Name: graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy at JoVE.com

نشكر د. ب. بيكس على مساعدته في بروتوكول ثقافة الخلية، و ف. واينبرغ على مراجعة المخطوطة، و ت. Trampert للمساعدة في التجارب والأرقام، س. سمولكا للمساعدة في الأرقام، وإ. أرزت لدعمه من خلال INM. يتم تمويل هذا البحث من قبل Kröner-Fresenius-Stiftung.

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-field+optical+nanoscopy.">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Transmission Electron Microscope. , (2009).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology.">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li><li>Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+cells:+connecting+structure+and+function.">Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).</li><li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture/freeze-etch+in+biological+electron+microscopy.">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).</li><li>Dahmke, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+Liquid+Enclosure+for+Single-Molecule+Analysis+of+Membrane+Proteins+in+Whole+Cells+Using+Electron+Microscopy.">Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).</li><li>Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno+EM-OM+correlative+microscopy+in+solution+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy+(ASEM).">Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM).</a> Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).</li><li>Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy+to+study+in+situ+nanocrystal+etching.">Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Graphene+and+Its+Derivatives+for+Liquid-Phase+Transmission+Electron+Microscopy+of+Radiation-Sensitive+Specimens.">The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens.</a> Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-Based+Fibers:+A+Review.">Graphene-Based Fibers: A Review.</a> Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).</li><li>Sun, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+on+gas+impermeability+of+graphene.">Limits on gas impermeability of graphene.</a> Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).</li><li>Kato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+thickness+control+of+ice+layer+on+CVD+grown+bilayer+graphene+for+cryo-TEM.">High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM.</a> Carbon. 160, 107-112 (2020).</li><li>Keskin, S., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Radiation+Damage+in+Transmission+Electron+Microscopy+of+Proteins+in+Graphene+Liquid+Cells.">Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells.</a> Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2, 743-749 (2005).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).</li><li>Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+HER2+receptor+binding+by+an+engineered+protein.">Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).</li><li>Textor, M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Preparing+Graphene+Liquid+Cells+for+Transmission+Electron+Microscopy.">Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy.</a> Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).</li><li>Henjes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+EGFR+signaling+in+cell+line+models+of+ERBB2-amplified+breast+cancer+attenuates+response+towards+ERBB2-targeting+drugs.">Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs.</a> Oncogenesis. 1, 16 (2012).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Stoichiometry+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Intact+Cells+using+Correlative+Microscopy.">Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).</li><li>Kohl, H., Reimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transmission electron microscopy: physics of image formation. , (2008).</li><li>Yi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+immunogold+labeling+of+cell+surface+proteins+and+viral+glycoproteins+for+cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applications.">Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).</li><li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells.">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li><li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3+nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy.">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).</li><li>Meier, C., Beckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+fracture:+new+avenues+for+the+ultrastructural+analysis+of+cells+in+vitro.">Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+scanning+transmission+electron+microscopy:+imaging+protein+complexes+in+their+native+environment+in+whole+eukaryotic+cells.">Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).</li><li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+radiation+damage+in+the+TEM.">Control of radiation damage in the TEM.</a> Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).</li><li>Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-enabled+electron+microscopy+and+correlated+super-resolution+microscopy+of+wet+cells.">Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells.</a> Nature Communications. 6, 7384 (2015).</li><li>Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+mobility+and+associated+reshuffling+of+cytoplasm+during+chemical+fixation.">Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).</li><li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Electron+Microscopy+Using+Graphene+Veils.">Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , (1995).</li><li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

لفهم أفضل وظيفة البروتين، من المهم الحصول على معلومات حول مواقع البروتين في غشاء البلازما من الخلايا السليمة. وتشمل طرق الحصول على هذه المعلومات المجهر الفلوري فائقة الدقة1،2. على الرغم من أن المجهر فائقة الدقة قد تطورت على مدى السنوات الماضية، لا يزال حلها يقتصر على حوالي 20 نانومتر للظروف العملية للتجارب الخلية، في حين أن البروتينات مستقبلات نموذجية لها أحجام في حدود 1-10 نانومتر. التصوير من البروتينات على خلية واحدة ومستوى جزيء واحد مع دقة كافية لتصور البروتينات هو ممكن مع EM. ولكن بسبب قسم، أساليب EM التقليدية عادة لا تترك الخلية سليمة26، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات الهامة حول السياق والتوزيع المكاني للبروتينات في غشاء البلازما. وقد وضعت أساليب للخلايا كاملة مع التبريد-TEM6،فمن الممكن الجمع بين وضع العلامات البروتين مع cryo-EM27،كما ثبت cryo-STEM28. ومع ذلك ، يتم تحسين سير عمل cryo-EM لدراسة البنية الفائقة الخلوية وبنية البروتين ، وليس الكثير لتحليل التوزيعات المكانية للبروتين الغشائي. الحرجة تجفيف نقطة آخر طريقة كاملة لإعداد الخلية ولكن تخضع عينات لعدة خطوات التجفيف ، وتقنية للغاية تستغرق وقتا طويلا29. كما تم فحص البروتينات الغشاء عن طريق تجميد الكسر7. في هذا الأسلوب، يتم إصلاح الخلايا، مجمدة، وكسر. يتم تكرار الأجزاء المكسورة بطبقات الكربون والبلاتين ، ويتم إزالة العينة البيولوجية. ويمكن بعد ذلك أن يتم تحليل النسخ المتماثلة مع EM30. تحليل الخلية بالكامل هو المستحيل مع كسر تجميد لأن المعلومات حول توزيع البروتينات في الغشاء في سياق الخلية كلها يتم فقدان.
