Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (para L. T.), Epstein Family Foundation Award (para N. D. P.C.) e NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Além disso, este projeto foi financiado total ou parcialmente com recursos federais do Instituto Nacional de Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, sob o Contrato nº nº 1 do Consórcio de Biologia Química. HHSN261200800001e. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem menciona nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implicam o endosso do Governo dos EUA. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Preparação da cultura celular e reagentes
<ol><li>Formule uma garrafa de 500 mL de mídia de crescimento com soro bovino fetal de 10%, 1x antibiótico/antimicocítico, 20 mM HEPES e 1 mM piruvato de sódio. Armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Descongele os reagentes de mudança térmica celular (reagente EA, tampão de lise e substrato) de garrafas de caldo originais congeladas.</li>
	<li>Dispense reagentes e tampão como alíquotas de 2 mL e armazene a -20 °C. NOTA: Evite congelar/descongelar para reprodutibilidade ...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tyrosine+Phosphatases:+Time+to+End+the+Stigma.">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li><li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction.">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li><li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase.">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li><li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+phosphatase+Shp2+(PTPN11)+in+cancer.">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li><li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li><li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li><li>Neel, B. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors.">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases.">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

Apresentamos um ensaio de engajamento de alvo que pode confirmar a ligação direta de pequenas moléculas à fosfattase SHP2 nas células. O ensaio pode discriminar entre inibidores de baixa e alta afinidade e, principalmente, confirmar a falta de potência pelos inibidores alergênicos do tipo SHP099 para o mutante SHP2-E76K oncogênico gof. Uma força deste ensaio miniaturizado é sua capacidade de ser integrado em uma campanha de triagem inibidora SHP2. A capacidade do ensaio de confirmar a ligação intracelular ao ...

