Name: graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 12 s
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Wir danken D. B. Peckys für die Hilfe beim Zellkulturprotokoll, F. Weinberg für die Durchsicht des Manuskripts, T. Trampert für Hilfe bei den Experimenten und den Figuren, S. Smolka für die Hilfe bei den Figuren und E. Arzt für seine Unterstützung durch INM. Diese Forschung wird von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung gefördert.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Um die Proteinfunktion besser zu verstehen, ist es wichtig, Informationen über Proteinstandorte in der Plasmamembran intakter Zellen zu erhalten. Zu den Methoden zum Abrufen dieser Informationen gehören die Superauflösungsfluoreszenzmikroskopie1,2. Obwohl sich die superhochauflösende Mikroskopie in den letzten Jahren weiterentwickelt hat, ist ihre Auflösung für praktische Bedingungen von Zellexperimenten immer noch auf etwa 20 nm begrenzt, während typische Rezeptorproteine Größen im Bereich von 1-10 nm haben. Die Bildgebung von Proteinen auf Einzelzell- und Einzelmolekülebene mit ausreichender Auflösung zur Visualisierung von Proteinen ist mit EM möglich. Aber aufgrund der Schnitte lassen herkömmliche EM-Methoden die Zelle in der Regel nicht intakt26, was zum Verlust wichtiger Informationen über den Kontext und die räumliche Verteilung von Proteinen in der Plasmamembran führt. Methoden für ganze Zellen mit Kryo-TEM wurden entwickelt6, es ist machbar, Protein-Etikettierung mit Kryo-EM27zu kombinieren, auch Kryo-STEM wurde28nachgewiesen. Kryo-EM-Workflows sind jedoch für die Untersuchung der zellulären Ultrastruktur und Proteinstruktur optimiert, und nicht so sehr für die Analyse der räumlichen Verteilungen von Membranproteinen. Die Trockenpunkttrocknung ist eine weitere Methode der ganzzelligen Präparation, aber die Proben werden mehreren Trocknungsschritten unterzogen, und die Technik ist sehr zeitaufwändig29. Membranproteine wurden auch mittels Gefrierfraktur7untersucht. Bei dieser Methode werden Zellen fixiert, eingefroren und gebrochen. Die gebrochenen Teile werden durch Kohlenstoff- und Platinschichten repliziert und die biologische Probe entfernt. Die Repliken können dann mit EM30analysiert werden. Eine ganze Zellanalyse ist mit Gefrierfraktion nicht möglich, da Informationen über die Verteilung von Proteinen in der Membran im Kontext der gesamten Zelle verloren gehen.
Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es, die Zellmembran zu untersuchen, ohne die Probe9,,31verdünnen zu müssen. Die Zellen bleiben intakt, so dass die Lokalisation der Membranproteine aus den Fluoreszenzbildern sichtbar ist, die mit den EM-Bildern korreliert sind. Die Untersuchung von Proteinen auf Einzelzell- und Einzelmolekülebene innerhalb intakter Zellen im hydratisierten Zustand hat sich mit einer Auflösung von 2 nm mit einer Auflösung von 2 nm mit einer Auflösung von QD-markierten Proteinen mit dieser Graphengehäusemethode9als möglich erwiesen. Die Beibehaltung von Zellen in ihrem nativen Zustand ist von entscheidender Bedeutung, da sie die räumliche Verteilung von Membranproteinen so bewahrt, dass Analysen auf Einzelzell- und Einzelmolekülebene möglich sind, was für das Verständnis von Proteinfunktionen wichtig ist, und neue Medikamente für Therapieansätze zu entwickeln.
Ein weiterer kritischer Aspekt der Abbildung biologischer Proben mit EM ist die Strahlenschädigung der Proben, die durch den Elektronenstrahl verursacht wird. Lösungen umfassen oft die Reduzierung der Elektronendosis so weit wie möglich oder verschiedene Beschichtungsmethoden, wie z. B. das Verkapseln der Probe zwischen dünnen Schichten von Kohlenstoff32. Unsere Methode zeigt, dass die Graphenbeschichtung strahlinduzierte Artefakte reduziert, die auf der Zelloberfläche für unbeschichtete Proben entstehen. Die Untersuchung der chemisch fixierten und graphenbeschichteten biologischen Proben ist unter Elektronenstrahlbestrahlung bei 200 keV Strahlenergie bis D = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2 ohne Strahlungsschäden, wie helle Flecken, möglich, die in der Probe auftreten. Im Vergleich zu anderen EM-Methoden, die eine aufwendige Probenvorbereitung beinhalten, z. B. Färbung, Einbettung, (Kryo-)Schnitt, Frakturierung usw., ist die hier beschriebene Methode weniger zeitaufwändig. Die Etikettierung der Proteine erfolgt innerhalb weniger Stunden, und die Graphenbeschichtung erfordert für ausgebildete Forscher nur etwa 15 Minuten. Die Probenvorbereitung ist mit den Verfahren vergleichbar, die für die Fluoreszenzmikroskopie erforderlich sind.
