Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (til L. T.), Epstein Family Foundation Award (til N. D. P.C.), og NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. I tillegg har dette prosjektet blitt finansiert helt eller delvis med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Chemical Biology Consortium Contract No. HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjene til Department of Health and Human Services, og nevner heller ikke varenavn, kommersielle produkter eller organisasjoner som innebærer godkjenning fra den amerikanske regjeringen. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

1. Utarbeidelse av cellekultur og reagenser
<ol><li>Formuler en 500 ml flaske vekstmedier med 10 % fosterbovinserum, 1x antibiotika/antimikrotisk, 20 mM HEPES og 1 mM natriumpyuvat. Oppbevares ved 4 °C.</li>
	<li>Tin cellulære termiske skiftreagenser (EA-reagens, lysisbuffer og substrat) fra frosne originale lagerflasker.</li>
	<li>Dispenser reagenser og buffer som 2 ml aliquots og oppbevar ved -20 °C. MERK: Unngå frysing/tine for reproduserbarhet og bruk bare det volumet av reagensen som kreves for analyseprose...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tyrosine+Phosphatases:+Time+to+End+the+Stigma.">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li><li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction.">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li><li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase.">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li><li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+phosphatase+Shp2+(PTPN11)+in+cancer.">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li><li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li><li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li><li>Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).</li><li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PTPN11,+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2,+cause+Noonan+syndrome.">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1.">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li><li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases:+next-generation+drugs.">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li><li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase.">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li><li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+PTPome+in+human+disease.">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li><li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors.">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li><li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors.">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li><li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets:+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development.">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li><li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases.">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li><li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors.">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases.">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

Vi har presentert en målengasjementsanalyse som kan bekrefte direkte binding av små molekyler til SHP2 fosfatase i celler. Analysen kan diskriminere mellom lav og høy affinitetshemmere og, viktigst, bekrefte mangel på styrke av allosteriske hemmere av SHP099-typen for GOF onkogen SHP2-E76K mutant. En styrke ved denne miniatyriserte analysen er dens evne til å integreres i en SHP2-hemmerscreeningskampanje. Analysens evne til å bekrefte intracellulær binding til SHP2 av ukjent kjemisk materiale er en viktig kapasite...