الأسلوب المعروض هنا يسمح بدراسة غشاء الخلية دون الحاجة إلى شريحة رقيقة العينة9،31. يتم الاحتفاظ الخلايا سليمة بحيث توطين البروتينات غشاء مرئيا من الصور الفلورية، والتي ترتبط مع الصور EM. وقد أظهرت دراسة البروتينات في الخلية الواحدة ومستوى جزيء واحد داخل الخلايا السليمة في حالة رطبة أن تكون ممكنة مع قرار من 2 نانومتر باستخدام STEM من البروتينات التي تحمل علامة QD باستخدام هذه الطريقة الضميمةالجرافين 9. إن الحفاظ على الخلايا في حالتها الأصلية أمر بالغ الأهمية، لأنه يحافظ على التوزيع المكاني للبروتينات الغشاءية بحيث تكون التحليلات ممكنة على مستوى الخلية الواحدة والجزيء الواحد، وهو أمر مهم لفهم وظائف البروتين، وتطوير أدوية جديدة للنهج العلاجية.
جانب آخر حاسم من التصوير العينات البيولوجية مع EM هو الضرر الإشعاعي للعينات الناجمة عن شعاع الإلكترون. وغالبا ما تشمل الحلول الحد من جرعة الإلكترون قدر الإمكان أو طرق طلاء مختلفة، مثل تغليف العينة بين طبقات رقيقة من الكربون32. يوضح أسلوبنا أن طلاء الجرافين يقلل من القطع الأثرية الناتجة عن الحزم التي تظهر على سطح الخلية للعينات غير المغلفة. فحص العينات البيولوجية الثابتة كيميائيا، والجرافين المغلفة ممكن تحت إشعاع شعاع الإلكترون في 200 طاقة شعاع كيلوفولت تصل إلى D = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/ Å2 دون أضرار الإشعاع، مثل البقع الساطعة، التي تظهر على العينة. بالمقارنة مع أساليب EM الأخرى التي تنطوي على إعداد عينة مفصلة ، على سبيل المثال ، تلطيخ ، تضمين ، (cryo -) قسم ، التكسير ، وما إلى ذلك ، فإن الطريقة الموصوفة هنا أقل استهلاكًا للوقت. يتم وضع العلامات من البروتينات في غضون ساعات قليلة، وطلاء الجرافين يتطلب فقط حوالي 15 دقيقة للباحثين المدربين. إعداد العينة قابل للمقارنة مع الإجراءات اللازمة للمجهر الفلوري.
يمكن تعديل البروتوكول في بعض الخطوات. الجرافين على رقاقة يمكن أيضا أن يكون الهواء المجففة للتأكد من أن الجرافين لا يتحرك عندما لطخت مع ورقة مرشح. إذا كان الجرافين ملوثاً بالملح ، فمن الممكن السماح له بالتعويم على سطح الماء لمدة ساعة واحدة تقريباً لإذابة الملح وبالتالي تقليل التلوث. يمكن تقليل التلوث النحاسي أو PMMA على الجرافين عن طريق تمديد خطوات الحفر المقابلة في البروتوكول. وقد وصفت طرق طلاء الجرافين الأخرى حيث، على سبيل المثال، تم إيداع الجرافين-PMMA مباشرة على الخلايا، وتمت إزالة PMMA عن طريق الغسيل في الأسيتون بعد ذلك33. في طريقتنا، تمت إزالة PMMA قبل الطلاء لتجنب أي ضرر محتمل للخلايا الناجمة عن خطوات غسل الأسيتون إضافية. تم اختيار NaCl كركيزة هنا لأنها مسطحة ، لذلك لا تجعد الجرافين ، وتذوب في الماء لإطلاق سراح الجرافين9. الى جانب ذلك ، يمكن قطعه في الحجم المطلوب ولا تترك أي بقايا الركيزة على الجرافين. ولكن مع أخذ هذه المعايير في الاعتبار، يمكن استخدام ركائز أخرى مثل كلوريد البوتاسيوم أيضا.
للحد من فرصة التكتل المحتمل الذي يسببه التسمية ، يمكن تنفيذ خطوة التثبيت GA مباشرة بعد تثبيت FA ، وبعد ذلك يتم شل جميع البروتينات الغشاء. الخطوة التثبيت الأول مع FA بالفعل بإصلاح الهيكل البيولوجي ولكن انخفاض مستوى انتشار البروتين غشاء قد تحدث لا يزال34،وربما يؤدي إلى التكتلات المستحثة التسمية بسبب وجود متعددة Streptavidin لكل QD. التثبيت مع الجمعية العامة قد يؤدي إلى إشارة autofluorescence أثناء LM، وبالتالي، يتم بعد LM في البروتوكول الموصوف ولكن يمكن تخفيض كما هو موضح في مكان آخر34. Cacodylate العازلة هي سامة جدا، والمثبتات الأخرى يمكن استخدامها كذلك، ولكن يستخدم cacodylate هنا كما هو العازلة المستخدمة عادة لبروتوكولات م، يتجنب الترسبات، ويمنع نمو البكتيريا والفطريات، ومتوافق مع أيونات الكالسيوم التي هي ضرورية للحفاظ على سلامة ultrastructural من الأغشية الدهنية35. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام أكسيد التراكسيد الأوزميوم كتشل تثبيت إضافية لتثبيت الدهون. وهذا من شأنه أن يساعد على تعزيز التباين في بنية الخلية، ولكن أيضا إضافة معدن آخر إلى النظام والحد من التباين التي تم الحصول عليها على QDs.
يحتوي البروتوكول الموضح هنا على العديد من الخطوات التي تتطلب تعليمات جيدة. مطلوب بعض التدريب قبل التعامل مع الرقائق الدقيقة لتجنب خدش سطح سي إن من الرقائق الدقيقة ومنع الكسر. كما ذكر من قبل، فمن المستحسن لإعداد الرقائق الدقيقة في التكرارات كما يمكن أن تنكسر نافذة SiN من وقت لآخر. الحصول على العدد المطلوب من الخلايا على رقاقة يتطلب أيضا بعض الخبرة. طلاء الخلايا مع الجرافين يحتاج إلى بعض التدريب لأنه يمكن أن يكون من الصعب العثور على زاوية الميل الحق لتعويم الجرافين على الماء. عند اصطياد الجرافين من الماء ، قد يكون من الصعب أيضًا رؤية الجرافين الرقيق. بمجرد أن يكون الجرافين على الرقاقة ، يجب أن يتم لطخ المياه الزائدة بورقة تصفية. وينبغي أن يتم ذلك فقط مع غيض من ورقة مرشح مثل لتجنب إزالة الجرافين من رقاقة.