Das Protokoll kann in einigen Schritten geändert werden. Das Graphen auf dem Mikrochip kann auch luftgetrocknet werden, um sicherzustellen, dass sich das Graphen nicht bewegt, wenn es mit einem Filterpapier gefleckt wird. Wenn das Graphen mit Salz verunreinigt ist, ist es möglich, es etwa eine Stunde auf der Wasseroberfläche schweben zu lassen, um das Salz aufzulösen und so die Kontamination zu minimieren. Auftretende Kupfer- oder PMMA-Kontamination enden auf dem Graphen kann durch Erweiterung der entsprechenden Ätzschritte im Protokoll reduziert werden. Andere Graphenbeschichtungsverfahren wurden beschrieben, bei denen beispielsweise Graphen-PMMA direkt auf Zellen abgelagert wurde und das PMMA durch Waschen in Aceton nach33entfernt wurde. Bei unserem Verfahren wurde PMMA vor der Beschichtung entfernt, um mögliche Schäden an den Zellen durch zusätzliche Acetonwaschschritte zu vermeiden. NaCl wurde hier als Substrat gewählt, weil es flach ist, so dass es das Graphen nicht faltet, und es löst sich in Wasser auf, um das Graphen9freizusetzen. Außerdem kann es in die gewünschte Größe geschnitten werden und es werden keine Substratrückstände auf dem Graphen zurückgelassen. Aber unter Berücksichtigung dieser Kriterien können möglicherweise auch andere Substrate wie Kaliumchlorid verwendet werden.
Um die Wahrscheinlichkeit einer möglichen etiketteninduzierten Clusterbildung zu verringern, kann der GA-Fixierungsschritt direkt nach der FA-Fixierung implementiert werden, nach der alle Membranproteine immobilisiert werden. Der erste Fixierungsschritt mit FA fixiert bereits die biologische Struktur, aber ein reduziertes Niveau der Membranproteindiffusion kann immer nochauftreten 34, möglicherweise was zu einer etiketteninduzierten Clusterbildung aufgrund des Vorhandenseins von multiplem Streptavidin pro QD führt. Die Fixierung mit GA kann zu einem Autofluoreszenzsignal während LM führen und erfolgt daher nach LM im beschriebenen Protokoll, kann aber wie an anderer Stelle beschrieben reduziert werden34. Cacodylate Puffer ist ziemlich giftig, und andere Fixative können auch verwendet werden, aber Cacodylat wird hier verwendet, da es ein häufig verwendeter Puffer für EM-Protokolle ist, vermeidet Ausscheidungen, verhindert das Wachstum von Bakterien und Pilzen, und ist kompatibel mit Calciumionen, die benötigt werden, um die ultrastrukturelle Integrität der Lipidmembranen zu erhalten35. Bei Bedarf kann Osmiumtetroxid als zusätzliche Fixierung zur Stabilisierung der Lipide verwendet werden. Dies würde dazu beitragen, den Kontrast der Zellstruktur zu verbessern, aber auch ein weiteres Metall in das System einzubauen und den Kontrast auf den QDs zu reduzieren.
Das hier beschriebene Protokoll enthält viele Schritte, die eine gute Anweisung erfordern. Vor dem Umgang mit Mikrochips ist ein gewisses Training erforderlich, um zu vermeiden, dass die SiN-Oberfläche der Mikrochips zerkratzt wird und um Bruch zu vermeiden. Wie bereits erwähnt, wird empfohlen, Mikrochips in Duplikaten vorzubereiten, da das SiN-Fenster von Zeit zu Zeit brechen kann. Die erforderliche Anzahl von Zellen auf einem Mikrochip zu erhalten erfordert auch einige Erfahrung. Die Beschichtung der Zellen mit Graphen erfordert einiges Training, da es schwierig sein kann, den richtigen Neigungswinkel zu finden, um Graphen auf Demwasser zu schweben. Wenn man das Graphen aus dem Wasser fängt, kann es auch schwierig sein, das dünne Graphen zu sehen. Sobald sich das Graphen auf dem Mikrochip befindet, muss überschüssiges Wasser mit einem Filterpapier abgefleckt werden. Dies sollte nur mit der Spitze eines Filterpapiers erfolgen, um zu vermeiden, dass das Graphen aus dem Mikrochip entfernt wird.
Die Graphenbeschichtung verhinderte, dass Artefakte auf der Probe auftauchten. Aber auch für D < 4 x 102 e-/2 tauchten keine Artefakte für die nicht beschichtete Probe auf, und Artefakte erschienen nur für 2 unbeschichtete Proben. Daher scheinen auch Untersuchungen von nicht beschichteten Zellen möglich, obwohl es besser wäre, Graphen zu verwenden und das Risiko der Artefaktbildung zu vermeiden. Die Zusammensetzung dieser Artefakte kann in der Zukunft analysiert werden, um Hinweise darauf zu geben, wie ihre Bildung zu verhindern ist. Hinsichtlich der strukturellen Stabilität der Zellen wurde nur eine geringfügige Verbesserung der Graphenbeschichtung beobachtet. Die festen Zellen wurden offenbar in den untersuchten dünnen Bereichen stabilisiert, wo sich ihre Struktur in unmittelbarer Nähe der SiN-Membran befand. Was wir hier jedoch nicht untersucht haben, waren Trocknungsartefakte, von denen bekannt ist, dass sie für Zellproben auftreten, wenn sie Vakuum ausgesetzt sind4. Die Trocknung der Zellen würde zu einer Schrumpfung der Zellen führen, so dass sich dadurch auch die QD-Abstände ändern würden. Bei der hier verwendeten Elektronendosis blieb der Abstand der QDs graphenbeschichteter und unbeschichteter Proben stabil. Weitere Studien sind erforderlich, um die Wirkung der Graphenbeschichtung auf die Zellen für EM zu untersuchen.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass die chemische Fixierung der Zellen notwendig ist; Daher können keine Live-Zell-Experimente durchgeführt werden. Sollte die Kennzeichnung jedoch nicht benötigt und Zellen mit höherer Strukturstabilität verwendet werden, z.B. Bakterien, können unfixierte Zellen für EM36 in Graphen eingeschlossen werden, wenn auch mit einer anderen Elektronendosistoleranz. Außerdem sind die Proteine nicht direkt nachweisbar, so dass QDs benötigt werden, um die Proteine zu visualisieren. Die Methode würde von kleineren Etiketten profitieren. Ein Diskussionspunkt ist, ob es gut oder schlecht ist, dass die Ultrastruktur nicht deutlich sichtbar ist. Unsere Methode ähnelt der der Fluoreszenzmikroskopie, bei der nur ausgewählte Proteine sichtbar sind37. Eine Erhöhung der Sichtbarkeit der Ultrastruktur würde dem Bild auch viel mehr Informationen hinzufügen und dann irgendwann die Erkennung der einzelnen Beschriftungspositionen verhindern. Darüber hinaus ist die hier beschriebene Methode für eine Proteinart, und Ergänzungen des Protokolls sind erforderlich, um mehrere Proteine kennzeichnen zu können. Schließlich funktioniert die Methode, wenn ein kleines hochwertiges, spezifisch bindendes Molekül wie Antikörper-Mimetik21 oder Nanokörper38 zur Verfügung steht. Häufig verwendete Antikörper sind viel größer und würden den Nachweis des Funktionszustandes der Proteinuntereinheiten in Oligomere verhindern.