Tyrosinfosforylering spiller en viktig rolle i signaltransduksjon i cellene1,2. Denne endringen etter oversettelsen katalyseres av proteintyrosinkinaser (PTKs) og reversert av proteintyrosinfosfataser (PTP). Derfor fører avvikende PTK- eller PTP-funksjon til mange arvelige eller ervervede menneskeligesykdommer 3,,4,,5,,6. Src-homology 2 (SH2) domeneholdig fosfatase 2 (SHP2) er en bredt uttrykt ikke-reseptor type PTP kodet av proto-oncogene PTPN117 og er en viktig regulator av mange fysiologiske prosesser som involverer signaltransduksjon ved aktivering av Ras / Raf / ERK, PI3K/Akt eller JAK/STAT-signalveier8. Normalt er SHP2-aktiviteten tett regulert for å forhindre avvikende signalering. Under basale forhold er SHP2 automatisk oppdaget av sitt N-terminal SH2-domene, som blokkerer tilgangen til det aktive stedet innenfor katalytisk fosfatasedomene (figur 1A)9,10. Ved celleaktivering rekrutterer tyrosinfosforyler bindende proteiner SHP2, noe som får det til å vedta sin aktive konformasjon, der det aktive stedet nå er tilgjengelig for sine substrater. I mange kreftformer SHP2 aktivitet er forhøyet. Somatiske gain-of-function (GOF) mutasjoner i PTPN11 har blitt identifisert hovedsakelig i leukemier og hindre binding av N-SH2 domenet til fosfatasedomenet, noe som resulterer i konstituerende aktiv SHP2 (figur 1B)11. Germline GOF mutasjoner i PTPN11 er ansvarlig for ~ 50% av tilfellene av Noonan syndrom, en utviklingsforstyrrelse med økt risiko for malignitet12. I solide svulster, hvor PTPN11 mutasjoner er sjeldne, fører større nivåer av fosforylertbindende proteiner til forbedret SHP2-aktivitet (figur 1C). SHP2 er også viktig for immun kontrollpunkt signalering, som sjekkpunkt reseptorer som BTLA eller PD-1 rekruttere SHP2 å dephosphorylate viktige signalmolekyler, hindre immuncelle aktivering13,14,15.
Målretting av PTPs med små molekyler har vært en utfordring, fordi det aktive stedet for PTPs er svært bevart og høyt ladet; hemmere som retter seg mot det aktive stedet er ofte potente, men viser dårlig selektivitet og oral biotilgjengelighet16,17,18,19,20,21,22. Faktisk lider mange rapporterte SHP2-hemmere av dårlig selektivitet og mangel på effekt i celler23. Nylig er allosteriske hemmere av SHP2 med god styrke og utmerket selektivitet rapportert (f.eks. SHP09924 og RMC-455025) og har utløst fornyet interesse for SHP2-hemmere. Forbindelser basert på SHP099 og RMC-4550 er for tiden i fase I kliniske studier for å behandle solide svulster med reseptor tyrosin kinase (RTK) pathway aktivering26,27. Mens banebrytende, disse forbindelsene er ineffektive mot mange av SHP2 onkogene mutanter som driver leukemogenese hos et betydelig antall blodkreftpasienter28,29,30. Denne mangelen på styrke av SHP099-lignende forbindelser mot SHP2 onkogene varianter stammer fra deres unike allosteriske mekanisme, da de hemmer SHP2-aktivitet ved å binde og stabilisere den inaktive, lukkede konformasjonen, som forstyrres i SHP2 mutanter. Videre, basert på en fersk rapport31,er adaptive resistensmekanismer hos pasienter behandlet med SHP099-lignende hemmere ganske tenkelige. Følgelig er utviklingen av neste generasjon SHP2-hemmere som retter seg mot sin aktive, åpne tilstand et emne for intens forskning.
Karakteriseringen av nye SHP2-hemmere i celler er et viktig aspekt ved blyoptimaliseringsprosessen. Kritisk, bevist målengasjement av hemmeren under fysiologiske forhold gir et ekstra nivå av tillit til at ressurser for medisinsk kjemi er effektivt utplassert på forbindelser med lovende cellulær effekt. Tidligere har flere metoder for å vurdere bindingen av små molekylhemmere til sine mål blitt utviklet, hovedsakelig for proteinkinaser32. For å utvikle en SHP2 mobilnettet mål engasjement analyse, vi benyttet en cellulær termisk skift analyse33. Denne analysen, lik in vitro termisk skift (PTS) analyse for proteiner34,overvåker målet protein termisk stabilitet, som vanligvis endres ved binding av små molekyler. Den opprinnelige analysen er en lav gjennomstrømningsanalyse som benytter antistoffer for å kvantifisere målproteinnivåer. Alternativt valgte vi en nylig rapportert variant av den termiske skiftanalysen som benytter en β-galaktosidase enzymfragment komplementering (EFC) analyse (figur 2)35. For disse eksperimentene uttrykkes proteinet av interesse i celler som et N- eller C-terminalfusjonsprotein som bærer en forbedret ProLabel-tag (ePL, et 42 aminosyrefragment av β-galaktosidase). Celler overføres deretter til 384-brønns PCR-kompatible plater og inkuberes med forbindelser av interesse. En termocycler brukes til å bruke en temperaturgradient på cellene, hvis proteiner vil denatur og aggregere etter hvert som temperaturen øker basert på deres termiske stabilitet. Evnen til en kandidatforbindelse til å binde og stabilisere proteinet av interesse vil resultere i økt termisk stabilitet av det proteinet. Derfor, etter lysis av cellene, de taggede proteiner som har blitt stabilisert av en kandidat sammensatte vil forbli i løsning ved høyere temperaturer enn merket proteiner av celler inkubert med kjøretøy kontroll. Reporter enzym acceptor (EA) er i stand til å utfylle løselige ePL-merkede proteiner, noe som resulterer i påviselig β-galaktosidase aktivitet ved hjelp av et luminescence substrat.
Vi har nylig utviklet en robust cellulær termisk skift analyse for vill-type SHP2 (SHP2-WT) og en hyppig SHP2 onkogen variant (SHP2-E76K) i en miniatyrisert 384-brønn format36. Her rapporterer vi en detaljert protokoll for denne analysen, som pålitelig oppdager målengasjement av SHP2-hemmere i celler og viser en høy grad av korrelasjon mellom inhibitorstyrke og cellulære termiske skiftdata. Arbeidsflyten for generell analyse er illustrert i figur 3. Vår plattform bruker N-terminalt merket full lengde ePL-SHP2 fusjonproteiner. For generering av tilsvarende pICP-ePL-N-SHP2-WT og pICP-ePL-N-SHP2-E76K uttrykk plasmids, vennligst se vår sistepublikasjon 36. Denne analysen kan utføres ved hjelp av en termisk gradient for å etablere SHP2 termiske profiler og bestemme SHP2 smeltetemperaturer i nærvær eller fravær av inhibitor. Når termiske profiler er etablert, kan det også utføres under isotermiske forhold, slik at inhibitor dose-respons vurdering. Begge typer eksperimenter er beskrevet nedenfor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