طلاء الجرافين منع القطع الأثرية من الظهور على العينة. ولكن لD < 4 × 102 ه-/Å2 أيضا لم تظهر أي قطع أثرية للعينة غير المغلفة، وظهرت القطع الأثرية لعينات غير مغلفة فقط 2. وهكذا، يبدو أن فحوصات الخلايا غير المغلفة ممكنة أيضًا، على الرغم من أنه سيكون من الأفضل استخدام الجرافين وتجنب خطر تكوين القطع الأثرية. ويمكن تحليل تكوين هذه القطع الأثرية في المستقبل لإعطاء تلميحات حول كيفية منع تشكيلها. فيما يتعلق باستقران الهيكلية للخلايا فقط لوحظ تحسن طفيف من طلاء الجرافين. وقد استقرت الخلايا الثابتة على ما يبدو في المناطق الرقيقة التي تم فحصها، حيث كان هيكلها على مقربة من غشاء سي إن. ما لم ندرس هنا، ومع ذلك، كانت تجفيف التحف التي من المعروف أن تحدث للعينات الخلوية عندما تتعرض للفراغ4. من شأن تجفيف الخلايا يؤدي إلى انكماش الخلايا بحيث أيضا مسافات QD سوف تتغير نتيجة لذلك. بالنسبة لجرعة الإلكترون المستخدمة هنا ، ظلت مسافة QDs للعينات المغلفة بالجرافين وغير المغلفة مستقرة. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لدراسة تأثير طلاء الجرافين على الخلايا لM.
أحد القيود على هذه الطريقة هو أن تثبيت المواد الكيميائية للخلايا ضروري؛ لذلك، لا يمكن إجراء أية تجارب الخلية المباشرة. ولكن في حالة عدم الحاجة إلى وضع العلامات واستخدام الخلايا ذات الاستقرار الهيكلي العالي ، على سبيل المثال البكتيريا ، يمكن وضع الخلايا غير المثبتة في الجرافين لـ EM36 وإن كان مع تحمل جرعة إلكترون مختلفة. أيضا، البروتينات غير قابلة للكشف مباشرة، لذلك هناك حاجة QDs لتصور البروتينات. سوف تستفيد الطريقة من تسميات أصغر. نقطة النقاش هي ما إذا كان من الجيد أو السيئ أن البنية الفائقة ليست مرئية بوضوح. أسلوبنا مشابه لتلك التي من المجهر الفلوريسين حيث البروتينات المختارة فقط مرئية37. زيادة وضوح البنية الفائقة أيضا إضافة المزيد من المعلومات إلى الصورة، ثم في مرحلة ما منع الكشف عن مواقع التسمية الفردية. وعلاوة على ذلك، فإن الطريقة المذكورة هنا هي لأنواع بروتينية واحدة، وهناك حاجة إلى إضافات البروتوكول لتكون قادرة على تسمية البروتينات المتعددة. وأخيراً، تعمل الطريقة عندما يتوفر جزيء صغير من التقارب العالي ملزم على وجه التحديد مثل الأجسام المضادة21 أو الأجسام النانوية38. الأجسام المضادة المستخدمة عادة أكبر بكثير، ومن شأنها أن تمنع الكشف عن الحالة الوظيفية لالوحدات الفرعية البروتين في oligomers.
طريقتنا مفيدة لدراسة وظيفة البروتين على الخلايا الكاملة باستخدام EM مع الحفاظ على الخلايا في حالة رطبة. من الممكن بسهولة فحص سلسلة من الخلايا. ويمكن دراسة نوع آخر من الخلايا والبروتينات كذلك. إذا لم تكن هناك حاجة لوضع العلامات البروتينية، يمكن استخدام مجموعة فرعية من البروتوكول لطلاء الجرافين من مجموعة واسعة من العينات البيولوجية. القدرة على دراسة الخلايا كلها ذات الصلة في البحوث الخلوية لفهم الارتباطات وظيفة البروتين الغشاء على المستوى الجزيئي.

تحليل وظيفة البروتين الغشاء ضروري للبحوث البيولوجية الخلية، وتطوير المخدرات. تتضمن فئة من التجارب الهامة فحص مواضع البروتين الغشاء في الخلايا. ويمكن استخدام هذه المعلومات لاستنتاج استنتاجات حول تجميع البروتينات في مجمعات البروتين ومواقعها المحددة في غشاء البلازما، والتي، عن طريق التجميع الديناميكي والتفكيك، يدفع مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية. من بين التقنيات الأخرى، يتم استخدام المجهر الضوئي (LM) والمجهر الإلكتروني (EM) لدراسة وظائف البروتين في الخلايا. LM يسمح بتحليل الخلايا الكاملة في السائل; ومع ذلك ، يقتصر القرار على 200-300 نانومتر للتقليدية و 20 نانومتر للمجهر الفلوري فائقة القرار تحت الظروف العملية1،2. EM يوفر حوالي 1 Å القرارات3، ولكن إعداد العينة التقليدية يتطلب الجفاف ، تلطيخ المعادن لتعزيز التباين الصورة ، وتضمين في مادة متزايدة ، مثل الراتنج ، لنقل المجهر الإلكترون (TEM)4. للحفاظ على العينات البيولوجية في بيئة تشبه أكثر من السكان الأصليين ، يمكن استخدام تقنيات cryo-EM5،6. يتم تجميد العينات بسرعة إلى جليد غير متبلور ، وإذا لزم الأمر ، يتم تقسيمها. خيار آخر هو تجميد كسر م7.