Unsere Methode ist nützlich für die Untersuchung der Proteinfunktion an ganzen Zellen mit EM, während die Zellen in hydratisiertem Zustand gehalten werden. Es ist leicht möglich, eine Reihe von Zellen zu untersuchen. Andere Arten von Zellen und Proteinen können ebenfalls untersucht werden. Wenn keine Proteinkennzeichnung erforderlich ist, kann eine Teilmenge des Protokolls für die Graphenbeschichtung einer Vielzahl biologischer Proben verwendet werden. Die Fähigkeit, ganze Zellen zu untersuchen, ist in der zellulären Forschung relevant, um Korrelationen der Membranproteinfunktion auf molekularer Ebene zu verstehen.

Die Analyse der Membranproteinfunktion ist für die zellbiologische Forschung und für die Arzneimittelentwicklung unerlässlich. Eine Klasse wichtiger Experimente beinhaltet die Untersuchung von Membranproteinpositionen in Zellen. Diese Informationen können verwendet werden, um Rückschlüsse auf die Zusammenstellung von Proteinen in Proteinkomplexen und deren spezifische Positionen in der Plasmamembran abzuleiten, die durch dynamische Montage und Demontage eine Vielzahl von zellulären Funktionen antreibt. Unter anderem werden Lichtmikroskopie (LM) und Elektronenmikroskopie (EM) zur Untersuchung von Proteinfunktionen in Zellen eingesetzt. LM ermöglicht die Analyse ganzer Zellen in Flüssigkeit; Die Auflösung ist jedoch auf 200-300 nm für konventionelle und bis zu 20 nm für die Superauflösung fluoreszenzmikroskopie unter praktischen Bedingungen1,2beschränkt. EM bietet ca. 1 Auflösung3, aber herkömmliche Probenvorbereitung erfordert Dehydrierung, Metallfärbung, um den Bildkontrast zu verbessern, und einbetten in eine Montagesubstanz, wie Harz, für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)4. Um biologische Proben in einer nativeren Umgebung zu erhalten, können Kryo-EM-Techniken verwendet werden5,6. Die Proben werden schnell in amorphes Eis eingefroren und bei Bedarf geschnitten. Eine weitere Option ist das Einfrieren von EM7.
EM-Techniken zur Untersuchung von Membranproteinen in intakten Zellen in ihrem nativen, flüssigen Zustand sind in den letzten zehn Jahren entstanden8,9,10,11. Eine räumliche Auflösung von 2 nm wurde auf Quantenpunkt (QD) markierten Membranproteinen in ganzen Zellen erreicht, die auf einer SiN-Membran angebaut und von einer Schicht Aus Graphen9umschlossen sind.
Hier werden Details eines Protokolls zur Proteinkennzeichnung und Graphenbeschichtung9,12 beschrieben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die räumliche Verteilung von HER2 in der Membran ganzer, fester Zellen zu analysieren und gleichzeitig die Zellen in einem hydratisierten Zustand zu erhalten. Die Beschichtung mit Graphen verhindert das Trocknen der Zellen im Vakuum und reduziert auch Strahlenschäden13. Diese Methode liefert Informationen über markierte Membranproteine innerhalb der intakten Plasmamembran, aber die Methode ist nicht nützlich für die Untersuchung der zellulären Ultrastruktur, wie es normalerweise mit EM geschieht.