Src-homology 2 (SH2) domeneholdig fosfatase 2 (SHP2), kodet av PTPN11 proto-onkogen, er en viktig mekler av reseptor tyrosinkinase (RTK)-drevet cellesignalering, fremme celleoverlevelse og spredning. I tillegg rekrutteres SHP2 av immunkontrollpunktreseptorer for å hemme B- og T-celleaktivering. Avvikende SHP2-funksjon har vært innblandet i utvikling, progresjon og metastase av mange kreftformer. Faktisk har små molekyl SHP2-hemmere nylig gått inn i kliniske studier for behandling av faste svulster med Ras / Raf / ERK pathway aktivering, inkludert svulster med noen onkogene Ras mutasjoner. Imidlertid er den nåværende klassen av SHP2-hemmere ikke effektive mot SHP2 onkogene varianter som forekommer ofte i leukemier, og utviklingen av spesifikke små molekyler som retter seg mot onkogene SHP2 er gjenstand for gjeldende forskning. Et vanlig problem med de fleste narkotikaoppdagelseskampanjer som involverer cytosoliske proteiner som SHP2 er at de primære analysene som driver kjemisk oppdagelse ofte er in vitro-analyser som ikke rapporterer det cellulære målengasjementet til kandidatforbindelser. For å gi en plattform for måling av cellulært målengasjement utviklet vi både villtype og mutert SHP2 cellulære termiske skiftanalyser. Disse analysene oppdager pålitelig målengasjement av SHP2-hemmere i celler. Her gir vi en omfattende protokoll for denne analysen, som gir et verdifullt verktøy for vurdering og karakterisering av SHP2-hemmere.

Det termiske gradienteksperimentet for SHP2-WT resulterte i en sigmoidal cellulær termisk profil med en smal smelteovergang som er typisk og konsistent for et brettet protein (figur 4A). SHP2 består av tre uavhengige domener: to SH2-domener og det katalytiske domenet (figur 1). I den automatisk lukkede konformasjonen disse domenene selv-associate; smelteovergangen som ble observert i det termiske profileksperimentet, reflekterte antagelig denne tilstanden i ce...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Evnen til å vurdere målengasjement av kandidathemmere i intakte celler er avgjørende for narkotikaoppdagelse. Denne protokollen beskriver en 384 brønnformat cellulær termisk skift analyse som pålitelig oppdager cellulære mål engasjement av inhibitorer rettet mot enten vill-type SHP2 eller dets onkogene varianter.

