Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

이 작품은 건강 보조금 1R21CA195422 (L. T.), 엡스타인 가족 재단 상 (N. D. P.C.), NCI 암 센터 지원 보조금 P30CA030199의 국립 학회에 의해 지원되었다. 또한,이 프로젝트는 화학 생물학 컨소시엄 계약 번호에 따라 국립 암 연구소, 국립 보건 원의 연방 기금으로 전체 또는 부분적으로 자금을 지원받았습니다. HHSN2612008000001E. 이 출판물의 내용은 반드시 보건 복지부의 견해나 정책을 반영하지 않으며, 미국 정부의 보증을 암시하는 무역 이름, 상업용 제품 또는 조직에 대한 언급도 아닙니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

1. 세포 배양 및 시약 준비
<ol><li>500mL 의 성장 매체를 10% 태아 소 혈청, 항생제/항미코틱 1배, 20mM HEPES, 1mM 나트륨 피루바테로 제조합니다. 4 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>냉동 원래 재고 병에서 세포 열 이동 시약 (EA 시약, 리시스 버퍼 및 기판)을 해동하십시오.</li>
	<li>시약과 버퍼를 2mL 알리쿼트로 분배하고 -20°C에 저장합니다. 참고: 재현성을 위해 동결/해동을 피하고 분석 절차에 필요한 시약의...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. 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G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).</li><li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PTPN11,+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2,+cause+Noonan+syndrome.">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1.">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li><li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases:+next-generation+drugs.">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li><li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase.">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li><li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+PTPome+in+human+disease.">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li><li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors.">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li><li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors.">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li><li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets:+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development.">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li><li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases.">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li><li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors.">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases.">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

우리는 세포에서 SHP2 인산염에 작은 분자의 직접적인 결합을 확인할 수 있는 표적 참여 분석서를 제출했습니다. 상기 분석체는 낮은 친화성 억제제를 구별할 수 있으며, 중요한 것은 GOF 온코겐성 SHP2-E76K 돌연변이체에 대한 SHP099형의 알로스테릭 억제제에 의한 효능의 부족을 확인할 수 있다. 이 소형 분석의 강점은 SHP2 억제제 스크리닝 캠페인에 통합될 수 있는 능력입니다. 알 수 없는 화학 물질에...