Graphen ist das dünnste bekannte Nanomaterial und besteht aus einem einzigen Kohlenstoffatom dicken kristallinen Blatt in einem Wabengitterangeordnet 14. Es hat einzigartige Eigenschaften, einschließlich hoher Flexibilität und mechanischer Festigkeit. Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass defektfreies Graphen für Gase und Flüssigkeiten undurchlässig ist, aber Defekte erlauben Wasserstoffpermeation15. Diese Leckage kann durch die Verwendung von mehrschichtigem Graphen, wie hier verwendet, reduziert werden. Bilayer-Graphen hat sich vor kurzem als nützliche Unterstützung für Kryo-EM-Proben erwiesen, die die Homogenität der dünnen Eisschicht im Vergleich zu Graphenoxid verbessern, wo nur ungleichmäßige Schichten gebildet werden können16. Graphen wurde auch gezeigt, um Strahlschäden von biologischen Proben während der Flüssigphasen-Transmissionselektronenmikroskopie13,17zu reduzieren. Als beispielhaftes Experiment wurde HER2, ausgedrückt in der Säugetier-Brustkrebszelllinie SKBR3, mit QDs18 gekennzeichnet und seine räumliche Verteilung mit MINT aufgezeichnet. Die Zellen wurden auf einem Si-Mikrochip mit einer elektronentransparenten SiN-Membran19ausgesät. Die Mikrochips wurden als Stütze gewählt, da sie robust, kompatibel mit LM und EM sind und das gesamte Etikettierungsverfahren direkt auf dem Mikrochip19durchgeführt werden kann. Nach der Zellanhaftung wurde HER2 mit einem zweistufigen Beschriftungsprotokoll20beschriftet. Zunächst wurde an HER2 eine biotinylierte Anti-HER2-Antikörper-Mimetikverbindung21 befestigt. Die Zellen wurden dann chemisch fixiert, um eine etiketteninduzierte Rezeptorclusterbildung zu verhindern und die Stabilität der zellulären Ultrastruktur zu erhöhen. Streptavidin-beschichtete QDs wurden anschließend mit dem HER2-Antikörper-Mimetikkomplex verknüpft. Das helle Fluoreszenzsignal und der elektronendichte Kern der QDs ermöglichten korrelative Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie (CLEM)20. CLEM ist besonders nützlich, da zelluläre Regionen, die für die MINT-Analyse von Interesse sind, aus den Übersichtsfluoreszenzmikroskopiebildern ausgewählt werden können, die die Lokalisierung von HER2 auf den Zellen hervorheben. Die Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert, um zelluläre Regionen mit hohem HER2-Gehalt zu identifizieren. Danach wurde ein 3-5-schichtiges dickes Graphenblatt zur Beschichtung9,22auf die Zellen übertragen. Anschließend wurde die Probe in einem EM-Probenhalter montiert. DIE MINT-Daten wurden mit hilfe des ringförmigen Dunkelfelddetektors (ADF) erfasst, der Informationen über die räumliche Verteilung von HER2 auf der Zelloberfläche relativ zur Zelloberflächenposition liefert, aber keine Informationen über die Ultrastruktur der Zelle liefert. Um die Stabilität der Probe unter Elektronenstrahlbestrahlung zu bestimmen, wurden die Proben in zunehmender Dosis (D) in einer Bildreihe untersucht. Der Unterschied zwischen graphenbeschichteten und nicht beschichteten Proben wurde untersucht. Es wurden mehrere Arten von Strahlungsschäden bewertet.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet die HER2-überexzessierende Säugetier-Brustkrebszelllinie SKBR3 als Modellsystem für die Ausrichtung auf HER223. Das Protokoll umfasst die Herstellung einer graphenbeschichteten Probe und einer ähnlichen Probe, jedoch ohne Graphenbeschichtung zum Vergleich. Das Experiment wird in doppelter Ausführung vorbereitet, da das SiN-Fenster einmal ig zubrechen und in den meisten Fällen ein experimentelles Duplikat zu erhalten. Die Gesamtausbeute der Methode ist hoch, was bedeutet, dass Mikrochips mit graphenbedeckten Zellen in der Regel mit einem außergewöhnlichen Fehler erhalten werden, auch wenn nicht das gesamte SiN-Fenster in allen Fällen mit Graphen bedeckt sein kann. Duplikate werden im Protokoll nicht beschrieben.
Das Etikettierungsprotokoll (Schritte 1-5) ist vergleichbar mit dem Protokoll der Kennzeichnung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors in COS7-Fibroblastenzellen, die zuvor24veröffentlicht wurden; In diesem Papier wird auf die Handhabung der Mikrochips und die Verwendung der Brunnenplatten verwiesen. Das folgende Protokoll ist für die Kennzeichnung von HER2, Graphenbeschichtung9und die Untersuchung der Strahlungstoleranz der Probe optimiert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone for HPLC (min. 99.8 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2626-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL54 analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany</td>
			<td>30029077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free, &#8805; 98 %, for molecular biology</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 &#181;M</td>
			<td>Affibody, Solna, Sweden</td>
			<td>10.0817.02.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F</td>
			<td>JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylic acid sodium salt trihydrate &#8805; 98 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5169.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>627861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>5401000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 ml sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>9286.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>PK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>4430000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2222-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>F8141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Leica DMI6000</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>10099141</td>
			<td>lot number: 1751893</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Goat Serum, New Zealand origin</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>lot number: 1788320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy 48R CO2 Incubator</td>
			<td>New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>CO48310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan Model 950 Solarus&#151; Plasma Cleaner</td>
			<td>Gatan GmbH, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine &#8805; 98.5 % Ph.Eur., USP, BP</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Heidolph Instruments GmbH &#38; CO. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>MR 3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0557-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSc-Advantage&#151; Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocean Microchips SiN window 400x150 &#181;m, 200 nm spacer</td>