Vurdere cellulært målengasjement etter SHP2 (PTPN11) Fosfatasehemmere

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Tyrosinfosfatase SHP2, er en viktig mekler for cellulær signalering, fremme celle overlevelse og spredning. Teamet mitt er fokusert på å finne små molekyl SHP2 hemmere for behandling av kreft. Vår teknikk gir en rask og kraftig metode for å etablere cellepenetranter, samt målengasjement av små molekyl SHP2-hemmere, i celler.Dette er forsikrer, oppdagelsesressurser er effektivt rettet. SHP2 som et attraktivt mål for kreftbehandling. Og flere SHP2-hemmere, er i kliniske studier.Vår teknikk for å lette oppdagelsen av neste generasjonshemmere med forbedrede effektprofiler. Viser til prosedyren ville være Celeste Romero, en forskningsassistent og Douglas Sheffler, en forskningsassistent professor, fra vårt laboratorium. For å begynne å løsne HEK293 T-celler fra platene, ved hjelp av tre milliliter celleavløsningsreagens.Fortynn cellene med 12 milliliter vekstmedier, og samle dem ved sentrifugering ved 1, 400 ganger G, i fire minutter. Resuspend celle ganen i 10 milliliter vekstmedier og måle konsentrasjonen og levedyktigheten av cellene med trypan blå og en celle teller. Plate 700, 000 eksponentielt voksende celler i hver brønn av en seks brønn kultur plate og inkubere dem i 24 timer ved 37 grader Celsius, og 5% karbondioksid.På neste dag, fortynne to mikrogram plasma DNA i 200 mikroliter transfection buffer. Vortex plasma-DNA i 10 sekunder og sentralfuge den på 1, 400 ganger G i fire minutter. Tilsett fire mikroliter transinfeksjonsreagens til det fortynnede DNA-et.Vortex det i 10 sekunder, og gjenta sentrifugering. Inkuber DNA ved 23 grader Celsius i 10 minutter, og legg deretter transfection blandingen til de vedlagte HEK293 T-cellene i seks brønnplaten, og returner cellene til inkubatoren i ytterligere 24 timer. For å forberede analyseplater, fortynne inhibitor løsninger i DMSO, for en lagerkonsentrasjon på 10 millimolar og dispensere dem inn i en 384 godt lavt dødt volum kildeplate, for umiddelbar bruk.Spot ønsket volum av inhibitorer eller kjøretøy, ved hjelp av en væske handler i 384 godt sanntid PCR plater på et mål endelig volum på mindre enn 0,5%DMSO. Forsegle platene ved hjelp av en platetetning med inert gassrensing. For å forberede de trans infiserte cellene forhånd inkubere vekstmedier og selge løsrivelsesreagens i et 37 grader Celsius vannbad.Fjern cellene fra inkubatoren og aspirer forsiktig mediet fra brønnene. Tilsett 0,3 milliliter av celleavløsningsreagensen til hver brønn, og rock platen forsiktig frem og tilbake for å dekke overflaten av platebunnen grundig. Inkuber platen ved 23 grader Celsius i to minutter.Tilsett en milliliter vekstmedie til hver brønn, og rør forsiktig cellene i brønnen. Deretter overføre dem til en 15 milliliter Falcon sentrifuge tube Sentrifuge cellene på 1, 400 ganger G i fire minutter for å samle cellene. Aspirer forsiktig mediene, og gjenopplys deretter cellepelleten i to milliliter vekstmedier.Kontroller at celleleveligheten er større enn 90 %ved hjelp av prøve panoreringsblå og en celleteller. Fortynn celler til en konsentrasjon på 125 celler per mikroliter, og hold cellene i suspensjon i ikke mer enn to timer for optimal levedyktighet. For inkubasjon med SHP2-hemmere, dispenser cellene i en steril enkeltkanals løsning gjennom.Sentrifuge den tidligere forberedte 384 brønn sanntids PCR-platen ved 2, 500 ganger G i fem minutter, fjern deretter forseglingen og bruk en 125 mikroliter flerkanals pipette, for å legge til fem mikroliter av de fortynnede cellene til de ønskede brønnene. Sentrifuger platen ved 42 ganger G i 30 sekunder uten lokk, fest deretter et lokk og inkuber platen i