وقد ظهرت تقنيات EM لدراسة البروتينات الغشاء داخل الخلايا السليمة في وطنهم، والدولة السائلة في العقد الماضي8،9،10،11. تم تحقيق دقة مكانية من 2 نانومتر على نقطة الكم (QD) يسمى البروتينات الغشاء في الخلايا الكاملة التي تزرع على غشاء سي إن ومحاطة بطبقة من الجرافين9.
هنا، يتم وصف تفاصيل بروتوكول لوضع العلامات البروتين وطلاء الجرافين9،12. الهدف من هذا البروتوكول هو تحليل التوزيع المكاني لـ HER2 في غشاء الخلايا الثابتة الكاملة ، مع الحفاظ على الخلايا في حالة رطبة. طلاء مع الجرافين يمنع تجفيف الخلايا في فراغ، ويقلل أيضا من أضرار الإشعاع13. هذه الطريقة توفر معلومات حول البروتينات الغشاء المسمى داخل غشاء البلازما سليمة, ولكن الأسلوب ليست مفيدة لدراسة البنية الفائقة الخلوية كما هو الحال عادة مع EM.
الجرافين هو أنحف المواد النانوية المعروفة، ويتكون من ذرة كربون واحدة ورقة بلوري سميكة مرتبة في شعرية العسل14. لديها خصائص فريدة من نوعها بما في ذلك المرونة العالية والقوة الميكانيكية. وقد أظهرت الأبحاث الحديثة أن الجرافين الخالي من العيوب غير قابل للاختراق للغازات والسوائل ، ولكن العيوب تسمح بتغلغل الهيدروجين15. ويمكن تقليل هذا التسرب باستخدام الجرافين متعدد الطبقات كما هو مستخدم هنا. وقد أظهرت الجرافين Bilayer مؤخرا أن تكون مفيدة كدعم لعينات التبريد-EM، وتحسين تجانس طبقة الجليد رقيقة مقارنة أكسيد الجرافين حيث يمكن تشكيل طبقات غير متجانسة فقط16. كما تبين الجرافين للحد من تلف شعاع العينات البيولوجية أثناء مرحلة انتقال السائل المجهري الإلكترون13,17. كتجربة مثالية، HER2 أعرب عنها في الثدييات سرطان الثدي خلية خط SKBR3 كان المسمى مع QDs18 وتوزيعها المكاني المسجلة باستخدام STEM. كانت الخلايا بذر على رقاقة Si مع غشاء سي إن شفاف إلكترون19. تم اختيار الرقائق الدقيقة كدعم لأنها قوية ، متوافقة مع LM و EM ، ويمكن إجراء وضع العلامات بالكامل مباشرة على رقاقة19. بعد مرفق الخلية، تم تسمية HER2 ببروتوكول20تسمية من خطوتين . أولاً، تم إرفاق مركب 21 من الأجسام المضادة للأجسام المضادة لـ HER2 المضادة للأجسام الحيوية21 بـ HER2. ثم تم إصلاح الخلايا كيميائيا لمنع التجمع مستقبلات التسمية الناجمة، وزيادة استقرار ultrastructure الخلوية. تم ربط QDs المغلفة بـ Streptavidin لاحقًا بمجمع imetic HER2-Anti أُسمتيك. سمحت إشارة الفلورس الساطعة والنوى الكثيفة بالإلكترونات من QDs بالمنظار الفلوري والإلكتروني (CLEM)20. CLEM مفيد بشكل خاص لأن المناطق الخلوية التي تهم تحليل STEM يمكن اختيارها من صور المجهر الفلوريس نظرة عامة تسليط الضوء على توطين HER2 على الخلايا. تم تحليل الخلايا عن طريق المجهر المفلور لتحديد المناطق الخلوية ذات مستويات HER2 عالية. بعد ذلك، تم نقل ورقة سميكة طبقة 3-5 من الجرافين على الخلايا للطلاء9،22. وفي وقت لاحق، تم تركيب العينة في حامل عينة EM. تم الحصول على بيانات STEM باستخدام كاشف الحقل الداكن الحلقي (ADF) ، مما يوفر معلومات حول التوزيع المكاني لـ HER2 على سطح الخلية بالنسبة لموقع سطح الخلية ، ولكن لم يعط أي معلومات حول البنية الفائقة للخلية. لتحديد استقرار العينة تحت إشعاع الشعاع الإلكتروني، تم فحص العينات بجرعة متزايدة(D)في سلسلة صور. تم التحقيق في الفرق بين العينات المغلفة بالجرافين وغير المغلفة. تم تقييم عدة أنواع من الأضرار الإشعاعية.
البروتوكول الموصوف هنا يستخدم HER2 overexing الثدييات سرطان الثدي خلية خط SKBR3 كنظام نموذجي لاستهداف HER223. ويتضمن البروتوكول إعداد عينة واحدة مغلفة بالجرافين، وعينة واحدة مماثلة ولكن دون طلاء الجرافين للمقارنة. يتم إعداد التجربة في تكرار منذ نافذة SiN قد كسر مرة واحدة كل حين، والحصول على نسخة مكررة تجريبية في معظم الحالات. العائد العام للطريقة هو معنى عال أن رقائق مع الخلايا المغطاة الجرافين عادة ما يتم الحصول عليها مع خطأ استثنائي حتى ولو لم يكن يمكن تغطية نافذة سي إن بأكملها مع الجرافين في جميع الحالات. لم يتم وصف التكرارات في البروتوكول.
