Name: assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Bu çalışma National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (L.T.' ye), Epstein Aile Vakfı Ödülü (N.D. P. .C.) ve NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi P30CA030199 tarafından desteklendi. Ayrıca, bu proje tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Kimyasal Biyoloji Konsorsiyumu Sözleşme No altında Federal fonlar ile finanse edilmiştir. HHSN261200800001E. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsan Iúletmeleri Bakanlığı' nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmadığı gibi, ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsetmek DE ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

1. Hücre kültürünün ve reaktiflerinin hazırlanması
<ol><li>%10 fetal sığır serumu, 1x antibiyotik/antimikotik, 20 mM HEPES ve 1 mM sodyum pirüuvat içeren 500 mL'lik bir büyüme ortamı şişesi formüle edin. 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Dondurulmuş orijinal stok şişelerinden hücresel termal kaydırma reaktiflerini (EA reaktifi, lisis tamponu ve substrat) eritin.</li>
	<li>Reaktifleri ve tamponu 2 mL aliquot olarak dağıtın ve -20 °C'de saklayın. NOT: Tekrarlanabilirlik için donma/çözülmede...

<ol>
	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation:+thirty+years+and+counting.">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li><li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome.">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).</li><li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+inhibitors:+the+road+ahead.">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li><li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tyrosine+Phosphatases:+Time+to+End+the+Stigma.">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li><li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction.">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li><li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase.">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li><li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tyrosine+phosphatase+Shp2+(PTPN11)+in+cancer.">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li><li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li><li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2.">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li><li>Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).</li><li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PTPN11,+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2,+cause+Noonan+syndrome.">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1.">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li><li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases:+next-generation+drugs.">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li><li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase.">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li><li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+PTPome+in+human+disease.">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li><li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors.">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li><li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors.">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li><li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets:+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development.">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li><li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases.">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li><li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors.">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases.">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-,+NF1-+and+RAS-driven+cancers.">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li><li>. Clinical Trial NCT03114319 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019)</li><li>. Clinical Trial NCT03634982 Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019)</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2(E69K)+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099.">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li><li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition.">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).</li><li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2.">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR.">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li><li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors.">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells,+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1.">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li><li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+(PTPN11)+phosphatase+inhibitors.">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li><li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2.">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li></ol>

Küçük moleküllerin hücrelerdeki SHP2 fosfatazına doğrudan bağlanmasını doğrulayabilecek bir hedef nişan analizi sunduk. Taht, düşük ve yüksek afisite inhibitörleri arasında ayrım yapabilir ve daha da önemlisi GOF onkojenik SHP2-E76K mutantı için SHP099 tipi allosterik inhibitörlerin potens eksikliğini doğrulayabilir. Bu minyatür leştirilmiş tayini bir gücü bir SHP2 inhibitörü tarama kampanyasına entegre edilebilir yeteneğidir. Tdenemenin bilinmeyen kimyasal madde ile SHP2'ye hücre içi ...

