというさらなる信頼を提供する。過去には、その標的に対する低分子阻害剤の結合を評価するいくつかの方法が開発されてきたが、主にプロテインキナーゼ32に対して。SHP2細胞標的エンゲージメントアッセイを開発するために、セルラー熱シフトアッセイ33を利用した。このアッセイは、タンパク質34に対するインビトロ熱シフト(PTS)アッセイと同様に、標的タンパク質の熱安定性を監視し、これは典型的には小分子の結合によって変化する。元のアッセイは、抗体を利用して標的タンパク質レベルを定量化する低スループットアッセイです。あるいは、β-ガラクトシダーゼ酵素フラグメント相補(EFC)アッセイを利用した熱シフトアッセイの最近報告された変異体を選択した(図2)35。35これらの実験では、目的のタンパク質は、増強されたProLabelタグ(ePL、βガラクトシダーゼの42アミノ酸断片)を運ぶN-またはC末端融合タンパク質として細胞内で発現される。細胞は384ウェルPCR適合プレートに移され、目的の化合物と共にインキュベートされます。サーモサイクラーは、細胞に温度勾配を適用するために利用され、そのタンパク質は熱安定性に基づいて温度が上昇するにつれて変性し、凝集する。候補化合物が目的のタンパク質に結合し安定化する能力は、そのタンパク質の熱安定性の向上をもたらす。したがって、細胞の溶解に続いて、候補化合物によって安定化されたタグ付きタンパク質は、車両制御でインキュベートされた細胞のタグ付きタンパク質よりも高い温度で溶液中に残る。レポーター酵素アクセプタ(EA)は、可溶性ePLタグ付きタンパク質を補体することができ、発光基質を用いた検出可能なβガラクトシダーゼ活性をもたらす。
我々は最近、384ウェル形式36で野生型SHP2(SHP2-WT)および頻繁なSHP2発癌変種(SHP2-E76K)用の堅牢なセルラー熱シフトアッセイを開発した。ここでは、細胞内のSHP2阻害剤による標的関与を確実に検出し、阻害力と細胞熱シフトデータとの間の高い相関を示すこのアッセイの詳細なプロトコルを報告する。一般的なアッセイのワークフローを 図 3に示します。当社のプラットフォームは、N末端タグ付きフルレングスePL-SHP2融合タンパク質を使用しています。対応する pICP-ePL-N-SHP2-WT および pICP-ePL-N-SHP2-E76K 発現プラスミドの生成については、当社の最近の出版物36を参照してください。このアッセイは、熱勾配を使用してSHP2熱プロファイルを確立し、阻害剤の存在下または不存在下でのSHP2融解温度を決定するために行うことができる。いったん熱プロファイルが確立されると、等温条件下でも実施でき、阻害剤の線量応答評価が可能になります。両方のタイプの実験を以下に説明する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

PTPN11プロトオンコジーンによってコードされるSrc相同症2(SH2)ドメイン含有ホスファターゼ2(SHP2)は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)駆動細胞シグナル伝達の主要なメディエーターであり、細胞の生存および増殖を促進する。また、SHP2は、BおよびT細胞活性化を阻害する免疫チェックポイント受容体によってリクルートされる。異常なSHP2機能は、多くの癌の発達、進行、転移に関与している。実際、低分子SHP2阻害剤は最近、いくつかの発癌性Ras突然変異を有する腫瘍を含むRas/Raf/ERK経路活性化を伴う固形腫瘍の治療のための臨床試験に入った。しかし、現在のクラスのSHP2阻害剤は、白血病で頻繁に発生するSHP2発がん型変異体に対して有効ではなく、発癌性SHP2を標的とする特定の低分子の開発が現在の研究の対象となっている。SHP2のような細胞質タンパク質を含むほとんどの創薬キャンペーンの共通の問題は、化学発見を促進する主要なアッセイは、多くの場合、候補化合物の細胞標的関与を報告しないインビトロアッセイであるということです。細胞ターゲットエンゲージメントを測定するためのプラットフォームを提供するために、野生型と変異型の両方のSHP2細胞熱シフトアッセイを開発しました。これらのアッセイは、細胞内のSHP2阻害剤の標的関与を確実に検出する。ここでは、SHP2阻害剤の評価と特性評価のための貴重なツールを提供するこのアッセイの包括的なプロトコルを提供します。

SHP2-WTの熱勾配実験は、折り畳まれたタンパク質に対して典型的かつ一貫した狭い融解遷移を有するシグモイド細胞熱プロファイルをもたらした(図4A)。SHP2 は、2 つの SH2 ドメインと触媒ドメインの 3 つの独立したドメインで構成されています (図 1)。自動抑制された閉じた立体構造では、これらのドメインは自己関連付け;熱プロファイル実験で観?...

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Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

無傷の細胞における候補阻害剤による標的関与を評価する能力は、創薬にとって極めて重要である。このプロトコルは、野生型SHP2またはその発癌性変異体を標的とする阻害剤の細胞標的関与を確実に検出する384ウェルフォーマットの細胞熱シフトアッセイについて説明する。