티로신 인산화는 세포1,,2에서신호 변환에 중요한 역할을 한다. 이 번역 후 변형은 단백질 티로신 키나아제 (PTKs)에 의해 촉매되고 단백질 티로신 인스파타제 (PTP)에 의해 반전됩니다. 따라서, 비정상적인 PTK 또는 PTP 기능은 많은 상속 또는 획득된 인간질환3,4,4,,5,6로이어집니다. Src-homology 2 (SH2) 도메인 함유 인산염 2 (SHP2)는 프로토 온코진 PTPN117에 의해 인코딩된 널리 발현된 비수용체 형 PTP이며 Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt의 활성화에 의한 신호변환을포함하는 수많은 생리적 과정의 주요 레귤레이터이며, 8. 일반적으로 SHP2 활동은 비정상적인 신호를 방지하기 위해 엄격하게 조절됩니다. 기저 조건하에서 SHP2는 촉매 인광파아제 도메인 내의 활성 부위에 대한 액세스를 차단하는 N 단말 SH2 도메인에 의해 자동 억제된다(그림1A)9,,10. 세포 활성화 시, 티로신 인스포이드 결합 단백질은 SHP2를 모집하여 활성 부위가 기판에 접근할 수 있는 활성 형성을 채택하게 됩니다. 많은 암에서 SHP2 활동이 상승합니다. PTPN11의 체세포 게인(GOF) 돌연변이는 주로 백혈병에서 확인되었으며 N-SH2 도메인의 결합을 포스파타제 도메인으로 방지하여 구성활성 SHP2(도1B)11을초래한다. PTPN11의 생식선 GOF 돌연변이는 누난 증후군의 경우 ~50%,악성종양12의위험이 증가하는 발달 장애에 대한 책임이 있다. PTPN11 돌연변이가 드문 고형 종양에서는 인광결합 단백질의 수치가 더 높으며, 이는 향상된 SHP2활성(도 1C)으로이어진다. SHP2는 또한 면역 체크포인트 신호에 중요하며, BTLA 또는 PD-1과 같은 체크포인트 수용체는 SHP2를 모집하여 주요 신호 분자를 탈포하여 면역 세포활성화를방지13,14,,15.
PTP의 활성 부위가 매우 보존되고 고도로 충전되어 있기 때문에 작은 분자로 PTP를 타겟팅하는 것은 어려운 일이었습니다. 활성 부위를 표적으로 하는 억제제는 종종 강력하지만, 선택도 및 경구 생체 이용률이 떨어지는16,,17,,18,,19,,20,,21,,22를나타낸다. 실제로, 많은 보고 된 SHP2 억제제 가난한 선택성 및 세포에 효능의 부족에서 고통(23). 최근에는 SHP2의 알로스테릭 억제제와 우수한 선택성을 가진 알로스터리 억제제(예를 들어, SHP09924 및 RMC-455025)가보고되었으며 SHP2 억제제에 대한 관심을 새롭게 촉발시켰습니다. SHP099 및 RMC-4550에 기초한 화합물은 현재 수용체 티로신 키나아제(RTK) 경로활성화(26,27)로고형 종양을 치료하는 I상 임상시험에서현재 이다. 획기적인 동안, 이러한 화합물은 혈액암 환자의 상당수에서 백혈구 발생을 구동 하는 SHP2 종양 발생 돌연변이의 많은에 대 한 효과적 이다28,,29,,30. SHP2 온코겐성 변이체를 향한 SHP099와 같은 화합물의 효능부족은 SHP2 돌연변이체에서 중단되는 비활성 폐쇄 된 변형을 결합하고 안정화하여 SHP2 활동을 억제하기 때문에 독특한 알로스터 메커니즘에서 비롯됩니다. 또한, 최근보고서(31)에기초하여, SHP099와 같은 억제제로 치료받은 환자에서 적응성 내성 메커니즘은 매우 생각할 수 있다. 따라서, 활성을 대상으로 차세대 SHP2 억제제의 개발, 개방 상태는 강렬한 연구의 대상이다.
세포내의 새로운 SHP2 억제제의 특성화는 납 최적화 과정의 필수적인 측면이다. 비판적으로, 생리 조건 하에서 억제제의 입증 된 대상 참여는 약화학에 대 한 자원이 효율적으로 유망한 세포 효능화합물에 배포 되는 신뢰의 추가 수준을 제공. 과거에는, 그들의 표적에 작은 분자 억제제의 결합을 평가하는 몇몇 방법은 주로 단백질 키나아제(32)를위해 개발되었습니다. SHP2 셀룰러 표적 참여 분석기를 개발하기 위해 셀룰러 열 변화분석33을활용했습니다. 이러한 분석법은,단백질(34)에대한 체외 열 시프트(PTS) 분석과 유사하게, 표적 단백질 열 안정성을 모니터링하며, 이는 전형적으로 소분자의 결합에 의해 변화된다. 본래 분석은 표적 단백질 수준을 정량화하기 위해 항체를 활용하는 낮은 처리량 분석입니다. 대안적으로, 최근에 보고된 열시프트 분석법의 이체를 선택하여 β-갈라토시다아제 효소 단편 상보화(EFC)분석(도 2)35를이용한다. 이러한 실험의 경우, 관심 있는 단백질은 향상된 ProLabel 태그를 운반하는 N-또는 C 단말 융합 단백질로서 세포에서 발현된다(ePL, β 갈라토시다제의 42아미노산 단편). 세포는 384웰 PCR 호환 플레이트로 옮겨지고 관심 있는 화합물로 배양됩니다. 열사이클러는 열 안정성에 따라 온도가 증가함에 따라 단백질이 변성되고 집계되는 세포에 온도 그라데이션을 적용하는 데 사용됩니다. 관심 있는 단백질을 결합하고 안정화시키는 후보 화합물의 능력은 그 단백질의 열 안정성증가를 초래할 것이다. 따라서, 세포의 용액에 따라, 후보 화합물에 의해 안정화된 태그된 단백질은 차량 제어로 배양된 세포의 태그된 단백질보다 더 높은 온도에서 용액에 남아 있을 것이다. 리포터 효소 수용자(EA)는 용해성 ePL 태그 단백질을 보완할 수 있어 발광 기판을 사용하여 검출 가능한 β-갈라코시다제 활성을 생성한다.
최근 야생형 SHP2(SHP2-WT)에 대한 견고한 세포열 변속 분석과 소형 384웰 포맷36에서빈번한 SHP2 온코겐성 변종(SHP2-E76K)을 개발했다. 여기서, 우리는 안정적으로 세포에 있는 SHP2 억제제에 의한 표적 참여를 검출하고 억제제 힘 및 세포 열 이동 데이터 사이 상관관계의 높은 수준을 보여주는 이 분석의 상세한 프로토콜을 보고합니다. 일반적인 분석 워크플로우는 그림 3에나와 있습니다. 우리의 플랫폼은 N 단말 태그 전체 길이 ePL-SHP2 융합 단백질을 사용합니다. 해당 pICP-ePL-N-SHP2-WT 및 pICP-ePL-N-SHP2-E76K 발현 플라스미드의 생성을 위해, 최근 간행물36을참조하십시오. 이러한 분석은 열 그라데이션을 사용하여 SHP2 열 프로파일을 설정하고 억제제의 존재 또는 부재 시 SHP2 용융 온도를 결정할 수 있다. 열 프로파일이 확립되면, 그것은 또한 억제제 용량 반응 평가를 허용, 비등 조건하에서 수행 될 수있다. 두 가지 유형의 실험은 다음과 같습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