A fosforilação da tyrosina desempenha um papel importante na transdução de sinal nas células1,,2. Esta modificação pós-translacional é catalisada por proteínas tyrosina quinases (PTKs) e revertida por fosfattases de proteína tyrosina (PTPs). Portanto, a aberrante função PTK ou PTP leva a muitas doenças humanas herdadas ou adquiridas3,4,,5,6. O domínio Src-homology 2 (SH2) contendo fosfattase 2 (SHP2) é um PTP não receptor amplamente expresso codificado pelo proto-oncogene PTPN117 e é um regulador-chave de numerosos processos fisiológicos que envolvem transdução de sinal por ativação das vias de sinalização Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt, ou jak/STAT sinalizando caminhos8. Normalmente, a atividade SHP2 é fortemente regulada para evitar sinalizações aberrantes. Sob condições basais, o SHP2 é autoinibido pelo seu domínio SH2 n-terminal, que bloqueia o acesso ao local ativo dentro do domínio fosfatase catalítico(Figura 1A)9,,10. Após a ativação celular, as proteínas de ligação de fosforilalatados de tyrosina recrutam SHP2, fazendo com que adote sua conformação ativa, na qual o local ativo agora está acessível aos seus substratos. Em muitos cânceres, a atividade SHP2 é elevada. Mutações de ganho de função somática (GOF) no PTPN11 foram identificadas principalmente em leucemias e impedem a vinculação do domínio N-SH2 ao domínio fosfatase, resultando em SHP2(Figura 1B)11. Mutações germinas em PTPN11 são responsáveis por ~50% dos casos de síndrome de Noonan, uma desordem de desenvolvimento com risco aumentado de malignidade12. Em tumores sólidos, onde as mutações PTPN11 são raras, maiores níveis de proteínas de ligação fosfoilada levam a uma atividade SHP2 aprimorada(Figura 1C). O SHP2 também é importante para a sinalização de ponto de verificação imune, pois receptores de ponto de verificação como BTLA ou PD-1 recrutam SHP2 para desfosforilarar moléculas-chave de sinalização, impedindo a ativação de células imunes13,,14,,15.
Mirar PTPs com pequenas moléculas tem sido um desafio, pois o local ativo dos PTPs é altamente conservado e altamente carregado; inibidores que visam o local ativo são muitas vezes potentes, mas apresentam pouca seletividade e biodisponibilidade oral16,17,18,19,,20,,21,,22. De fato, muitos inibidores SHP2 relatados sofrem de pouca seletividade e falta de eficácia nas células23. Recentemente, foram relatados inibidores alusivos de SHP2 com boa potência e excelente seletividade (por exemplo, SHP09924 e RMC-455025) e despertaram interesse renovado nos inibidores de SHP2. Compostos baseados em SHP099 e RMC-4550 estão atualmente em ensaios clínicos de fase I para tratar tumores sólidos com ativação da via tyrosina quinase receptora (RTK)26,27. Embora inovadores, esses compostos são ineficazes contra muitos dos mutantes oncogênicos SHP2 que impulsionam a leukemogênese em um número significativo de pacientes com câncer de sangue28,,29,30. Essa falta de potência dos compostos semelhantes ao SHP099 em relação às variantes oncogênicas SHP2 decorre de seu mecanismo alergênico único, pois inibem a atividade SHP2, vinculando e estabilizando a conformação inativa e fechada, que é interrompida em mutantes SHP2. Além disso, com base em um relatório recente31,os mecanismos de resistência adaptativa em pacientes tratados com inibidores semelhantes ao SHP099 são bastante concebíveis. Consequentemente, o desenvolvimento de inibidores SHP2 de próxima geração que visam seu estado ativo e aberto é objeto de intensa pesquisa.
A caracterização dos novos inibidores SHP2 nas células é um aspecto essencial do processo de otimização do chumbo. Criticamente, o engajamento comprovado do inibidor em condições fisiológicas fornece um nível adicional de confiança de que os recursos para a química medicinal são eficientemente implantados em compostos com eficácia celular promissora. No passado, vários métodos para avaliar a ligação de inibidores de pequenas moléculas aos seus alvos foram desenvolvidos, principalmente para as quinases proteicas32. Para desenvolver um ensaio de engajamento de alvos celulares SHP2, utilizamos um ensaio de mudança térmica celular33. Este ensaio, semelhante ao ensaio de mudança térmica in vitro (PTS) para proteínas34,monitora a estabilidade térmica da proteína alvo, que é tipicamente alterada pela ligação de pequenas moléculas. O ensaio original é um ensaio de baixo rendimento que utiliza anticorpos para quantificar os níveis de proteína alvo. Alternativamente, escolhemos uma variante recentemente relatada do ensaio de mudança térmica que utiliza um ensaio de complementação de fragmento de enzima β-galactosidase (EFC)(Figura 2)35. Para esses experimentos, a proteína de interesse é expressa nas células como uma proteína de fusão terminal N ou C carregando uma etiqueta ProLabel aprimorada (ePL, um fragmento de 42 aminoácidos de β-galactosidase). As células são então transferidas para placas compatíveis com PCR de 384 poços e incubadas com compostos de interesse. Um termociclador é utilizado para aplicar um gradiente de temperatura às células, cujas proteínas irão desnaturar e agregar à medida que a temperatura aumenta com base em sua estabilidade térmica. A capacidade de um composto candidato para ligar e estabilizar a proteína de interesse resultará em um aumento da estabilidade térmica dessa proteína. Portanto, seguindo a lise das células, as proteínas marcadas que foram estabilizadas por um composto candidato permanecerão em solução a temperaturas mais altas do que as proteínas marcadas das células incubadas com o controle do veículo. O aceitador de enzimas repórteres (EA) é capaz de complementar as proteínas solúveis marcadas por EPL, resultando em atividade detectável β-galactosidase usando um substrato de luminescência.
Recentemente desenvolvemos um robusto ensaio de mudança térmica celular para SHP2 (SHP2-WT) e uma variante oncogênica SHP2 frequente (SHP2-E76K) em um formato 384-well miniaturizado384-well 36. Aqui, relatamos um protocolo detalhado deste ensaio, que detecta de forma confiável o engajamento de alvos por inibidores de SHP2 nas células e demonstra um alto grau de correlação entre potência inibidora e dados de mudança térmica celular. O fluxo de trabalho de ensaio geral é ilustrado na Figura 3. Nossa plataforma usa proteínas de fusão ePL-SHP2 marcadas em n-terminal. Para a geração dos plasmídeos de expressão correspondentes pICP-ePL-N-SHP2-WT e pICP-ePL-N-SHP2-E76K, consulte nossa recentepublicação 36. Este ensaio pode ser realizado usando um gradiente térmico para estabelecer perfis térmicos SHP2 e determinar temperaturas de fusão SHP2 na presença ou ausência de inibidor. Uma vez estabelecidos perfis térmicos, ele também pode ser realizado em condições istermais, permitindo a avaliação inibidora da dose-resposta. Ambos os tipos de experimentos são descritos abaixo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