SHP2(PTPN11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

チロシンホスファターゼSHP2は、細胞シグナル伝達の主要なメディエーターであり、細胞の生存および増殖を促進する。私のチームは、がん治療のための低分子SHP2阻害剤を見つけることに焦点を当てています。我々の技術は、細胞内の低分子SHP2阻害剤の標的関与と同様に、細胞浸透剤を確立するための迅速かつ強力な方法を提供する。これは、探索リソースが効率的に送信されるように保証します。がん治療の魅力的なターゲットとしてSHP2。そして、いくつかのSHP2阻害剤は、臨床試験中である。有効性プロファイルの改善を用いて次世代阻害剤の発見を促進する当社の技術。手順のデモンストレーションは、研究助手のセレステ・ロメロと、私たちの研究室の研究助教授のダグラス・シェフラーです。3ミリリットルの細胞剥離試薬を用いて、プレートからHEK293 T細胞を剥離し始める。細胞を12ミリリットルの増殖培地で希釈し、1,400倍Gで遠心分離して4分間回収します。細胞の口蓋を10ミリリットルの増殖培地で再懸濁し、トリパンブルーと細胞カウンターで細胞の濃度と生存率を測定する。プレート700,000は、6つのウェル培養プレートの各ウェルに指数関数的に成長し、摂氏37度で24時間、および5%の二酸化炭素をインキュベートします。翌日、2マイクログラムの血漿DNAを200マイクロリットルのトランスフェクションバッファーに希釈します。プラズマDNAを10秒間ボルテックスし、Gの1,400倍で4分間中央分離する。希釈したDNAに4マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。それを10秒間渦を起させ、遠心分離を繰り返します。DNAを摂氏23度で10分間インキュベートし、6つのウェルプレートに取り付けられたHEK293 T細胞にトランスフェクションミックスを加え、さらに24時間培養器に戻します。アッセイプレートを調製するために、DMSOの希薄インヒビター溶液は、10ミリモルのストック濃度のために、それらを384ウェル低死量ソースプレートに分配し、即時使用する。0.5%DMSO未満の目標最終容積で384ウェルリアルタイムPCRプレートに液体ハンドラを使用して、阻害剤または車両の所望の容積を見つけます。不活性ガスパージでプレートシーラーを使用してプレートを密封します。トランスフェクト細胞を調製するために、成長培地を事前にインキュベートし、37°Cの水浴で剥離試薬を販売する。インキュベーターから細胞を取り出し、ウェルから培地を軽く吸引します。各ウェルに0.3ミリリットルの細胞剥離試薬を加え、プレートをゆっくりと前後に揺らし、プレート底面を完全に覆います。2分間摂氏23度でプレートをインキュベートします。各ウェルに1ミリリットルの成長培地を加え、ウェル内の細胞を穏やかにピペットします。その後、細胞を収集するために1,400回Gで細胞を遠心分離機15ミリリットルファルコン遠心分離管に移した。培地を軽く吸引し、次いで細胞ペレットを2ミリリットルの成長培地で再懸濁する。パンブルーとセルカウンターを試して、セルの生存率が90%を超えているかどうかを確認します。細胞を1マイクロリットル当たり125個の細胞の濃度に希釈し、細胞を2時間以下の間懸濁させて最適な生存率を維持する。SHP2阻害剤によるインキュベーションの場合、細胞を無菌単一チャネル溶液トラフに分配する。遠心分離機は、前に調製した384ウェルリアルタイムPCRプレートを2、500倍Gで5分間、シールを取り除き、125マイクロリットルのマルチチャネルピペットを使用して、希釈した細胞の5マイクロリットルを所望のウェルに加える。蓋を入れずに30秒間Gの42倍のプレートを遠心し、蓋を取り付け、摂氏37度と二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。熱プロファイル勾配または等温実験のための原稿の方向に従って、サーモサイクラーをプログラムします。サーモサイクラーヒートパルスプログラムを起動し、サーマルブロックにアッセイプレートを置きます。プログラムが終了したら、アッセイプレートを取り外します。ライセンス検出マスターミックスの5マイクロリットルでアッセイプレートの各ウェルを補います。42倍Gでプレートを30秒間遠心し、暗闇の中で摂氏23度で30〜60分間保存します。最適化された統合時間を用いてマイクロプレートリーダーを使用して化学発光を測定します。野生型SHP2の熱勾配実験は、折り畳まれたタンパク質に典型的な狭い融解遷移を有するシグモイド細胞熱プロファイルをもたらした。野生型SHP2のインキュベーションは、アロステリック阻害剤SHP099を用いて、有意かつ測定可能な程度まで熱プロファイルに安定化した。SHP2の安定化は、アロステリック化合物のようなSHP099の効力をもとに追跡される。10マイクロモルで、より強力なRMC-4550は、野生型SHP2のSHP099よりも大きな安定化度を生み出した。そのユニークなメカニズムのために、アロステリック阻害剤のようなSHP099は、SHP2-E76Kを含む多くのSHP2発癌性変異体に対してあまり効果がありません。これらの既知の特性と一致するのは、SHP099によるSHP2-E76Kの限界熱安定化のみが観察される。EPLタグタンパク質の発現レベルは、シグナル強度に劇的に影響を与える可能性があります。一過性で安定して統合された野生型細胞の熱プロファイル。同一の資産条件下で表示されます。異なる曲線の正規化は、EFC検出システムの広い範囲を明らかにし、同等の熱プロファイルを与える。384ウェルプレートの短い軸に熱勾配を生成するサーマルサイクラー能力を利用して。一連の等温滴定は単一の版で行うことができる。最適な温度で、完全な10ポイントの線量応答を使用した等温滴定は、RMC-4550に有用なEC50を生み出した。この資産の原理は、PROTAC化合物によって誘導される細胞内のタンパク質の分解を監視するために使用することができる。我々は、細胞テルマシフト技術を用いて変異型SHP2および白血病の阻害剤を発見し、頻繁なSHP2発癌性変異体に特異的な薬物がこれらの癌の治療に大きな影響を及ぼすであろう。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

抗体のアレイによるシグナル伝達経路の尋問でチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性の評価

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

無細胞性と細胞の肺転移モデル

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...