Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (till L. T.), Epstein Family Foundation Award (till N. D. P.C.), och NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Dessutom har detta projekt finansierats helt eller delvis med federala medel från National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Chemical Biology Consortium Contract No. HHSN261200800001E. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller policyer från Department of Health and Human Services, och nämner inte heller handelsnamn, kommersiella produkter eller organisationer som innebär godkännande av den amerikanska regeringen. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.

1. Beredning av cellodling och reagenser
<ol><li>Formulera en 500 mL flaska tillväxt media med 10% fetala nötkreatur serum, 1x antibiotika/antimicotic, 20 mM HEPES och 1 mM natriumpynat. Förvaras vid 4 °C.</li>
	<li>Tina cellulära termiska skiftreagenser (EA-reagens, lysbuffert och substrat) från frysta originallagerflaskor.</li>
	<li>Dosera reagenser och buffert som 2 mL alikvoter och förvara vid -20 °C. OBS: Undvik att frysa/tina för reproducerbarhet och använd endast den volym reagens som krävs för an...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tyrosine+Phosphatases:+Time+to+End+the+Stigma.">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li><li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction.">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li><li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase.">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li><li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+phosphatase+Shp2+(PTPN11)+in+cancer.">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li><li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li><li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li><li>Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).</li><li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PTPN11,+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2,+cause+Noonan+syndrome.">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1.">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li><li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases:+next-generation+drugs.">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li><li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase.">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li><li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+PTPome+in+human+disease.">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li><li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors.">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li><li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors.">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li><li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets:+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development.">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li><li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases.">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li><li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors.">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases.">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

Vi har presenterat ett mål engagemang assay som kan bekräfta direkt bindning av små molekyler till SHP2 fosfatas i celler. Analysen kan diskriminera mellan låg och hög affinitetshämmare och, viktigt, bekräfta en brist på potens av allosteric hämmare av SHP099-typ för GOF onkogena SHP2-E76K mutant. En styrka av denna miniatyriserade analys är dess förmåga att integreras i en SHP2-hämmare screening kampanj. Förmågan hos analysen att bekräfta intracellulär bindning till SHP2 av okänd kemisk materia är en...