O domínio Src-homology 2 (SH2) contendo fosfattase 2 (SHP2), codificado pelo proto-oncogene PTPN11, é um mediador-chave da sinalização celular orientada por tyrosina quinase receptora (RTK), promovendo a sobrevivência celular e a proliferação. Além disso, o SHP2 é recrutado por receptores de ponto de verificação imune para inibir a ativação de células B e T. A função Aberrant SHP2 tem sido implicada no desenvolvimento, progressão e metástase de muitos cânceres. De fato, inibidores de pequenas moléculas SHP2 entraram recentemente em testes clínicos para o tratamento de tumores sólidos com ativação da via Ras/Raf/ERK, incluindo tumores com algumas mutações oncogênicas ras. No entanto, a classe atual de inibidores de SHP2 não é eficaz contra as variantes oncogênicas SHP2 que ocorrem frequentemente em leucemias, e o desenvolvimento de pequenas moléculas específicas que visam o SHP2 oncogênico é o tema da pesquisa atual. Um problema comum com a maioria das campanhas de descoberta de drogas envolvendo proteínas citosósicas como o SHP2 é que os ensaios primários que impulsionam a descoberta química são frequentemente ensaios in vitro que não relatam o engajamento de alvos celulares de compostos candidatos. Para fornecer uma plataforma para medir o engajamento de alvos celulares, desenvolvemos ensaios de mudança térmica celular SHP2 do tipo selvagem e mutantes. Estes ensaios detectam de forma confiável o engajamento de alvos de inibidores de SHP2 nas células. Aqui, fornecemos um protocolo abrangente deste ensaio, que fornece uma ferramenta valiosa para a avaliação e caracterização dos inibidores SHP2.

O experimento de gradiente térmico para SHP2-WT resultou em um perfil térmico celular sigmoidal com uma transição estreita de fusão que é típica e consistente para uma proteína dobrada(Figura 4A). O SHP2 consiste em três domínios independentes: dois domínios SH2 e o domínio catalítico(Figura 1). Na conformação fechada autoinibida esses domínios se auto-associam; a transição de fusão observada no experimento do perfil térmico presumivelmente r...

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Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

A capacidade de avaliar o engajamento de alvos por inibidores candidatos em células intactas é crucial para a descoberta de drogas. Este protocolo descreve um ensaio de mudança térmica celular de formato 384 que detecta de forma confiável o engajamento de alvos celulares de inibidores visando shp2 tipo selvagem ou suas variantes oncogênicas.

Avaliando o engajamento de alvos celulares por inibidores de fosfattase de PHOsphatase