إن بروتوكول وضع العلامات (الخطوات 1-5) مشابه لبروتوكول وضع العلامات على مستقبلات عامل النمو البشرة في الخلايا الليفية COS7 التي نشرت سابقا24؛ ويشار إلى التفاصيل في تلك الورقة فيما يتعلق بمعالجة الرقائق الدقيقة، واستخدام ألواح البئر. تم تحسين البروتوكول التالي لوضع علامة على HER2 ، طلاء الجرافين9، وفحص تحمل الإشعاع للعينة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone for HPLC (min. 99.8 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2626-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL54 analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany</td>
			<td>30029077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free, &#8805; 98 %, for molecular biology</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 &#181;M</td>
			<td>Affibody, Solna, Sweden</td>
			<td>10.0817.02.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F</td>
			<td>JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylic acid sodium salt trihydrate &#8805; 98 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5169.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>627861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>5401000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 ml sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>9286.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>PK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>4430000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2222-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>F8141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Leica DMI6000</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>10099141</td>
			<td>lot number: 1751893</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Goat Serum, New Zealand origin</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>lot number: 1788320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy 48R CO2 Incubator</td>
			<td>New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>CO48310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan Model 950 Solarus&#151; Plasma Cleaner</td>
			<td>Gatan GmbH, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine &#8805; 98.5 % Ph.Eur., USP, BP</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Heidolph Instruments GmbH &#38; CO. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>MR 3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0557-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSc-Advantage&#151; Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocean Microchips SiN window 400x150 &#181;m, 200 nm spacer</td>
			<td>DENSsolutions, Delft, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>10 mL: C542.1 20 ml: T550.1</td>
			<td>purchased via Carl Roth GmbH&#38;Co. KG, Karlsruhe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>VO 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td>#291-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfekt-Kescher with handle</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2-200&#181;l: 7695892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>0.1-10 &#181;l: 7695880 2-100 &#181;l: 7695883 100-1000 &#181;l: 7695886 1250 &#181;l XL: 7695887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 &#181;M</td>
			<td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased</td>
			<td>Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA</td>
			<td>94-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell, Dassel, Germany</td>
			<td>300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo Microscope Leica M60</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath SW22</td>
			<td>Julabo GmbH, Seelbach, Germany</td>
			<td>9550322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>HN00.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm</td>
			<td>International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA</td>
			<td>9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, &#8805; 99.5 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium persulfate</td>
			<td>carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>4365.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 &#181;m</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P668.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm</td>
			<td>ACS material, Pasadena, CA, USA</td>
			<td>TTG30011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Dumoxel 03</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0103-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Inox 02</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0102-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, plastic replaceable tip</td>
			<td>Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland</td>
			<td>5SVR.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water ROTISOLV HPLC gradient grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>A511.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy

يتم وصف بروتوكول للتحقيق في مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2) في غشاء البلازما السليمة لخلايا سرطان الثدي باستخدام المجهر الإلكتروني للمسح الضوئي للإرسال (STEM). نمت خلايا من الثدييات سرطان الثدي خلية خط SKBR3 على رقائق السيليكون مع نيتريد السيليكون (SiN) النوافذ. كانت الخلايا ثابتة كيميائيا، و وصفت بروتينات HER2 مع الجسيمات النانوية نقطة الكم (QDs)، وذلك باستخدام بروتوكول ملزم البيوتين streptavidin على مرحلتين. كانت الخلايا مغلفة بالجرافين متعدد الطبقات للحفاظ على حالة رطبة ، وحمايتها من تلف شعاع الإلكترون خلال STEM. لفحص استقرار العينات تحت إشعاع الشعاع الإلكتروني، تم إجراء تجربة سلسلة جرعات. تمت مقارنة العينات المغلفة بالجرافين وغير المغلفة. شعاع الضرر الناجم، في شكل التحف مشرق، ظهرت لبعض العينات غير المغلفة في زيادة جرعة الإلكترون D،في حين لم تظهر أي قطع أثرية على عينات المغلفة.

ويبين الشكل 1A الخلايا المصنفة في مثل هذه الطريقة التي يتم تغطية النافذة ولكن مع مساحة كافية للسماح لهم لتسطيح بها والتمسك بها، مما يؤدي إلى التقاء حوالي 2/3rd (الشكل 1B). في حالة يتم بذر العديد من الخلايا على رقاقة(الشكل 1C)،هناك مساحة غير كافية لجميع الخلايا للتمسك رقاقة. الشكل 1D يظهر نفس رقاقة بعد 24 ح. أكثر من نصف الخلايا لم تتسطح من ناحية أخرى، إذا كانت الخلايا قليلة جداً هي المصنفة (الشكل 1E)،فإن نافذة SiN في نهاية المطاف مع مساحة فارغة كبيرة بعد 24 ح كما رأينا في الشكل 1F. ويبين الشكل 1G صورة DIC للخلايا في الشكل 1A والشكل 1B. ويبين الشكل 1H صورة الفلورس المقابلة الملونة كاذبة باللون الأصفر مما يدل على وضع العلامات الناجحة HER2.
تظهر بيانات العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات التمثيلية في الشكل 4. تم التحقيق في خلايا SKBR3 المغلفة بالجرافين (العمود الأيسر) وغير المغلفة (العمود الأيمن). الشكل 4A،B إظهار M = 800x صور نظرة عامة من الخلايا على النافذة. تم تصوير المناطق المعروضة على أنها insets في M = 80,000x خلال سلسلة الجرعة ، انظر الشكل 4C،D. QDs مرئية كما النقاط المضيئة هنا. الشكل 4E والشكل 4F تظهر M = 50،000x الصور المكبرة المكتسبة في مواقع المستطيلات في الشكل 4C،D. تم تسجيل كل من الصور بعد الحصول على سلسلة جرعة مع D = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/Å 2. تم تسجيل سلسلة الجرعة في M = 80،000x. ويمكن التعرف على المناطق المكشوفة على أنها مستطيلات، حيث كان المستطيل مرئياً بوضوح للعينة غير المغلفة(الشكل 4F).