Tyrosin fosforylering spelar en viktig roll i signaltransduktion i celler1,2. Denna post-translational modifiering katalysas av protein tyrosin kinaser (PTKs) och återförs av protein tyrosin fosfataser (PTPs). Därför leder avvikande PTK eller PTP funktion till många ärvda eller förvärvade mänskligasjukdomar 3,4,5,6. Den Src-homology 2 (SH2) domän-innehållande phosphatase 2 (SHP2) är en allmänt uttryckt icke-receptor typ PTP kodas av den proto-onkogene PTPN117 och är en viktig regulator av många fysiologiska processer som innebär signaltransferion genom aktivering av Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt, eller JAK / STAT signalering vägar8. Normalt är SHP2-aktiviteten hårt reglerad för att förhindra avvikande signalering. Under basala förhållanden SHP2 är autoinhibited av sin N-terminal SH2 domän, som blockerar tillgång till den aktiva platsen inom den katalytiska fosfatas domänen (Figur 1A)9,10. Vid cellaktivering rekryterar tyrosinfosforylerade bindningsproteiner SHP2, vilket gör att den antar sin aktiva konformation, där den aktiva platsen nu är tillgänglig för sina substrat. I många cancerformer SHP2 aktiviteten är förhöjd. Somatiska gain-of-function (GOF) mutationer i PTPN11 har identifierats främst i leukemier och förhindra bindning av N-SH2 domänen till fosfatas domän, vilket resulterar i konstitutivt aktiva SHP2 (Figur 1B)11. Sett GOF mutationer i PTPN11 är ansvariga för ~ 50% av fallen av Noonans syndrom, en utvecklingsstörning med en ökad risk för malignitet12. I solida tumörer, där PTPN11 mutationer är sällsynta, större nivåer av fosforylerade bindande proteiner leda till förstärkt SHP2 aktivitet (Figur 1C). SHP2 är också viktigt för immun checkpoint signalering, som checkpoint receptorer såsom BTLA eller PD-1 rekrytera SHP2 till defosforylering nyckelsignalering molekyler, förhindra immuncell aktivering13,14,15.
Att rikta ptps med små molekyler har varit en utmaning, eftersom den aktiva platsen för PTPs är mycket bevarad och mycket laddad; hämmare som riktar sig till den aktiva webbplatsen är ofta potenta, men uppvisar dålig selektivitet och oral biotillgänglighet16,17,18,19,20,21,22. Faktum är att många rapporterade SHP2-hämmare lider av dålig selektivitet och brist på effekt i cellerna23. Nyligen har allosteriska hämmare av SHP2 med god potens och utmärkt selektivitet rapporterats (t.ex. shp09924 och RMC-455025) och har väckt förnyat intresse för SHP2-hämmare. Föreningar baserade på SHP099 och RMC-4550 är för närvarande i kliniska fas I-prövningar för att behandla solida tumörer med receptor tyrosin kinas (RTK) utbildningsavsnittpathway aktivering 26,27. Medan banbrytande, dessa föreningar är ineffektiva mot många av shp2 onkogena mutanter som driver leukemogenesis i ett betydande antal blodcancerpatienter28,29,30. Denna brist på potens av SHP099-liknande föreningar mot SHP2 onkogena varianterna härrör från deras unika allosteric mekanism, eftersom de hämmar SHP2 verksamhet genom att binda och stabilisera inaktiva, sluten konformation, som störs i SHP2 mutanter. Vidare, baserat på en färskrapport 31, adaptiva resistensmekanismer hos patienter som behandlats med SHP099-liknande hämmare är ganska tänkbart. Följaktligen är utvecklingen av nästa generations SHP2-hämmare som riktar sig mot dess aktiva, öppna tillstånd ett ämne för intensiv forskning.
Karakteriseringen av nya SHP2-hämmare i celler är en väsentlig aspekt av blyoptimeringsprocessen. Kritiskt, beprövade mål engagemang av hämmaren under fysiologiska förhållanden ger en ytterligare nivå av förtroende för att resurser för medicinsk kemi effektivt sätts in på föreningar med lovande cellulär effekt. Tidigare har flera metoder för att bedöma bindningen av små molekylhämmare till sina mål utvecklats, främst för proteinkinaser32. För att utveckla en SHP2 cellulära mål engagemang assay, vi utnyttjade en cellulär termisk förskjutning assay33. Denna analys, liknande in vitro thermal shift (PTS) analys för proteiner34, övervakar målet protein termisk stabilitet, som vanligtvis ändras genom bindning av små molekyler. Den ursprungliga analysen är en låg genomströmning assay som utnyttjar antikroppar för att kvantifiera mål proteinnivåer. Alternativt valde vi en nyligen rapporterad variant av termiska skift analysen som utnyttjar en β-galactosidase enzym fragment komplementering (EFC) analys (Figur 2)35. För dessa experiment, proteinet av intresse uttrycks i celler som en N- eller C-terminal fusion protein som bär en förbättrad ProLabel tagg (ePL, en 42 aminosyra fragment av β-galactosidase). Celler överförs sedan till 384-väl PCR-kompatibla plattor och inkuberas med föreningar av intresse. En termocyklare utnyttjas för att tillämpa en temperaturgradient på cellerna, vars proteiner kommer denaturera och aggregera som temperaturen ökar baserat på deras termiska stabilitet. Förmågan hos en kandidatförening att binda och stabilisera proteinet av intresse kommer att resultera i en ökad termisk stabilitet av detta protein. Efter cellernas lys kommer därför de taggade proteiner som har stabiliserats av en kandidatförening att finnas kvar i lösning vid högre temperaturer än taggade proteiner av celler som inkuberas med fordonskontroll. Reporter enzym acceptor (EA) kan komplettera lösliga ePL-taggade proteiner, vilket resulterar i detekterbara β-galactosidase aktivitet med hjälp av en luminisektion substrat.
Vi utvecklade nyligen en robust cellulär termisk skiftanalys för wild-type SHP2 (SHP2-WT) och en frekvent SHP2 onkogen variant (SHP2-E76K) i en miniatyriserad 384-brunn format36. Här rapporterar vi ett detaljerat protokoll av denna analys, som på ett tillförlitligt sätt upptäcker mål engagemang av SHP2-hämmare i celler och visar en hög grad av korrelation mellan hämmare potens och cellulära termiska skiftdata. Arbetsflödet för allmän analys illustreras i figur 3. Vår plattform använder N-terminally taggade fullängds ePL-SHP2 fusion proteiner. För generering av motsvarande pICP-ePL-N-SHP2-WT och pICP-ePL-N-SHP2-E76K uttryck plasmider, hänvisas till vår senaste publikation36. Denna analys kan utföras med hjälp av en termisk gradient för att upprätta SHP2 termiska profiler och bestämma SHP2 smälttemperaturer i närvaro eller frånvaro av inhibitor. När termiska profiler har fastställts, Det kan också utföras under isotermiska förhållanden, vilket möjliggör inhibitor dos-respons bedömning. Båda typerna av experiment beskrivs nedan.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