Tirozin fosforilasyon hücrelerde sinyal transdüksiyon önemli bir rol oynar1,2. Bu post-translational modifikasyon protein tirozin kinazları (PtKs) tarafından katalize edilir ve protein tirozin fosfatazlar (PtPs) tarafından tersine çevrilir. Bu nedenle, anormal PTK veya PTP fonksiyonu birçok kalıtsal veya edinilmiş insan hastalıkları3yol açar,4,5,6. Src-homology 2 (SH2) etki alanı içeren fosfataz 2 (SHP2) yaygın olarak ifade edilen non-reseptör tipi PTP proto-oncogene PTPN117 tarafından kodlanmış ve Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt veya JAK / STAT sinyal yollarıaktivasyonuile sinyal transdüksiyon içeren çok sayıda fizyolojik süreçlerin önemli bir düzenleyici 8 . Normalde, SHP2 aktivitesi anormal sinyalizasyonönlemek için sıkı bir şekilde düzenlenir. Bazal koşullar altında SHP2, katalitik fosfataz etki alanı içinde aktif bölgeye erişimi engelleyen N-terminal SH2 etki alanı tarafından otomatik olarak engellenir (Şekil 1A)9,10. Hücre aktivasyonu üzerine, tirozin fosforlu bağlayıcı proteinler SHP2'yi işe alır ve aktif alan artık alt tabakalarına erişebildiği aktif konformasyonunu benimsemesine neden olur. Birçok kanserde SHP2 aktivitesi yükselir. PTPN11'deki somatik fonksiyon kazanım (GOF) mutasyonları daha çok lösemilerde tespit edilmiştir ve N-SH2 etki alanının fosfataz etki alanına bağlanmasını önleyerek kurucu olarak aktif SHP2(Şekil 1B)11ile sonuçlanmıştır. PTPN11'deki Germline GOF mutasyonları Noonan sendromu olgularının ~%50'si, malignite riski yüksek bir gelişimsel bozukluktan sorumludur12. PTPN11 mutasyonlarının nadir olduğu solid tümörlerde, fosforilasyonlu bağlayıcı proteinlerin daha yüksek düzeyleri gelişmiş SHP2 aktivitesine yol açar(Şekil 1C). SHP2 de bağışıklık kontrol noktası sinyalizasyonu için önemlidir, BTLA veya PD-1 gibi kontrol noktası reseptörleri gibi anahtar sinyal molekülleri defosforilasyon için shp2 işe, bağışıklık hücresi aktivasyonunu önlemek13,14,15.
PtP'lerin aktif alanı yüksek oranda korunmuş ve yüksek oranda şarj edildiği için, PtP'lerin küçük moleküllerle hedeflanması zor olmuştur; aktif site hedef inhibitörleri genellikle güçlü, ama kötü seçicilik ve oral biyoyararlanım sergiler16,17,18,19,20,21,22.18 Nitekim, birçok rapor SHP2 inhibitörleri kötü seçicilik ve hücrelerde etkinlik eksikliği muzdarip23. Son zamanlarda, iyi potens ve mükemmel seçicilik ile SHP2 allosteric inhibitörleri bildirilmiştir (örneğin, SHP09924 ve RMC-455025)ve SHP2 inhibitörleri yenilenen ilgi yol açtı. Bileşikler SHP099 ve RMC-4550 dayalı şu anda faz I klinik çalışmalarda reseptör tirozin kinaz ile katı tümörleri tedavi etmek için (RTK) yolu aktivasyon26,27. Çığır açan iken, Bu bileşikler kan kanseri hastalarının önemli sayıda lökemogenez sürücü SHP2 onkojenik mutantların çoğuna karşıetkisizdir28,29,30. SHP2 onkojenik varyantlarına doğru SHP2 benzeri bileşiklerin bu potens eksikliği, SHP2 mutantlarında bozulan inaktif, kapalı konformasyonu bağlayarak ve stabilize ederek SHP2 aktivitesini inhibe ettikleri için, benzersiz allosterik mekanizmalarından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, yeni bir rapora dayanarak31, SHP099 benzeri inhibitörleri ile tedavi hastalarda adaptif direnç mekanizmaları oldukça akla yatkındır. Sonuç olarak, aktif, açık durumunu hedefleyen yeni nesil SHP2 inhibitörlerinin geliştirilmesi yoğun bir araştırma konusudur.
Hücrelerde yeni SHP2 inhibitörlerinin karakterizasyonu kurşun optimizasyon sürecinin önemli bir yönüdür. Kritik, fizyolojik koşullar altında inhibitörü kanıtlanmış hedef nişan tıbbi kimya için kaynakların verimli verici hücresel etkinliği ile bileşikler üzerinde dağıtılan ek bir güven düzeyi sağlar. Geçmişte, küçük molekül inhibitörlerinin hedeflerine bağlanmasını değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, öncelikle protein kinazları için32. Bir SHP2 hücresel hedef nişan analizi geliştirmek için, bir hücresel termal vardiya analizi33kullandı. Bu test, proteinler için in vitro termal shift benzer (PTS) test34, genellikle küçük moleküllerin bağlanması ile değiştirilir hedef protein termal stabilite, izler. Orijinal testi hedef protein düzeylerini ölçmek için antikorlar kullanan düşük bir iş testidir. Alternatif olarak, bir β-galaktosidaz enzim parça tamamlayıcılığı (EFC) analizi(Şekil 2)35kullanan termal kayma analizinin yakın zamanda bildirilen bir varyantını seçtik. Bu deneyler için, ilgi protein gelişmiş bir ProLabel etiketi taşıyan bir N- veya C-terminal füzyon proteini olarak hücrelerde ifade edilir (ePL, β-galaktosidaz bir 42 amino asit parçası). Hücreler daha sonra 384-iyi PCR uyumlu plakalar aktarılır ve ilgi bileşikleri ile kuluçkaya yatırılır. Bir termocycler proteinleri denature ve sıcaklık ısı stabilitesine bağlı olarak arttıkça agrega olacak hücrelere bir sıcaklık gradyan uygulamak için kullanılır. Bir aday bileşiğin ilgi proteinini bağlayıp stabilize edebilme yeteneği, o proteinin termal stabilitesinin artmasına neden olacaktır. Bu nedenle, hücrelerin lysis aşağıdaki, bir aday bileşik tarafından stabilize edilmiş bu etiketli proteinler araç kontrolü ile kuluçka hücrelerinetiketli proteinler daha yüksek sıcaklıklarda çözelti kalacaktır. Muhabir enzim kabul edici (EA) çözünür ePL etiketli proteinleri tamamlayarak, lüminesans substratı kullanılarak saptanabilir β-galaktosidaz aktivitesi ile sonuçlanır.
Yakın zamanda yabani tip SHP2 (SHP2-WT) ve sık shp2 onkojenik varyant (SHP2-E76K) için sağlam bir hücresel termal vardiya tayini geliştirdik minyatür leştirilmiş 384-iyiformat36. Burada, hücrelerdeki SHP2 inhibitörleri tarafından hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan ve inhibitör potens ile hücresel termal değişim verileri arasında yüksek derecede korelasyon gösteren bu testin ayrıntılı bir protokolünü rapor ediyoruz. Genel titreiş akışı Şekil 3'tegösterilmiştir. Platformumuz n-terminally etiketli tam uzunlukta ePL-SHP2 füzyon proteinleri kullanır. İlgili pICP-ePL-N-SHP2-WT ve pICP-ePL-N-SHP2-E76K ifade plazmidleri üretimi için lütfen son yayın36bakın . Bu töz, SHP2 termal profillerini oluşturmak ve inhibitörün varlığında veya yokluğunda SHP2 erime sıcaklıklarını belirlemek için bir termal degrade kullanılarak gerçekleştirilebilir. Termal profiller kurulduktan sonra, aynı zamanda inhibisyon doz-yanıt değerlendirmesi sağlayan, izotermal koşullar altında yapılabilir. Her iki deney türü de aşağıda açıklanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well gradient equipped thermocycler</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>X50h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well low dead volume microplate Echo qualified</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657 160</td>
			<td>Sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>Echo 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E1 ClipTip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-680</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Pulse starter kit</td>
			<td>Eurofins DiscoverX Corp.</td>
			<td>94-4007</td>
			<td>Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel solution trough</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S253012005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-010</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal microplate sealer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>PlateLoc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagents</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>jetPRIME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin.tec 384 real-time PCR plates</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30132734</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular target engagement by shp2 (ptpn11) phosphatase inhibitors