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

A fosfattase de tirasina SHP2 é um dos principais mediadores da sinalização celular, promovendo a sobrevivência e a proliferação celular. Minha equipe está focada em encontrar inibidores de pequenas moléculas SHP2 para o tratamento do câncer. Nossa técnica fornece um método rápido e poderoso para estabelecer penetrantes celulares, bem como o engajamento de inibidores de pequenas moléculas SHP2, em células.Isso garante que os recursos de descoberta são direcionados eficientemente. SHP2 como um alvo atraente para a terapia do câncer. E vários inibidores de SHP2 estão em testes clínicos.Nossa técnica para facilitar a descoberta de inibidores da próxima geração com perfis de eficácia melhorados. Demonstrando o procedimento estaria Celeste Romero, assistente de pesquisa e Douglas Sheffler, professor assistente de pesquisa, do nosso laboratório. Para iniciar desapego HEK293 T-cells das placas, usando três mililitros de reagente de descolamento celular.Diluir as células com 12 mililitros de mídia de crescimento, e colecioná-las por centrifugação a 1.400 vezes G, por quatro minutos. Resuspend o paladar celular em 10 mililitros de mídia de crescimento e medir a concentração e viabilidade das células com azul trypan e um contador celular. Placa 700.000 células de crescimento exponencial em cada poço de uma placa de seis poços de cultura e incuba-las por 24 horas a 37 graus Celsius, e 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, dilui dois microgramas de DNA de plasma em 200 microliters de tampão de transfecção. Vórtice o DNA de plasma por 10 segundos e centralizado-o a 1.400 vezes G por quatro minutos. Adicione quatro microliters de reagente de transfecção ao DNA diluído.Vórtice por 10 segundos, e repita a centrifugação. Incubar o DNA a 23 graus Celsius por 10 minutos, depois adicionar a mistura de transfecção às células HEK293 T anexadas na placa de seis poços, e retornar as células à incubadora por mais 24 horas. Para preparar placas de ensaio, diluir soluções inibidoras em DMSO, para uma concentração de estoque de 10 mililitros e dispensá-las em uma placa de origem de volume morto de 384 bem baixa, para uso imediato.Localmente o volume desejado de inibidores ou veículo, utilizando um manipulador líquido em 384 placas PCR em tempo real com um volume final de alvo inferior a 0,5% DMSO. Sele as placas usando um selador de placas com purificação de gás inerte. Para preparar as células transfeinadas pré incubar a mídia de crescimento e vender reagente de descolamento em um banho de água de 37 graus Celsius.Remova as células da incubadora e aspire suavemente a mídia dos poços. Adicione 0,3 mililitros do reagente de descolamento celular a cada poço, e balance suavemente a placa para frente e para trás para cobrir completamente a superfície do fundo da placa. Incubar a placa a 23 graus Celsius por dois minutos.Adicione um mililitro de mídia de crescimento a cada poço, e gentilmente pipete as células no poço. Em seguida, transfira-as para um tubo de centrífuga Falcon de 15 mililitros Centrifuge as células a 1.400 vezes G por quatro minutos para coletar as células. Aspire suavemente a mídia, depois resuspenque a pelota de célula em dois mililitros de mídia de crescimento.Certifique-se de que a viabilidade da célula é superior a 90% usando o try pan blue e um contador de células. Diluir células a uma concentração de 125 células por microliter, mantendo as células em suspensão por não mais do que duas horas para a viabilidade ideal. Para incubação com inibidores SHP2, dispense as células em uma solução de canal único estéril.Centrifugar a placa PCR de 384 bem em tempo real preparada a 2.500 vezes G durante cinco minutos, em seguida, remova o selo e use uma pipeta multicanal de 125 microliteres, para adicionar cinco microliters das células diluídas aos Poços desejados. Centrifugar a placa a 42 vezes G durante 30 segundos sem tampa, em seguida, anexar uma tampa e incubar a placa por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Programe o ciclo de termo, de acordo com as instruções do manuscrito para o gradiente do perfil térmico ou o experimento isotémico.Inicie o programa de pulso de calor do termociclador e coloque a placa de ensaio no bloco térmico. Quando o programa estiver concluído, remova a placa de ensaio. Suplemine cada poço da placa de ensaio com cinco microliters de mistura mestre de detecção licenciada.Centrifugar a placa a 42 vezes G por 30 segundos, e armazená-la a 23 graus Celsius na escuridão por 30 a 60 minutos. Meça a chemiluminescência usando um leitor de microplaca com o tempo de integração otimizado. O experimento de gradiente térmico para o tipo selvagem SHP2, resultou em um perfil térmico celular sigmoidal com uma transição estreita de fusão que é típica para uma proteína dobrada.Incubação do tipo selvagem SHP2 com o inibidor alésterico SHP099, estabilizado ao perfil térmico em um grau significativo e mensurável. A estabilização do SHP2, também acompanhada com a potência de SHP099 como compostos alusicos. Com 10 micromolar, o RMC-4550 mais potente, produziu um grau de estabilização maior do que o SHP099 para o tipo selvagem SHP2.Devido ao seu mecanismo único, sHP099 como inibidores alergênicos são menos eficazes contra muitos mutantes oncogênicos SHP2, incluindo SHP2-E76K. Consistente com essas propriedades conhecidas, apenas a estabilização térmica marginal de SHP2-E76K por SHP099 é observada. O nível de expressão da proteína de etiqueta EPL pode influenciar drasticamente a intensidade do sinal.Perfis térmicos para células do tipo selvagem transitórios e stably integradas. em condições de ativos idênticas são mostrados. A normalização das curvas díspares proporciona perfis térmicos comparáveis, revelando a ampla gama do sistema de detecção de EFC.Aproveitando a capacidade do cicloviário térmico para produzir gradientes térmicos no eixo curto de uma placa de poço 384. uma série de titulações istermais podem ser realizadas em uma única placa. A uma temperatura ideal, uma titulação isotérmica usando uma dose-resposta de 10 pontos completa, rendeu um EC50 útil, para RMC-4550.Os princípios desse ativo poderiam ser usados para monitorar a degradação de proteínas nas células, induzidas por compostos PROTAC. Estamos usando a técnica de mudança de Thelma celular para descobrir inibidores de mutantes SHP2 e leucemias, drogas específicas contra mutantes oncogênicos SHP2 frequentes terão um impacto significativo para o tratamento desses cânceres.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Pesquisa do câncer

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Avaliação da resistência aos inibidores de tirosina quinase por um interrogatório das vias de transdução de sinal por matrizes de anticorpo

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caracterizar Mutants relacionados à doença da família da RAF kinases usando um conjunto de métodos práticos e viáveis

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...