Den Src-homology 2 (SH2) domän-innehållande phosphatase 2 (SHP2), kodas av PTPN11 proto-onkogen, är en nyckelmediator av receptor tyrosin kinas (RTK)-driven cell signalering, främja cell överlevnad och spridning. Dessutom är SHP2 rekryteras av immun kontrollpunkt receptorer att hämma B och T cell aktivering. Aberrant SHP2 funktion har varit inblandad i utveckling, progression, och metastasering av många cancerformer. Faktum är att små molekyler SHP2-hämmare nyligen har gått in i kliniska prövningar för behandling av fasta tumörer med Ras/Raf/ERK-spridningsvägsaktivering, inklusive tumörer med vissa onkogena Ras-mutationer. Den nuvarande klassen av SHP2-hämmare är dock inte effektiv mot shp2-onkogena varianter som förekommer ofta i leukemier, och utvecklingen av specifika små molekyler som riktar sig mot onkogena SHP2 är föremål för aktuell forskning. Ett vanligt problem med de flesta kampanjer drug discovery involvera cytosolic proteiner som SHP2 är att de primära analyser som driver kemiska upptäckt är ofta in vitro-analyser som inte rapporterar cellulära mål engagemang kandidat föreningar. För att ge en plattform för mätning av cellulära mål engagemang, utvecklade vi både vild-typ och mutant SHP2 cellulära termisk skift analyser. Dessa analyser på ett tillförlitligt sätt upptäcka mål engagemang shp2-hämmare i celler. Här tillhandahåller vi ett omfattande protokoll av denna analys, som ger ett värdefullt verktyg för bedömning och karakterisering av SHP2-hämmare.

Den termiska gradient experiment för SHP2-WT resulterade i en sigmoidal cellulär termisk profil med en smal smältning övergång som är typisk och konsekvent för ett vikt protein (Figur 4A). SHP2 består av tre oberoende domäner: två SH2-domäner och den katalytiska domänen (Bild 1). I den autoinhibited stängda konformationen dessa domäner själv-associera; den smältande övergång som observerades i termisk profil experiment förmodligen återspeglas...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Förmågan att bedöma målengagemang av kandidathämmare i intakta celler är avgörande för läkemedelsupptäckt. Detta protokoll beskriver en 384 väl format cellulära termisk skift assay som tillförlitligt upptäcker cellulära mål engagemang av inhibitorer inriktning antingen vild-typ SHP2 eller dess onkogena varianter.