PTPN11 proto-onkogen tarafından kodlanmış Src-homology 2 (SH2) etki alanı içeren fosfataz 2 (SHP2), hücre sağkalım ını ve çoğalmasını teşvik eden, reseptör tirozin kinaz (RTK) güdümlü hücre sinyalinin önemli bir aracısıdır. Buna ek olarak, SHP2 B ve T hücre aktivasyonunu inhibe etmek için bağışıklık kontrol noktası reseptörleri tarafından işe. Anormal SHP2 fonksiyonu birçok kanserin gelişimi, ilerlemesi ve metastazında yer almıştır. Nitekim, küçük molekül SHP2 inhibitörleri son ras / Raf / ERK yolu aktivasyonu ile katı tümörlerin tedavisi için klinik çalışmalara girmiştir, bazı onkojenik Ras mutasyonları ile tümörler de dahil olmak üzere. Ancak, SHP2 inhibitörlerinin mevcut sınıf lösemilerde sık görülen SHP2 onkojenik varyantlarına karşı etkili değildir ve onkojenik SHP2'yi hedefleyen spesifik küçük moleküllerin gelişimi güncel araştırmanın konusudur. SHP2 gibi sitosolik proteinleri içeren çoğu ilaç keşif kampanyaları ile ortak bir sorun, birincil tahliller bu sürücü kimyasal keşif genellikle in vitro tahliller aday bileşiklerin hücresel hedef nişan rapor yok olmasıdır. Hücresel hedef etkileşimini ölçmek için bir platform sağlamak için hem vahşi tip hem de mutant SHP2 hücresel termal değişim tahlilleri geliştirdik. Bu tahliller, hücrelerdeki SHP2 inhibitörlerinin hedef katılımını güvenilir bir şekilde algılar. Burada, SHP2 inhibitörlerinin değerlendirilmesi ve karakterizasyonu için değerli bir araç sağlayan bu testin kapsamlı bir protokolünü salıyoruz.