PTPN11 프로토 온코진에 의해 인코딩된 Src-homology 2(SH2) 도메인 함유 인산체 2(SHP2)는 수용체 티로신 키나아제(RTK)구동 세포 신호의 핵심 중재자이며 세포 생존 및 증식을 촉진한다. 또한, SHP2는 B 및 T 세포 활성화를 저해하기 위해 면역 체크포인트 수용체에 의해 모집된다. Aberrant SHP2 기능은 많은 암의 발달, 진행 및 전이에 연루되었습니다. 실제로, 소분자 SHP2 억제제는 최근에 Ras/Raf/ERK 통로 활성화를 가진 고형 종양의 처리를 위한 임상 시험을 입력했습니다, 몇몇 종양성 Ras 돌연변이를 가진 종양을 포함하여. 그러나, SHP2 억제제의 현재 클래스는 백혈병에서 빈번히 발생하는 SHP2 온코겐이체에 대하여 효과적이지 않으며, 온코겐성 SHP2를 표적으로 하는 특정 소분자의 개발은 현재 연구의 대상이다. SHP2 와 같은 세포질 단백질을 관련시키는 대부분의 약 발견 캠페인의 일반적인 문제점은 화학 발견을 유도하는 1 차적인 약이 수시로 후보 화합물의 세포 표적 참여를 보고하지 않는 시험관 내 분석을 한다는 것입니다. 셀룰러 표적 참여측정 플랫폼을 제공하기 위해 야생형 및 돌연변이 SHP2 세포열 시프트 분석을 모두 개발했습니다. 이러한 소심은 세포내 SHP2 억제제의 표적 참여를 안정적으로 검출한다. 여기서 는 SHP2 억제제의 평가 및 특성화를 위한 귀중한 도구를 제공하는 이 분석법의 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

SHP2-WT용 열그라데이션 실험결과 접힌단백질(도 4A)에대해 전형적이고 일관된 좁은 용융 전이를 가진 시그로이드 세포열 프로파일이 생성되었다. SHP2는 두 개의 SH2 도메인과 촉매도메인(그림 1)의세 가지 독립적인 도메인으로 구성됩니다. 자동 억제 폐쇄 형태에서 이러한 도메인은 자체 연결; 열 프로파일 실험에서 관찰된 용융 전이는 아마도 셀에서 이 ...