Bedöma cellulära Target Engagement av SHP2 (PTPN11) Fosfatashämmare

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Tyrosin phosphatase SHP2, är en viktig medlare av cellulära signalering, främja cell överlevnad och spridning. Mitt team är fokuserat på att hitta små molekyl SHP2-hämmare för behandling av cancer. Vår teknik ger en snabb och kraftfull metod för att etablera cell-penetrants, samt mål engagemang av små molekyl SHP2-hämmare, i celler.Detta är försäkrar, identifiering resurser är effektivt riktad. SHP2 som ett attraktivt mål för cancerterapi. Och flera SHP2-hämmare, är i kliniska prövningar.Vår teknik för att underlätta upptäckten av nästa generations hämmare med förbättrade effektprofiler. Demonstrera till förfarande skulle celeste Romero, en forskningsassistent och Douglas Sheffler, en forskarassistent professor, från vårt laboratorium. För att börja lossa HEK293 T-celler från plattorna, med hjälp av tre milliliter av cellavlossning reagens.Späd cellerna med 12 milliliter tillväxtmedia, och samla dem genom centrifugeringen vid 1, 400 gånger G, i fyra minuter. Resuspend cellen gommen i 10 milliliter av tillväxtmedia och mäta koncentrationen och livskraften hos cellerna med trypan blå och en cellräknare. Plate 700, 000 exponentiellt växande celler i varje brunn av en sex brunnskultur tallrik och inkubera dem i 24 timmar vid 37 grader Celsius, och 5% koldioxid.Nästa dag späd två mikrogram plasma-DNA till 200 mikroliter transfektionsbuffert. Vortexa plasma-DNA i 10 sekunder och centralfugera det vid 1, 400 gånger G i fyra minuter. Tillsätt fyra mikroliter av transfektionsreagens till det utspädda DNA:t.Vortexa den i 10 sekunder, och upprepa centrifugeringen. Inkubera DNA vid 23 grader Celsius i 10 minuter, tillsätt sedan transfektionsblandningen till de bifogade HEK293 T-cellerna i den sex brunnsplattan och returnera cellerna till inkubatorn i ytterligare 24 timmar. För att förbereda analysplattor, späda ut inhibitorlösningar i DMSO, för en lagerkoncentration på 10 millimol och dosera dem till en 384 väl låg död volym källplatta, för omedelbar användning.Spot önskad volym av hämmare eller fordon, med hjälp av en flytande hanterare i 384 väl realtid PCR plattor på ett mål slutlig volym på mindre än 0,5%DMSO. Täta plattorna med hjälp av en platt sealer med inert gas rensning. För att förbereda de transfekterade cellerna pre inkubera tillväxtmedia och sälja avlossningsreagens i ett 37 grader Celsius vattenbad.Ta bort cellerna från inkubatorn och aspirera försiktigt media från brunnarna. Tillsätt 0,3 milliliter av cellavlossningsreagensen till varje brunn, och försiktigt klippa plattan fram och tillbaka för att noggrant täcka ytan av plattan botten. Inkubera plattan vid 23 grader Celsius i två minuter.Tillsätt en milliliter tillväxtmedia till varje brunn, och försiktigt pipettera cellerna i brunnen. Överför dem sedan till en 15 milliliter Falcon centrifug röret Centrifug cellerna på 1, 400 gånger G i fyra minuter för att samla in cellerna. Aspirera försiktigt media, sedan återanvänd cellpelletsen i två milliliter tillväxtmedia.Se till att cellens viabilitet är större än 90%med hjälp av prova panorera blå och en cellräknare. Späd celler till en koncentration av 125 celler per mikroliter, hålla cellerna i suspension i högst två timmar för optimal lönsamhet. För inkubation med SHP2-hämmare, dosera cellerna i en steril enkanalslösning tråg.Centrifugera den tidigare beredda 384 väl realtid PCR-platta vid 2, 500 gånger G i fem minuter, ta sedan bort tätningen och använda en 125 mikroliter flerkanalspipett, att lägga till fem mikroliter av de utspädda cellerna till önskad Wells. Centrifugera plattan vid 42 gånger G i 30 sekunder utan lock, sedan fästa ett lock och inkubera plattan i en timme vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Programmera Termocyklaren, enligt manuskriptriktningar för antingen termisk profilgradient eller isotermiskt experiment.Starta termocyklarens värmepulsprogram, och placera analysplattan på termiska blocket. När programmet är klart, ta bort analysplattan. Komplettera varje brunn av analysen plattan med fem microliters av licensierade upptäckt master mix.Centrifugera plattan vid 42 gånger G i 30 sekunder, och förvara den på 23 grader Celsius i mörker i 30 till 60 minuter. Mät chemiluminescens med hjälp av en mikroplattläsare med den optimerade integrationstiden. Den termiska gradient experiment för vilda typ SHP2, resulterade i en sigmoidal cellulär termisk profil med en smal smältning övergång som är typiskt för ett vikt protein.Inkubation av vild typ SHP2 med allosterisk hämmare SHP099, stabiliserad till den termiska profilen till en betydande och mätbar grad. Stabiliseringen av SHP2, också spåras med styrkan av SHP099 som allosteric föreningar. Vid 10 mikromolar, den mer potenta RMC-4550, producerade en högre grad av stabilisering än SHP099 för vilda typ SHP2.På grund av deras unika mekanism, SHP099 som allosteric inhibitors är mindre effektiva mot många SHP2 onkogena mutanter, inklusive SHP2-E76K. Överensstämmer med dessa kända egenskaper endast marginell termisk stabilisering av SHP2-E76K av SHP099 observeras. Uttrycksnivån för EPL-taggen protein kan dramatiskt påverka signalintensiteten.Termiska profiler för transienta och stabsintegrerade vilda typceller. under identiska tillgångsvillkor visas. Normalisering av de olikartade kurvorna ger jämförbara termiska profiler, vilket avslöjar det breda utbudet av EFC-detektionssystemet.Dra nytta av den termiska cycler förmåga att producera termiska lutningar på den korta axeln av en 384 väl platta. en serie isotermiska titrer kan utföras på en enda platta. Vid en optimal temperatur, en isotermisk titrering med hjälp av en full 10 punkt Dos-Response, gav en användbar EC50, för RMC-4550.Principerna för denna tillgång skulle kunna användas för att övervaka nedbrytningen av proteiner i celler, framkallade av PROTAC-föreningar. Vi använder cellulära Thelma skift teknik för att upptäcka hämmare av mutant SHP2 och leukemi, läkemedel specifika mot täta SHP2 onkogena mutanter kommer att ha en betydande inverkan för behandling av dessa cancerformer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Bedömning av resistens mot tyrosinkinashämmare av ett förhör av cellsmedierade reaktioner av antikropp matriser

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulärt och cellulära Lung modell att studera tumör metastasering

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En kromatin Immunoprecipitation analysen identifiera roman NFAT2 målgener i kronisk lymfatisk leukemi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En sfäroid dödande analys av CAR T-celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Använda Microarrays att förhöra mikromiljö påverkan på cellulära fenotyper i cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Bedömning cell livs kraft och död i 3D Sfäroiden kulturer av cancer celler

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakterisera sjukdomsrelaterade mutanter av RAF-Familjekinaser genom att använda en uppsättning praktiska och genomförbara metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekterna av Migrastatiska hämmare på 3D-tumör spheroid invasion av högupplöst Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identifiering av transkriptionsfaktor regulatorer med hjälp av Medium-Genomströmning Screening av arrayed bibliotek och en Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...