en time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Programmer Termo cycler, i henhold til manuskript retninger for enten termisk profil gradient eller isotermisk eksperiment.Start termocyclervarmepulsprogrammet, og plasser analyseplaten på den termiske blokken. Når programmet er ferdig, fjerner du analyseplaten. Supplere hver brønn av analyseplaten med fem mikroliter av lisensiert deteksjon master mix.Sentrifuger platen ved 42 ganger G i 30 sekunder, og oppbevar den ved 23 grader Celsius i mørket i 30 til 60 minutter. Mål chemiluminescence ved hjelp av en mikroplateleser med optimalisert integrasjonstid. Det termiske gradienteksperimentet for vill type SHP2, resulterte i en sigmoidal cellulær termisk profil med en smal smelteovergang som er typisk for et brettet protein.Inkubasjon av vill type SHP2 med den allosteriske hemmeren SHP099, stabilisert til den termiske profilen i betydelig og målbar grad. Stabiliseringen av SHP2, også sporet med styrken av SHP099 som allosteriske forbindelser. Ved 10 mikromos, den mer potente RMC-4550, produsert en større grad av stabilisering enn SHP099 for vill type SHP2.På grunn av deres unike mekanisme er SHP099 som allosteriske hemmere mindre effektive mot mange SHP2 onkogene mutanter, inkludert SHP2-E76K. I samsvar med disse kjente egenskapene observeres bare marginal termisk stabilisering av SHP2-E76K av SHP099. Uttrykksnivået til EPL-tagproteinet kan dramatisk påvirke signalintensiteten.Termiske profiler for forbigående og stabilt integrerte villtypeceller. under identiske aktivaforhold vises. Normalisering av de ulike kurvene gir sammenlignbare termiske profiler, og avslører det brede spekteret av EFC-registreringssystemet.Dra nytte av den termiske cycler evne til å produsere termiske gradienter på den korte aksen av en 384 brønnplate. en rekke isotermiske titreringer kan utføres på en enkelt plate. Ved en optimal temperatur ga en isotermisk titrering ved hjelp av en full 10-punkts doserespons en nyttig EC50, for RMC-4550.Prinsippene for denne eiendelen kan brukes til å overvåke nedbrytning av proteiner i celler, indusert av PROTAC forbindelser. Vi bruker cellulær Thelma skift teknikk for å oppdage hemmere av mutant SHP2 og leukemier, legemidler som er spesifikke mot hyppige SHP2 onkogene mutanter vil ha en betydelig innvirkning for behandling av disse kreftene.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Målet cellen pre berikelse og hele genomet forsterkning for enkeltcelle nedstrøms karakteristikk

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Vurdering av motstand mot Tyrosine Kinase hemmere av en avhør av signaltransduksjon trasé av antistoff matriser

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellular og cellulær lunge modell å studere svulst metastasering

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En Chromatin Immunoprecipitation analysen identifisere romanen NFAT2 målet gener i kronisk lymfatisk leukemi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En Spheroid drapet analysen av bilen T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Bruke Microarrays å avhøre Microenvironmental Impact on Cellular fenotyper i Cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering Cell levedyktighet og død i 3D spheroid kulturer av kreftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakterisere sykdom-relaterte mutanter av RAF familie kinaser ved hjelp av et sett av praktiske og gjennomførbare metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identifikasjon av transkripsjonsfaktorregulatorer ved hjelp av middels gjennomstrømningsscreening av arrayed biblioteker og en Dual-Luciferase-basert reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...