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Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

그대로 세포에서 후보 억제제에 의한 표적 참여를 평가하는 능력은 약물 발견에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 SHP2 또는 종양 발생 변이체를 대상으로 억제제의 셀룰러 표적 참여를 안정적으로 감지하는 384 개의 잘 포맷 셀룰러 열 이동 분석서를 설명합니다.

SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

티로신 포스파타제 SHP2는 세포 신호의 핵심 중재자로서 세포 생존과 증식을 촉진합니다. 우리 팀은 암 치료를 위한 소분자 SHP2 억제제를 찾는 데 초점을 맞추고 있습니다. 우리의 기술은 세포 에 있는 소분자 SHP2 억제제의 표적 참여뿐만 아니라 세포 침투를 설치하는 신속하고 강력한 방법을 제공합니다.이것은 검색 리소스가 효율적으로 지시되도록 보장합니다. SHP2는 암 치료를 위한 매력적인 표적으로 합니다. 그리고 여러 SHP2 억제제는 임상 시험에 있습니다.향상된 효능 프로파일로 차세대 억제제의 발견을 용이하게 하는 당사의 기술. 절차에 입증셀레스트 로메로, 연구 조수와 더글러스 셰플러, 연구 조교수, 우리의 실험실에서. 플레이트에서 HEK293 T 세포를 분리하기 시작하려면 세포 분리 시약의 3 밀리리터를 사용한다.성장 매체의 12 밀리리터로 세포를 희석하고, 4 분 동안 1, 400 회 G에서 원심 분리로 수집합니다. 성장 매체의 10 밀리리터에서 세포 입맛을 다시 중단하고 trypan blue 및 셀 카운터로 세포의 농도 및 생존가능성을 측정합니다. 플레이트 700, 000 기하급수적으로 성장하는 세포는 6개의 우물로 각 우물로 들어가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다.다음 날, 혈장 DNA의 2 마이크로그램을 200 마이크로리터의 형질 전환 완충제로 희석시킵니다. 플라즈마 DNA를 10초 동안 소용돌이시키고 4분 동안 1, 400배 G로 중앙분리합니다. 희석된 DNA에 4개의 미세입자 시약을 추가합니다.10 초 동안 소용돌이, 원심 분리를 반복합니다. DNA를 섭씨 23도에서 10분 동안 배양한 다음, 6개의 웰 플레이트에 부착된 HEK293 T 세포에 형질 전환 믹스를 추가하고 세포를 인큐베이터로 24시간 동안 반납한다. 분석 플레이트를 준비하려면 DMSO의 억제제 용액을 희석하여 10 밀리몰러의 재고 농도를 위해 즉시 사용하기 위해 384 개의 잘 낮은 죽은 볼륨 소스 플레이트로 분배하십시오.0.5% DMSO 미만의 최종 부피에서 384개의 실시간 PCR 플레이트로 액체 처리기를 사용하여 원하는 억제제 또는 차량을 반점한다. 불활성 가스 정화판 실러를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 전감염된 세포를 준비하여 성장 매체를 미리 배양하고 섭씨 37도의 수조에서 분리 시약을 판매한다.인큐베이터에서 세포를 제거하고 우물에서 미디어를 부드럽게 흡인합니다. 각 웰에 세포 분리 시약의 0.3 밀리리터를 추가하고 플레이트 바닥을 철저히 덮기 위해 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 줍니다. 2분 동안 섭씨 23도에서 접시를 배양합니다.각 웰에 성장 매체의 1 밀리리터를 추가하고 우물에 세포를 부드럽게 피펫합니다. 그런 다음 세포를 수집하기 위해 4 분 동안 1 5 밀리리터 팔콘 원심 분리관 원심분리기 세포원심분리기로 이송합니다. 