للتحقق من وجود الجرافين، تم الحصول على أنماط الحيود من المناطق التي لا توجد بها خلايا، ولكن مع أو بدون الجرافين على نافذة سي إن. وقد لوحظ الهيكل سداسي الجرافين في نمط الانعراج من عينة المغلفة الجرافين (الشكل 4G) ، في حين كان غائبا عن العينة غير المغلفة (الشكل 4H). نمط الانعراج من الجرافين البلورية واحد سيكون لها ستة أضعاف التماثل بسبب هيكل سداسية مرتبة للغاية من الجرافين. لذلك، فإن بنية سداسية تشير إلى وجود الجرافين على العينات.
ومن أجل تحري تأثير إضاءة شعاع الإلكترون على العينة، تم الحصول على صور STEM في سلسلة صور بجرعة إلكترون متراكمة. تظهر النتائج التمثيلية للعينات غير المغلفة والمغلفة بالجرافين في الشكل 5A-D والشكل 5E-G، على التوالي. تم الحصول على جميع البيانات على حافة الخلية، حيث الخلية هي المسطحة، وبالتالي فإن الهيكل الملاحظ هو الأقرب إلى غشاء سي إن. أدى التعرض للعينات غير المغلفة إلى هياكل ساطعة تظهر على أسطح الخلايا عند D = (1.9 ± 0.1) × 103 e-/ Å2 (الشكل 5B). أصبحت هذه الهياكل أكبر بجرعات أعلى ، لذلك كانت مرئية بوضوح في الصورة الأخيرة للسلسلة عند D = (7.8 ± 0.4) × 103 e-/Å 2 (الشكل 5C ، D). لم تظهر هذه البقع على أي من العينات المغلفة بالجرافين(الشكل 5E-G).
تم إعداد وفحص رقائق إضافية باستخدام البروتوكول الموصوف في ما سبق. وتم التحقيق في ما مجموعه ست عينات مغلفة وسبع عينات غير مغلفة. اثنان من أصل سبع عينات غير مغلفة أظهرت هذه القطع الأثرية. لم تظهر أي من العينات المغلفة أي نقاط مضيئة إضافية.
وكمقياس آخر للأضرار الإشعاعية، تم فحص المسافة بين الـ QDs. إذا حدث ضرر هيكلي، يتوقع المرء أن تتغير المسافات بين QDs. تم قياس التغيرات في المسافات لأزواج مختلفة من QDs مع تراكم D لنطاق من مسافات الزوج. ويبين الشكل 5H أن التغير النسبي للجسيمات بالنسبة للعينات غير المغلفة بقي دون 1.3 في المائة في المتوسط، في حين ظل متوسط المسافة النسبية دون 0.8 في المائة للعينات المغلفة. يمكن للمرء ، لذلك ، أن يستنتج أن طلاء الجرافين استقرت العينة ولكن العينات المجففة دون طلاء الجرافين كانت مستقرة بشكل ملحوظ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> الشكل 1: بذر الخلية على نافذة SiN من رقاقة السيليكون و HER2 المسمى. (أ)صورة مثالية لمنطقة نافذة SiN مع خلايا SKBR3 5 دقيقة بعد البذر على رقاقة. (B) الخلايا نفسها تنتشر على نفس نافذة SiN بعد 24 ح.(C) خلايا SKBR3 على رقاقة Si 5 دقيقة بعد البذر. (D) نفس الخلايا كما في (C) بعد 24 ح. لم الخلايا لا تسطيح بشكل صحيح كما كان هناك الكثير من الخلايا على رقائق على البذر. (E) الخلايا على رقاقة 5 دقيقة بعد البذر. (F) كانت بعض الخلايا فقط مرئية على النافذة لأن عدد قليل جدا من الخلايا كانت تزرع على رقاقة. (G) صورة DIC لنفس الخلايا SKBR3 بعد وضع علامة QD على HER2. (H) صورة تراكب من DIC وصورة الفلورسنسي المقابلة لخلايا SKBR3 المسماة مع HER2-QD655 (الملونة كاذبة باللون الأصفر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> الشكل 2: تنظيف ونقل الجرافين على بلورات NaCl. (أ) يتم غمر PMMA-الجرافين-على-بوليمر في المياه النقية لإطلاق الجرافين PMMA. يمكن القبض PMMA-الجرافين مع شريحة زجاجية. (ب)تم حفر التلوث القائم على النحاس باستخدام محلول persulfate الصوديوم. لتنظيف الجرافين، تم نقله إلى منقار يحتوي على المياه الأيونية. وتكررت هذه الخطوات 3 مرات. ثم تم نقل الجرافين PMMA إلى محلول مشبع من NaCl في الماء النقي. تم استخدام بلورة NaCl لالتقاط الجرافين من محلول الملح. (C) تم تجفيف الجرافين PMMA على بلورة NaCl لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة PMMA عن طريق احتضان الكتلة في الأسيتون لمدة 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">دقيقة.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> الشكل 3: طلاء الجرافين من الخلايا المصنفة على رقاقة Si. (أ)إجراء طلاء الجرافين. يتم تحرير الجرافين على كريستال NaCl على سطح الماء. ثم يتم القبض على قطعة الجرافين مع حلقة معدنية ونقلها إلى رقاقة Si. (B) رقاقة (2.0 × 2.6 ملم) مع نافذة SiN من أبعاد 400 × 160 ميكرومتر دون الجرافين. كانت خلايا SKBR3 مرئية كنقاط داكنة. (C) الجرافين (دائرة حمراء) تطفو على سطح من القارق مليئة بالماء. (D) الجرافين اشتعلت مع حلقة معدنية. (E) رقاقة تعلق على قطرات الماء بحيث الجرافين كان على رأس نافذة SiN. (F) رقاقة بعد طلاء الجرافين. كان الجرافين مرئيًا كوميض أرجواني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> الشكل 4: STEM من الخلايا المغلفة الجرافين وغير المغلفة SKBR3 على نافذة SiN. (أ)صورة STEM لعينة مغلفة من الجرافين تم الحصول عليها في M = 800x.