			<td>DENSsolutions, Delft, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>10 mL: C542.1 20 ml: T550.1</td>
			<td>purchased via Carl Roth GmbH&#38;Co. KG, Karlsruhe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>VO 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td>#291-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfekt-Kescher with handle</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2-200&#181;l: 7695892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>0.1-10 &#181;l: 7695880 2-100 &#181;l: 7695883 100-1000 &#181;l: 7695886 1250 &#181;l XL: 7695887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 &#181;M</td>
			<td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased</td>
			<td>Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA</td>
			<td>94-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell, Dassel, Germany</td>
			<td>300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo Microscope Leica M60</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath SW22</td>
			<td>Julabo GmbH, Seelbach, Germany</td>
			<td>9550322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>HN00.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm</td>
			<td>International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA</td>
			<td>9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, &#8805; 99.5 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium persulfate</td>
			<td>carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>4365.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 &#181;m</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P668.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm</td>
			<td>ACS material, Pasadena, CA, USA</td>
			<td>TTG30011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Dumoxel 03</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0103-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Inox 02</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0102-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, plastic replaceable tip</td>
			<td>Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland</td>
			<td>5SVR.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water ROTISOLV HPLC gradient grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>A511.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy

Ein Protokoll wird beschrieben, um den humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2) in der intakten Plasmamembran von Brustkrebszellen mittels Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) zu untersuchen. Zellen der Säugetier-Brustkrebs-Zelllinie SKBR3 wurden auf Silizium-Mikrochips mit Siliziumnitrid (SiN)-Fenstern angebaut. Die Zellen wurden chemisch fixiert und HER2-Proteine mit Quantenpunkt-Nanopartikeln (QDs) mit einem zweistufigen Biotin-Streptavidin-Bindungsprotokoll gekennzeichnet. Die Zellen wurden mit mehrschichtigem Graphen beschichtet, um einen hydratisierten Zustand zu erhalten und sie während des MINT-Baus vor Elektronenstrahlschäden zu schützen. Um die Stabilität der Proben unter Elektronenstrahlbestrahlung zu untersuchen, wurde ein Dosisserienexperiment durchgeführt. Graphenbeschichtete und unbeschichtete Proben wurden verglichen. Strahlinduzierte Schäden in Form von hellen Artefakten erschienen für einige nicht beschichtete Proben mit erhöhter Elektronendosis D, während keine Artefakte auf beschichteten Proben erschienen.

Abbildung 1A zeigt Zellen, die so ausgesät sind, dass das Fenster bedeckt ist, aber mit genügend Platz, um sie abzuflachen und zu haften, was zu einer Konfluenz von etwa 2/3rd führt (Abbildung 1B). Falls zu viele Zellen auf einem Mikrochip gesät werden (Abbildung 1C), gibt es nicht genügend Platz für alle Zellen, um am Mikrochip haften zu können. Abbildung 1D zeigt den gleichen Mikrochip nach 24 h. Mehr als die Hälfte der Zellen hat sich nicht abgeflacht. Wenn dagegen zu wenige Zellen gesät sind (Abbildung 1E), erhält das SiN-Fenster nach 24 h einen großen leeren Raum, wie in Abbildung 1Fzu sehen ist. Abbildung 1G zeigt das DIC-Bild der Zellen in Abbildung 1A und Abbildung 1B. Abbildung 1H zeigt das entsprechende Fluoreszenzbild falsch gelb gefärbt, was auf eine erfolgreiche Kennzeichnung von HER2 hinweist.
Repräsentative MINT-Daten sind in Abbildung 4dargestellt. Untersucht wurden graphenbeschichtete (linke Spalte) und nicht beschichtete (rechte Spalte) SKBR3-Zellen. Abbildung 4A,B zeigen M = 800x Übersichtsbilder der Zellen im Fenster. Die als Eingaben dargestellten Bereiche wurden während der Dosisreihe mit M = 80.000x abgebildet, siehe Abbildung 4C,D. Die QDs sind hier als helle Flecken sichtbar. Abbildung 4E und Abbildung 4F zeigen M = 50.000x vergrößerte Bilder, die an den Stellen der Rechtecke in Abbildung 4C, D aufgenommenwurden. Beide Bilder wurden nach dem Erwerb einer Dosisreihe mit D = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. Die Dosisreihe wurde bei M = 80.000x aufgezeichnet. Die freiliegenden Bereiche können als Rechtecke erkannt werden, wobei das Rechteck für die nicht beschichtete Probe deutlich sichtbar war (Abbildung 4F).
Um das Vorhandensein von Graphen zu überprüfen, wurden Beugungsmuster von Bereichen ohne Zellen, aber mit oder ohne Graphen im SiN-Fenster erfasst. Die sechseckige Struktur des Graphens wurde im Beugungsmuster der graphenbeschichteten Probe beobachtet (Abbildung 4G), während es für die nicht beschichtete Probe fehlte (Abbildung 4H). Das Beugungsmuster von Einkristallgraphen hat aufgrund der hochgeordneten sechseckigen Struktur von Graphen eine sechsfache Symmetrie. Die sechseckige Struktur zeigt also das Vorhandensein von Graphen auf den Proben an.
Um die Wirkung der Elektronenstrahlbeleuchtung auf die Probe zu untersuchen, wurden in einer Bildserie mit einer akkumulierenden Elektronendosis STEM-Bilder aufgenommen. Repräsentative Ergebnisse für nicht beschichtete und graphenbeschichtete Proben sind in Abbildung 5A-D bzw. Abbildung 5E-Gdargestellt. Alle Daten wurden am Rand der Zelle erfasst, wo die Zelle die flachste ist und die beobachtete Struktur somit der SiN-Membran am nächsten ist. Die Exposition einer nicht beschichteten Probe führte dazu, dass helle Strukturen auf den Zelloberflächen bei D = (1,9 x 0,1) x 103 e-/a2 (Abbildung 5B) auftraten. Diese Strukturen wurden mit höheren Dosen größer, so dass sie im letzten Bild der Serie bei D = (7,8 x 0,4) x 103 e-/a2 (Abbildung 5C,D) deutlich sichtbar waren. Diese Flecken tauchten auf keiner der graphenbeschichteten Proben auf (Abbildung 5E-G).