SHP2-WT için termal gradyan deneyi, katlanmış bir protein için tipik ve tutarlı olan dar bir erime geçişine sahip sigmoidal hücresel termal profille sonuçlandı(Şekil 4A). SHP2 üç bağımsız etki alanından oluşur: iki SH2 etki alanı ve katalitik etki alanı(Şekil 1). Otomatik inhibe kapalı konformasyon bu etki alanları kendi kendine ilişkilendirmek; Termal profil deneyinde gözlenen erime geçişi muhtemelen hücredeki bu durumu yansıtmaktad...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors at JoVE.com

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Sağlam hücrelerde aday inhibitörleri tarafından hedef nişan değerlendirmek için yeteneği ilaç keşfi için çok önemlidir. Bu protokol, vahşi tip SHP2 veya onkojenik varyantlarını hedefleyen inhibitörlerin hücresel hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan 384 iyi biçimli hücresel termal değişim testini tanımlar.

Hücresel Hedef Etkileşiminin SHP2 (PTPN11) Fosfataz Inhibitörleri ile Değerlendirilmesi

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Tirozin fosfataz SHP2, hücresel sinyal önemli bir aracı, hücre sağkalım ve çoğalması teşvik. Ekibim kanser tedavisi için küçük molekül SHP2 inhibitörleri bulmaya odaklanmıştır. Tekniğimiz hücre-penetrants kurmak için hızlı ve güçlü bir yöntem sağlar, hem de küçük molekül SHP2 inhibitörleri hedef nişan, hücrelerde.Bu, keşif kaynaklarının verimli bir şekilde yönlendirilen bir şekilde yönlendirilen bir garantidir. Kanser tedavisi için cazip bir hedef olarak SHP2. Ve birkaç SHP2 inhibitörleri, klinik çalışmalarda bulunmaktadır.Geliştirilmiş etkinlik profilleri ile yeni nesil inhibitörleri keşfini kolaylaştırmak için tekniğimiz. Prosedürü gösteren Celeste Romero, bir araştırma asistanı ve Douglas Sheffler, bir araştırma yardımcı doçent, bizim laboratuvar dan olacaktır. HEK293 T-hücrelerini plakalardan ayırmaya başlamak için, üç mililitre hücre kopma reaktifi kullanarak.Hücreleri 12 mililitre büyüme ortamıyla seyreltin ve 1, 400 kez G'de santrifüj le dört dakika toplayın. Büyüme ortamı10 mililitre hücre damak resuspend ve trypan mavi ve bir hücre sayacı ile hücrelerin konsantrasyonu ve canlılığını ölçmek. Plaka 700, 000 katlanarak büyüyen hücreler her bir kuyuya altı iyi kültür plakası içine ve 37 santigrat derece 24 saat boyunca kuluçka ve% 5 karbondioksit.Ertesi gün, 200 mikrolitre transfeksiyon tamponuna iki mikrogram plazma DNA'sını seyreltin. Plazma DNA'sını 10 saniye boyunca girdap layın ve 4 dakika boyunca 1,400 kez G'de merkezi olarak koyun. Seyreltilmiş DNA'ya dört mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin.10 saniye boyunca girdap ve santrifüj tekrarlayın. DNA'yı 23 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın, sonra transfeksiyon karışımını altı kuyu plakasındaki hek293 T hücrelerine ekleyin ve hücreleri 24 saat daha kuvöze geri verin. 10 milimolar stok konsantrasyonu için DMSO'da gazlı taşan levhalar, seyreltik inhibitör çözeltileri hazırlamak ve bunları hemen kullanım için 384 mm'lik bir düşük ölü hacimli kaynak plakaya dağıtmak için.