(ب)صورة STEM لعينة غير مغلفة تم الحصول عليها في M = 800x . (C) M = 80،000x صورة مسجلة في موضع المستطيل الأزرق في A. تمثل الخطوط الصفراء أمثلة على المسافات التي تقاس داخل الجسيمات. (D) M = 80000x صورة مسجلة في موضع المستطيل الأزرق في B. يمثل الخط الأصفر أمثلة على المسافات التي تم قياسها داخل الجسيمات. (E) M = 50،000 س صورة من نفس المنطقة C يتعرض لD = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/ Å2. (F) M = 50،000x صورة من نفس المنطقة كما D وتعرض لD = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/ Å2. المنطقة المكشوفة شوهدت بوضوح (G) نمط الانعراج لعينة مغلفة بالجرافين من منطقة بدون خلايا. التماثل ستة أضعاف من الجرافين مرئية كما النقاط المضيئة. (H) نمط الحيود من عينة دون الجرافين تظهر أي بقع مضيئة 6 أضعاف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> الشكل 5: القطع الأثرية الناشئة على عينات دون طلاء الجرافين. ( أ) الصور الأولى للمناطق على عينات دون طلاء الجرافين المكتسبة في M = 80،000x، وتعرض لD = (0.39 ± 0.02) × 102 ه-/ Å2. (ب) الصور مع القطع الأثرية الأولى الناشئة عند D = (1.94 ± 0.1) × 103 e-/ Å2 (الأسهم الصفراء). (C, D) آخر صورة للسلسلة التي تم الحصول عليها مع D = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/ Å2. القطع الأثرية كانت مرئية كنقاط مضيئة. (E-G) عينات مغلفة الجرافين دون الناشئة عن القطع الأثرية. (هـ) D = (0.39 ± 0.02) × 102 ه-/Å2 (F) D = (1.94 ± 0.1) × 103 e-/Å2 (G) D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/ Å2. (H) التغير النسبي في المسافات الجسيمية للعينات المغلفة بالجرافين وغير المغلفة. تم تحليل اثنين من العينات غير المغلفة التي تبين القطع الأثرية، واحدة منها مبينة في (A-C)، وآخر صورة من العينة الثانية في D، فضلا عن ثلاث عينات المغلفة (واحد هو مبين في E-G). وفي المجموع، تم فحص عشرة أزواج من QD لكل عينة بمسافات تتراوح بين 250 نانومتر و3 ميكرومتر. ويعكس التغير النسبي متوسط جميع القياسات في مجموعة واحدة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول التكميلي 1: وصفات للحلول والمخازن. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy at JoVE.com

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

هنا هو بروتوكول لوضع العلامات البروتينات الغشاء في خلايا الثدييات وطلاء العينة مع الجرافين للمرحلة السائلة المسح المجهري الإلكترون الإرسال. الاستقرار من العينات ضدّ الضرر يسبّب بالإشعاع يستطيع أيضا درست مع هذا بروتوكول.

حاوية الجرافين من خلايا الثدييات الثابتة كيميائياً للمجهر الإلكتروني للمرحلة السائلة

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

هذه الطريقة تحافظ على العينات البيولوجية في بيئة محلية ويقلل من شعاع الإلكترون الناجم عن القطع الأثرية. الميزة الرئيسية هي أن هذه التقنية قابلة للتطبيق على خلايا كاملة. لذلك لا تحتاج الخلايا إلى الجفاف أو الملطخة أو المقطعة قبل المجهر الإلكتروني.القدرة على صورة المستقبلات على الخلايا السرطانية في سياق غشاء البلازما كله سليمة هو جانب رئيسي يمكن أن يؤدي إلى نهج العلاج الجديد وتطوير أدوية جديدة لمكافحة السرطان. سوف أثبت العمل مع الخلايا، طلاء الجرافين، والمجهر، وسيركان كيسكين سوف تظهر كيفية إعداد الجرافين. للبدء، إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى بئرين من 96 بئر لوحة تحتوي على PLL و FLP المغلفة رقائق صغيرة مع غشاء نيتريد السيليكون التي تواجه لأعلى و 50 ميكرولترات من المتوسطة خالية من المصل.احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق للسماح للخلايا لتعلق على رقاقة. تحقق من كثافة الخلايا الموجودة على الرقاقة مع مجهر مقلوب وتأكد من أن الخلايا تغطي النافذة بمساحة كافية لتسطيحها والتمسك بها. لوضع علامة HER2 في الخلايا، ضع الرقائق الدقيقة في آبار الصف الأول من لوحة الملصقات.ثم، وغسل الرقائق مع برنامج تلفزيوني BSA. لمنع الربط غير المحدد للجسم المضاد، قم باحتضان الرقائق الدقيقة باستخدام PBS BSA GS لمدة خمس دقائق. ثم مع 200 نانومولر الأجسام المضادة المحاكاة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.لإزالة الجرافين PMMA من البوليمر، ماصة بضع قطرات من الماء على البوليمر حول الجرافين PMMA. ثم، تزج به في الماء بزاوية من 30 إلى 45 درجة لإطلاق الجرافين PMMA. لحفر الملوثات القائمة على النحاس، prepair حل 50 ملليلتر من 0.42 بيرسول الصوديوم في الماء.استخدام شريحة زجاجية قياسية لنقل الجرافين PMMA في محلول persulfate الصوديوم مع الجانب الجرافين إلى أسفل. سوف تطفو الجرافين PMMA إلى أعلى الحل. اتركه هناك بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، نقل الجرافين PMMA من محلول persulfate الصوديوم إلى المياه النظيفة. دعه يطفو في الماء لمدة نصف ساعة. كرر الغسيل ما مجموعه ثلاث مرات لإزالة جميع بقايا persulfate الصوديوم من الجرافين PMMA.