Weitere Mikrochips wurden mit dem oben beschriebenen Protokoll hergestellt und untersucht. Insgesamt wurden sechs beschichtete und sieben nicht beschichtete Proben untersucht. Zwei von sieben nicht beschichteten Proben zeigten diese Artefakte. Keine der beschichteten Proben zeigte zusätzliche helle Flecken.
Als weiteres Maß für die Strahlungsschäden wurde der Abstand zwischen QDs untersucht. Sollten strukturelle Schäden auftreten, würde man erwarten, dass sich die Entfernungen zwischen den QDs ändern. Änderungen der Entfernungen wurden für verschiedene QD-Paare mit akkumulierendem D für einen Bereich von Paarabständen gemessen. Abbildung 5H zeigt, dass die relative Veränderung der Partikel für nicht beschichtete Proben im Durchschnitt unter 1,3 % blieb, während der durchschnittliche relative Abstand bei den beschichteten Proben unter 0,8 % blieb. Man kann daher schlussfolgern, dass die Graphenbeschichtung die Probe stabilisiert hat, aber auch die eingetrockneten Proben ohne Graphenbeschichtung bemerkenswert stabil waren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> Abbildung 1: Zellsaat auf einem SiN-Fenster eines Silizium-Mikrochips und HER2 beschriftet. (A) Beispielhaftes Bild eines SiN-Fensterbereichs mit SKBR3-Zellen 5 min nach dem Aussaat auf dem Mikrochip. (B) Dieselben Zellen breiten sich nach 24 h. (C) SKBR3-Zellen auf einem Si-Mikrochip 5 min nach der Aussaat auf demselben SiN-Fenster aus. (D) Gleiche Zellen wie in (C) nach 24 h. Die Zellen haben sich nicht richtig abgeflacht, da es zu viele Zellen auf den Chips bei der Aussaat gab. (E) Zellen auf einem Mikrochip 5 min nach der Aussaat. (F) Nur wenige Zellen waren auf dem Fenster sichtbar, weil zu wenige Zellen auf dem Mikrochip gesät wurden. (G) DIC-Bild der gleichen SKBR3-Zellen nach QD-Beschriftung von HER2. (H) Overlay-Bild von DIC und entsprechendefluoreszenzbild von markierten SKBR3-Zellen mit HER2-QD655 (falsch gelb gefärbt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> Abbildung 2: Reinigung und Übertragung von Graphen auf NaCl-Kristallen. (A) PMMA-Graphen-auf-Polymer wird in reines Wasser getaucht, um PMMA-Graphen freizusetzen. PMMA-Graphen kann mit einer Glasrutsche gefangen werden. (B) Kupferbasierte Kontaminationen wurden mit Natriumpersulfatlösung geätzt. Um das Graphen zu reinigen, wurde es in einen Becher mit entionisiertem Wasser übertragen. Diese Schritte wurden dreimal wiederholt. Das PMMA-Graphen wurde dann in gesättigte NaCl-Lösung in reinem Wasser übertragen. Ein NaCl-Kristall wurde verwendet, um das Graphen aus der Salzlösung zu holen. (C) Das PMMA-Graphen auf NaCl-Kristall wurde 30 min bei Raumtemperatur ausgetrocknet. PMMA wurde entfernt, indem der Block 30 min in Aceton inkubiert wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Graphenbeschichtung von Zellen, die auf einem Si-Mikrochip gesät sind. (A) Verfahren der Graphenbeschichtung. Graphen auf NaCl-Kristall wird auf die Wasseroberfläche freigesetzt. Das Graphenstück wird dann mit einer Metallschleife gefangen und auf den Si-Mikrochip übertragen. (B) Mikrochip (2,0 x 2,6 mm) mit einem SiN-Fenster mit den Abmessungen 400 x 160 m ohne Graphen. SKBR3-Zellen waren als dunkle Flecken sichtbar. (C) Graphen (roter Kreis), der auf der Oberfläche eines mit Wasser gefüllten Bechers schwebt. (D) Graphen mit einer Metallschlaufe gefangen. (E) Der Mikrochip, der am Wassertröpfchen befestigt ist, so dass sich das Graphen auf dem SiN-Fenster befand. (F) Mikrochip nach Graphenbeschichtung. Das Graphen war als violetter Schimmer sichtbar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> Abbildung 4: MINT von graphenbeschichteten und unbeschichteten SKBR3-Zellen am SiN-Fenster. (A) MINT-Bild einer graphenbeschichteten Probe, die bei einem M = 800x. (B) MINT-Bild einer nicht beschichteten Probe aufgenommen wurde, die bei M = 800x aufgenommen wurde. (C) M = 80.000x Bild, das an der Position des blauen Rechtecks in A aufgenommen wurde. Gelbe Linien stellen Beispiele für Entfernungen dar, die innerhalb des Partikels gemessen wurden. (D) M = 80.000x Bild, das an der Position des blauen Rechtecks in B aufgezeichnet wurde. Gelbe Linie stellt Beispiele entfernungen innerhalb von Partikeln gemessen. (E) M = 50.000x Bild der gleichen Region wie C, das D ausgesetzt ist = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. (F) M = 50.000x Bild der gleichen Region wie D und d = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. Die exponierte Fläche war deutlich zu sehen. (G) Beugungsmuster einer graphenbeschichteten Probe aus einem Bereich ohne Zellen. Die sechsfache Symmetrie des Graphens ist als helle Flecken sichtbar. (H) Beugungsmuster einer Probe ohne Graphen ohne 6-fachhelle Flecken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> Abbildung 5: Artefakte, die auf Proben ohne