İstenilen inhibitörlerin veya aracın hacmini, sıvı bir işleyiciyi kullanarak 384 iyi gerçek zamanlı PCR plakasını %0,5 DMSO'dan daha az bir hedefte tespit edin. Plakaları, inert gaz temizleme ile bir plaka mühürleyici kullanarak mühür. Transfected hücreleri pre incubate büyüme ortamı hazırlamak ve 37 derece santigrat su banyosunda müfreze reaktifsatmak için.Hücreleri kuvözden çıkarın ve medyayı kuyulardan nazikçe aspire edin. Her kuyuya hücre ayırma reaktifinin 0,3 mililitresini ekleyin ve plakayı iyice örtmek için plakayı ileri geri hafifçe sallayın. Plakayı 23 derecede iki dakika kuluçkaya yatırın.Her kuyuya bir mililitre büyüme ortamı ekleyin ve kuyudaki hücreleri yavaşça pipetlendirin. Daha sonra hücreleri toplamak için dört dakika boyunca 1, 400 kez G'de 15 mililitrelik Falcon santrifüj tüpüsantrisine aktarın. Yavaşça medya aspire, sonra büyüme medya iki mililitre hücre pelet yeniden askıya.Hücre canlılığının try pan blue ve hücre sayacı kullanarak %90'dan fazla olduğundan emin olun. Hücreleri mikrolitre başına 125 hücre konsantrasyonuna seyreltin, optimum canlılık için hücreleri en fazla iki saat süreyle süspansiyonda tutarak. SHP2 inhibitörleri ile kuluçka için, steril tek kanallı çözelti yalak içine hücreleri dağıtmak.Santrifüj önceden hazırlanmış 384 iyi gerçek zamanlı PCR plaka 2, 500 kez G beş dakika, sonra mühür kaldırmak ve 125 mikrolitre çok kanallı pipet kullanmak, istenilen Wells seyreltilmiş hücrelerin beş mikrolitre eklemek için. Bir kapak olmadan 30 saniye boyunca 42 kez G plaka santrifüj, sonra bir kapak takın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir saat için plaka kuluçka. Termo cycler'ı termal profil gradyanı veya izotermal deney için el yazması talimatlara göre programla.Termocycler ısı darbesi programını başlatın ve isliç blok üzerine hesap plakasını yerleştirin. Program bittiğinde, asay plakasını çıkarın. Lisanslı algılama ana karışımı beş mikrolitre ile tam olarak her bir sayis plakası.Plakayı 42 kez G'de 30 saniye santrifüj edin ve 23 santigrat derecede karanlıkta 30 ila 60 dakika saklayın. Optimize edilmiş entegrasyon süresiile bir mikroplaka okuyucu kullanarak kemilüminesans ölçün. Yabani tip SHP2 için termal gradyan deney, katlanmış bir protein için tipik dar bir erime geçiş ile sigmoidal hücresel termal profil sonuçlandı.Allosteric inhibitörü SHP099 ile yabani tip SHP2 inkübasyonu, önemli ve ölçülebilir derecede termal profil stabilize. SHP2 stabilizasyonu, aynı zamanda allosteric bileşikler gibi SHP099 gücü ile izlendi. 10 mikromolar at, daha güçlü RMC-4550, yabani tip SHP2 için SHP099 daha stabilizasyon daha büyük bir dereceye kadar üretti.Benzersiz mekanizması sayesinde, Allosteric inhibitörleri gibi SHP099 SHP2-E76K dahil olmak üzere birçok SHP2 onkojenik mutantlara karşı daha az etkilidir. Bu bilinen özellikleri ile tutarlı shp2-E76K SHP099 tarafından sadece marjinal termal stabilizasyon görülmektedir. EPL etiket proteininin ifade düzeyi sinyal yoğunluğunu önemli ölçüde etkileyebilir.Geçici ve stably entegre yabani tip hücreler için Termal profiller. aynı varlık koşulları altında gösterilir. Birbirinden farklı eğrilerin normalleştirilmesi, efc algılama sisteminin geniş yelpazesini ortaya çıkaran karşılaştırılabilir termal profiller sağlar.384 kuyu plakasının kısa ekseninde termal degradeler üretmek için termal döngü yeteneğinden yararlanarak. bir dizi izotermal titrasyon tek bir plaka üzerinde yapılabilir. En uygun sıcaklıkta, tam 10 nokta doz-yanıt kullanarak bir isotermal titrasyon, RMC-4550 için yararlı bir EC50 verdi.Bu varlığın ilkeleri PROTAC bileşikleri tarafından indüklenen hücrelerdeki proteinlerin bozulmasını izlemek için kullanılabilir. Biz mutant SHP2 ve lösemi inhibitörlerini keşfetmek için hücresel Thelma shift tekniği kullanıyoruz, sık SHP2 onkojenik mutantlara karşı özel ilaçlar bu kanserlerin tedavisinde önemli bir etkiye sahip olacaktır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Kanser hücresel Phenotypes üzerinde Mikroçevresel etki Interrogate için Microdiziler kullanma

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...