부드럽게 미디어를 흡인, 다음 성장 매체의 두 밀리리터에 세포 펠릿을 다시 중단.시도 팬 블루와 셀 카운터를 사용하여 셀 생존 능력이 90 % 이상인지 확인하십시오. 마이크로리터 당 125 세포의 농도로 세포를 희석하여 최적의 생존을 위해 2 시간 이상 현탁액에 세포를 유지합니다. SHP2 억제제로 배양을 위해 세포를 멸균 단일 채널 용액 트로프로 분배합니다.원심분리기는 이전에 준비된 384개의 실시간 PCR 플레이트를 5분 동안 2, 500회 G에서 한 다음 씰을 제거하고 125 마이크로리터 멀티 채널 파이펫을 사용하여 희석된 세포의 5마이크로리터를 원하는 웰즈에 첨가한다. 뚜껑없이 30 초 동안 42 시간 G에서 접시를 원심 분리 한 다음 뚜껑을 부착하고 섭씨 37도및 이산화탄소 5 %에서 1 시간 동안 접시를 배양합니다. 열 프로파일 그라데이션 또는 기타 실험에 대한 원고 방향에 따라 써모 사이클러를 프로그래밍합니다.열 사이클러 열 펄스 프로그램을 시작하고 열 블록에 분석 플레이트를 배치합니다. 프로그램이 완료되면 분석 판을 제거합니다. 허가 된 검출 마스터 믹스의 다섯 마이크로 리터와 분석 플레이트의 각 웰을 보충합니다.플레이트를 42회 G로 30초 간 30초 간 원심분리하고 어둠 속에서 섭씨 23도에서 30~60분 간 보관합니다. 최적화된 통합 시간으로 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 화학 발광을 측정합니다. 야생 형 SHP2용 열 그라데이션 실험은 접힌 단백질에 전형적인 좁은 용융 전이를 가진 시그로이드 세포 열 프로파일을 초래했습니다.알로스터 억제제 SHP099를 가진 야생형 SHP2의 배양은, 열 프로파일로 안정화되어 유의하고 측정 가능한 정도입니다. SHP2의 안정화, 또한 알로스터 화합물 처럼 SHP099의 효능으로 추적. 10 마이크로몰러에서 더 강력한 RMC-4550은 야생 형 SHP2에 대한 SHP099보다 더 높은 수준의 안정화를 생산했습니다.그들의 독특한 메커니즘으로 인해, 알로스터 억제제 와 같은 SHP099는 SHP2-E76K를 포함하여 많은 SHP2 온원성 돌연변이에 대해 덜 효과적이다. 이러한 알려진 특성과 일치하여 SHP099에 의한 SHP2-E76K의 한계 열 안정화만 관찰된다. EPL 태그 단백질의 발현 수준은 신호 강도에 극적으로 영향을 미칠 수 있다.일시적이고 안정적으로 통합된 야생 형 셀을 위한 열 프로파일. 동일한 자산 조건에 따라 표시됩니다. 이질적인 곡선의 정규화는 유사한 열 프로파일을 제공하므로 광범위한 EFC 감지 시스템을 드러냅니다.384 웰 플레이트의 짧은 축에서 열 그라데이션을 생성하는 열 사이클러 기능을 활용합니다. 일련의 이더스말 적정은 단일 플레이트에서 수행 될 수있다. 최적의 온도에서, 전체 10 점 용량 응답을 사용하여 이소성 적정, 유용한 EC50을 산출, RMC-4550에 대한.이 자산의 원리는 PROTAC 화합물에 의해 유도된 세포에 있는 단백질의 분해를 감시하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 우리는 돌연변이 SHP2와 백혈병의 억제제를 발견하기 위하여 세포 Thelma 교대 기술을 사용하고 있습니다, 빈번한 SHP2 종양원 돌연변이에 대하여 특정한 약은 이 암의 처리를 위한 중요한 충격이 있을 것입니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

연구

암 연구학

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...