ثم، نقل الجرافين PMMA على الكريستال كلوريد الصوديوم. إعداد محلول مشبع من كلوريد الصوديوم في الماء في طبق بيتري ونقل الجرافين PMMA على رأس الحل مع الجانب الجرافين أسفل. عقد الكريستال كلوريد الصوديوم مع ملاقط والتقاط الجرافين PMMA العائمة.ثم، عقد عموديا لمدة دقيقتين للسماح للمياه الزائدة تتدفق. اتركه يجف إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ويخبز في فرن عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة المياه تماما.سخني الأسيتون في طبق بيتري زجاجي إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية على لوحة ساخنة في غطاء الدخان. مشاهدة درجة الحرارة بعناية لتجنب الحريق. غمر الجرافين PMMA على الملح في طبق بيتري مليئة الأسيتون وتركها لحل PMMA لمدة 30 دقيقة.السماح للجرافين على الملح الهواء الجاف جيدا قبل استخدامه لإعداد العينة. غسل واحدة أعدت وتسمى رقاقة في الماء النقي لإزالة أي مخلفات الملح من العازلة ووضعها على ورقة التصفية. يجب أن تكون الخلايا مرئية كنقاط داكنة.استخدام شفرة حلاقة لقطع الجرافين متعدد الطبقات على الكريستال كلوريد الصوديوم إلى قطعة التي تناسب نافذة نيتريد السيليكون من رقاقة. إزالة الجرافين من الكريستال كلوريد الصوديوم عن طريق غمس في منقار من الماء، إمالة الكريستال في زاوية 45 درجة فيما يتعلق السطح. قبض على الجرافين مع حلقة معدنية من سطح الماء، ثم لمس السطح العلوي من رقاقة مع سطح الحلقة السفلى، مما تسبب في رقاقة التمسك حلقة معدنية.ويمكن رؤية الجرافين على رأس رقاقة. تحت مجسمة، استخدم ورقة التصفية لإزالة الماء المتبقي من الرقائق الدقيقة بحيث يغطي الجرافين جميع الخلايا على نافذة نيتريد السيليكون. ضع الرقاقة على ورق المرشح مع ملاقط.الجرافين مرئيا ً كوميض أرجواني على الرقاقة. نقل رقاقة من ورقة إلى حجرة طبق بيتري. ماصة قطرة من الماء في واحدة من المقصورات الحرة وإغلاق الغطاء لتوفير جو المياه المشبعة.ثم، ختم طبق المقصورة مع فيلم البارافين وتخزينها في الثلاجة في أربع درجات مئوية. تعيين STEM إلى 200 كيلوفولت طاقة شعاع باستخدام عينة محاذاة لحجم المسبار لا يقل عن 0.2 نانومتر عن طريق ضبط العدسات المكثف. تعيين تيار التحقيق من 180 Picoampere وشعاع التقارب شبه زاوية من 13.2 milliradians عن طريق إدراج فتحة.تعيين كاشف ADF STEM فتح نطاق شبه زاوية إلى 68 إلى 280 milliradians عن طريق ضبط إعدادات عدسة البروجيكتور. ثم، تعيين حجم الصورة STEM إلى 2048 من قبل 2048 بكسل والبكسل يسكن الوقت إلى ستة ميكروثانية. تحميل رقاقة مع الخلايا المغلفة الجرافين في حامل عينة القياسية للتيم في مثل هذه الطريقة التي تواجه الخلايا حتى وتحميل حامل في المجهر الإلكتروني.الحصول على صورة عامة في 800 X التكبير. ثم، تحديد منطقة ذات أهمية وصورة للجسيمات النانوية نقطة الكم في 80، 000 X مع حجم بكسل من 1.3 نانومتر. تظهر الخلايا المصنفة على النحو الأمثل هنا.يتم تغطية النافذة ، ولكن هناك مساحة كافية للسماح لهم بالارض والتمسك بها. عندما تم زرع الكثير من الخلايا على رقاقة ، لم يكن هناك مساحة كافية لجميع الخلايا للتمسك. بعد 24 ساعة، أكثر من نصف الخلايا لم تتسطح.إذا تم زرع عدد قليل جدا من الخلايا، فإن نافذة نيتريد السيليكون في نهاية المطاف مع مساحة فارغة كبيرة بعد 24 ساعة. تظهر هنا صور DIC و fluorescence للخلايا المصنفة على النحو الأمثل ، مما يدل على وضع العلامات الناجحة لـ HER2. تم تنفيذ STEM على خلايا SKBR3 المغلفة بالجرافين وغير المغلفة.تم تصوير insets في الصور التكبير 800 X في 80، 000 X.The الجسيمات النانوية نقطة الكم مرئية كما النقاط المضيئة في 50، 000 X التكبير. ومن أجل تحري تأثير إضاءة شعاع الإلكترون على العينة، تم الحصول على صور STEM في سلسلة صور بجرعة إلكترون متراكمة. تظهر هنا نتائج تمثيلية للعينات غير المغلفة والمغلفة بالجرافين.أدى التعرض للعينات غير المغلفة إلى ظهور هياكل ساطعة على أسطح الخلايا ، وهو ما لم يحدث مع أي من العينات المغلفة بالجرافين. بقي متوسط تغيير المسافة النسبية لأزواج الجسيمات أقل من 1.3٪ للعينات غير المغلفة وأقل من 0.8٪ للعينات المغلفة. بعد هذا الإجراء، يمكن تصوير أنواع مختلفة من البروتينات الغشاء على خلايا كاملة باستخدام أساليب المجهر الأخرى.هذه التقنية تجعل من الممكن لصورة البروتينات في غشاء البلازما سليمة للحصول على مزيد من المعلومات حول تنظيم غشاء البلازما والتفاعل بين البروتينات.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

مجهرية التعريب متعدد الألوان البروتينات الغشاء واحدة في العضيات الحية خلايا الثدييات

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...