Graphenbeschichtung entstehen. (A) Erste Bilder von Regionen auf Proben ohne Graphenbeschichtung, die bei M = 80.000x aufgenommen und D = (0,39 x 0,02) x 102 e-/2- ausgesetzt sind. (B) Bilder mit den ersten Artefakten, die bei D = (1,94 x 0,1) x 103 e-/2 (gelbe Pfeile) entstehen. (C, D) Letztes Bild der Serie, aufgenommen mit D = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. Artefakte waren als helle Flecken sichtbar. (E-G) Graphen beschichtete Proben ohne entstehende Artefakte. (E) D = (0,39 x 0,02) x 102 e-/2 (F) D = (1,94 x 0,1) x 103 e-/2 (G) D = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. (H) Relative Veränderung der Partikelabstände für graphenbeschichtete und nicht beschichtete Proben. Zwei der nicht beschichteten Proben, die Artefakte zeigen, von denen eine in (A-C) und das letzte Bild der zweiten Probe in D gezeigt wurde, sowie drei beschichtete Proben wurden analysiert (eine ist in E-G dargestellt). Insgesamt wurden pro Probe zehn QD-Paare mit Abständen zwischen 250 nm und 3 m untersucht. Die relative Änderung spiegelt den Durchschnitt aller Messungen in einer Gruppe wider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Rezepte für Lösungen und Puffer. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

Hier wird ein Protokoll zur Kennzeichnung von Membranproteinen in Säugetierzellen und zur Beschichtung der Probe mit Graphen für die Flüssigphasen-Scan-Transmissionselektronenmikroskopie vorgestellt. Die Stabilität der Proben gegen die durch Strahlung verursachten Schäden kann auch mit diesem Protokoll untersucht werden.

Graphengehäuse chemisch fixierter Säugetierzellen für die Flüssigphasenelektronenmikroskopie

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Diese Methode hält biologische Proben in einer nativen Umgebung und reduziert Elektronenstrahl-induzierte Artefakte. Der Hauptvorteil ist, dass diese Technik auf ganze Zellen anwendbar ist. So müssen Zellen vor der Elektronenmikroskopie nicht dehydriert, gebeizt oder geschnitten werden.Die Fähigkeit, Rezeptoren auf Krebszellen im Kontext der gesamten intakten Plasmamembran abzubilden, ist ein wichtiger Aspekt, der zu neuen Therapieansätzen und der Entwicklung neuer Krebsmedikamente führen kann. Ich werde die Arbeit mit Zellen, Graphenbeschichtung und Mikroskopie zeigen, und Sercan Keskin wird zeigen, wie man das Graphen zubereitet. Zunächst fügen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in zwei Brunnen einer 96-Well-Platte mit PLL- und FLP-beschichteten Mikrochips mit nach oben gerichteter Siliziumnitridmembran und 50 Mikroliter serumfreiem Medium hinzu.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Minuten, damit Zellen sich an den Mikrochip anheften können. Überprüfen Sie die Dichte der Zellen auf dem Mikrochip mit einem invertierten Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Zellen das Fenster mit genügend Platz zum Abflachen und Haften bedecken. Um HER2 in den Zellen zu beschriften, legen Sie die Mikrochips in die Brunnen der ersten Reihe der Etikettierplatte.Dann waschen Sie die Mikrochips mit PBS BSA. Um eine unspezifische Bindung des Antikörpers mimetisch zu verhindern, inkubieren Sie die Mikrochips mit PBS BSA GS für fünf Minuten. Dann mit 200 nanomolaren Antikörper mimetisch für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Um das PMMA-Graphen aus dem Polymer zu entfernen, pipette ein paar Tröpfchen Wasser auf dem Polymer um das PMMA-Graphen. Tauchen Sie es dann in Wasser mit einem Winkel von 30 bis 45 Grad ein, um das PMMA-Graphen freizusetzen. Um kupferbasierte Verunreinigungen zu ätzen, eine 50-Milliliter-Lösung von 0,42 Mol-Natriumpersulfat in Wasser zu reparieren.Verwenden Sie einen Standard-Glasschlitten, um PMMA-Graphen mit der Graphenseite nach unten in die Natriumpersulfatlösung zu übertragen. Das PMMA-Graphen schwebt an die Spitze der Lösung. Lassen Sie es dort über Nacht.Am nächsten Tag das PMMA-Graphen aus der Natriumpersulfatlösung in sauberes Wasser übertragen. Lassen Sie es für eine halbe Stunde im Wasser schweben. Wiederholen Sie die Wäsche insgesamt dreimal, um alle Natriumpersulfatrückstände aus dem PMMA-Graphen zu entfernen.Übertragen Sie dann das PMMA-Graphen auf einen Natriumchloridkristall. Bereiten Sie eine gesättigte Lösung von Natriumchlorid in Wasser in einer Petrischale vor und übertragen Sie das PMMA-Graphen auf die Lösung mit der Graphenseite nach unten. Halten Sie den Natriumchloridkristall mit einer Pinzette und nehmen Sie das schwimmende PMMA-Graphen auf.Halten Sie es dann zwei Minuten lang vertikal, um überschüssiges Wasser herausfließen zu lassen. Lassen Sie es auf Raumtemperatur für 30 Minuten trocknen und backen Sie es im Ofen bei 100 Grad Celsius für 20 Minuten. Entfernen Sie das Wasser vollständig.Aceton in einer glasigen Petrischale auf ca. 50 Grad Celsius auf einer Kochplatte in der Dunstabzugshaube vorheizen. Achten Sie sorgfältig auf die Temperatur, um Feuer zu vermeiden. Das PMMA-Graphen auf Salz in die mit Aceton gefüllte Petrischale eintauchen und 30 Minuten lang das PMMA auflösen lassen.Lassen Sie das Graphen auf Salz lufttrocknen, bevor Sie es zur Probenvorbereitung verwenden. Waschen Sie einen vorbereiteten und beschrifteten Mikrochip in reinem Wasser, um Salzrückstände aus dem Puffer zu entfernen und auf Filterpapier zu legen. Die Zellen sollten als dunkle Flecken sichtbar sein.Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das mehrschichtige Graphen auf dem Natriumchloridkristall in ein Stück zu schneiden, das in das Siliziumnitridfenster eines Mikrochips passt. Entfernen Sie das Graphen aus dem Natriumchloridkristall, indem Sie es in ein Becherglas mit Wasser tauchen und den Kristall in einem 45-Grad-Winkel in Bezug auf die Oberfläche kippen. Fangen Sie das Graphen mit einer Metallschleife von der Oberfläche des Wassers, dann berühren Sie die obere Oberfläche des Mikrochips mit der unteren Schleifenoberfläche, wodurch der Mikrochip an der Metallschleife klebt.Das Graphen ist auf dem Mikrochip zu sehen. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop Filterpapier, um das restliche Wasser aus dem Mikrochip zu entfernen, sodass das Graphen alle Zellen im Siliziumnitridfenster abdeckt. Legen Sie den Mikrochip mit einer Pinzette auf ein Filterpapier.Das Graphen ist als violetter Schimmer auf dem Mikrochip sichtbar. Übertragen Sie den Mikrochip vom Papier in ein Fach Petrischale. Pipette ein Tröpfchen Wasser in einem der freien Fächer und schließen Sie den Deckel, um eine wassergesättigte Atmosphäre zu bieten.Versiegeln Sie dann die Fachschale mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius im Kühlschrank. Stellen Sie den STEM auf 200 Kilovolt Strahlenergie ein, indem Sie eine Ausrichtungsprobe für eine Sondengröße von mindestens 0,2 Nanometern verwenden, indem Sie die Kondensatorlinsen einstellen. Stellen Sie einen Sondenstrom von 180 Picoampere und einen Strahlkonvergenzhalbwinkel von 13,2 Milliradians ein, indem Sie eine Blende einfügen.Stellen Sie den Halbwinkelbereich des ADF-MINT-Detektors auf 68 bis 280 Milliradians ein, indem Sie die Einstellungen der Projektorlinse anpassen. Legen Sie dann die MINT-Bildgröße auf 2048 um 2048 Pixel und die Pixelverweilzeit auf sechs Mikrosekunden fest. Laden Sie den Mikrochip mit graphenbeschichteten Zellen in einen Standard-Probenhalter für Tem so, dass die Zellen nach oben gerichtet sind und den Halter in das Elektronenmikroskop laden.Verschaffen Sie sich ein Übersichtsbild bei 800 X Vergrößerung. Identifizieren Sie dann einen Bereich von Interesse und Bild der Quantenpunkt-Nanopartikel bei 80.000 X mit einer Pixelgröße von 1,3 Nanometern. Optimal gesäte Zellen werden hier gezeigt.Das Fenster ist bedeckt, aber es gibt genügend Platz, damit sie sich abflachen und haften können. Wenn zu viele Zellen auf einem Mikrochip gesät wurden, war nicht genügend Platz für alle Zellen, um sich zu haften. Nach 24 Stunden flachte mehr als die Hälfte der Zellen nicht ab.Wenn zu wenige Zellen gesät werden, erhält das Siliziumnitridfenster nach 24 Stunden einen großen leeren Raum. Hier werden DIC- und Fluoreszenzbilder von optimal gesäten Zellen gezeigt, die eine erfolgreiche Kennzeichnung von HER2 belegen. STEM wurde an graphenbeschichteten und unbeschichteten SKBR3-Zellen durchgeführt.Die Eingaben in den 800 X Vergrößerungsbildern wurden bei 80.000 X abgebildet. Die Quantenpunkt-Nanopartikel sind als helle Flecken bei 50.000 X Vergrößerung sichtbar. Um die Wirkung der Elektronenstrahlbeleuchtung auf die Probe zu untersuchen, wurden in einer Bildserie mit einer akkumulierenden Elektronendosis STEM-Bilder aufgenommen. Repräsentative Ergebnisse für nicht beschichtete und graphenbeschichtete Proben werden hier gezeigt.Die Exposition von nicht beschichteten Proben führte zu hellen Strukturen auf den Zelloberflächen, die bei keiner der graphenbeschichteten Proben auftraten. Die durchschnittliche relative Entfernungsänderung der Partikelpaare blieb bei nicht beschichteten Proben unter 1,3 % und bei den beschichteten Proben unter 0,8 %. Nach diesem Verfahren können verschiedene Arten von Membranproteinen auf ganzen Zellen mit anderen Mikroskopiemethoden abgebildet werden.Diese Technik ermöglicht es, Proteine in der intakten Plasmamembran abzubilden, um mehr Informationen über die Organisation der Plasmamembran und die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu erhalten.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Die CryoAPEX-Methode zur Elektronenmikroskopie-Analyse der Membranproteinlokalisierung in ultrastrukturell konservierten Zellen

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...