Name: graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 12 s
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Agradecemos a D. B. Peckys por ajuda com o protocolo de cultura celular, F. Weinberg por revisar o manuscrito, T. Trampert por ajuda com os experimentos e os números, S. Smolka por ajuda com os números, e E. Arzt por seu apoio através do INM. Esta pesquisa é financiada por Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

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Os autores não têm nada a revelar.

Para entender melhor a função proteica, é importante obter informações sobre locais proteicos na membrana plasmática de células intactas. Os métodos para obtenção dessas informações incluem microscopia de fluorescência de super resolução1,2. Embora a microscopia de super resolução tenha se desenvolvido ainda mais nos últimos anos, sua resolução ainda está limitada a cerca de 20 nm para condições práticas de experimentos celulares, enquanto proteínas receptoras típicas têm tamanhos na faixa de 1-10 nm. A imagem de proteínas em nível de célula única e molécula única com resolução suficiente para visualizar proteínas é possível com EM. Mas devido à secção, os métodos de EM convencionais normalmente não deixam a célula intacta26,o que leva à perda de informações importantes sobre o contexto e a distribuição espacial de proteínas na membrana plasmática. Métodos para células inteiras com crio-TEM foram desenvolvidos6, é viável combinar rotulagem proteica com crio-EM27, também crio-STEM foi demonstrado28. No entanto, os fluxos de trabalho crio-EM são otimizados para estudar a ultraestrutura celular e estrutura proteica, e não tanto para analisar distribuições espaciais de proteína de membrana. A secagem de pontos críticos é outro método de preparação celular inteiro, mas as amostras são submetidas a várias etapas de secagem, e a técnica é altamente demorada29. Proteínas de membrana também foram examinadas através da fratura congelante7. Neste método, as células são fixas, congeladas e fraturadas. As partes fraturadas são replicadas por camadas de carbono e platina, e a amostra biológica é removida. As réplicas podem então ser analisadas com EM30. A análise celular inteira é impossível com a fração de congelamento porque se perde informações sobre a distribuição de proteínas na membrana dentro do contexto de toda a célula.
O método aqui apresentado permite que a membrana celular seja estudada sem a necessidade de fatiar o espécime9,31. As células são mantidas intactas para que a localização das proteínas da membrana seja visível a partir das imagens de fluorescência, que estão correlacionadas com as imagens EM. Estudar proteínas no nível de célula única e molécula única dentro de células intactas em estado hidratado mostrou-se possível com uma resolução de 2 nm usando STEM de proteínas rotuladas por QD usando este método de invólucro de grafeno9. Manter as células em seu estado natal é crucial, pois preserva a distribuição espacial de proteínas de membrana de tal forma que as análises são possíveis no nível de célula única e molécula única, o que é importante para entender as funções proteicas, e desenvolver novos medicamentos para abordagens terapêuticas.
Outro aspecto crítico das amostras biológicas de imagem com EM é o dano de radiação das amostras causadas pelo feixe de elétrons. As soluções geralmente incluem a redução da dose de elétrons tanto quanto possível ou vários métodos de revestimento, como encapsular o espécime entre camadas finas de carbono32. Nosso método mostra que o revestimento de grafeno reduz artefatos induzidos por feixe que emergem na superfície celular para amostras não revestidas. O exame das amostras biológicas quimicamente fixas e revestidas de grafeno é possível sob a irradiação do feixe de elétrons a 200 keV de energia do feixe até D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2 sem danos à radiação, como pontos brilhantes, aparecendo na amostra. Comparado com outros métodos EM que envolvem preparação elaborada de amostras, por exemplo, coloração, incorporação, secção (crio-) fratura, etc., o método descrito aqui é menos demorado. A rotulagem das proteínas é realizada dentro de algumas horas, e o revestimento de grafeno requer apenas cerca de 15 minutos para pesquisadores treinados. A preparação da amostra é comparável com os procedimentos necessários para microscopia de fluorescência.
O protocolo pode ser modificado em algumas etapas. O grafeno no microchip também pode ser seco ao ar para garantir que o grafeno não se mova quando manchado com um papel filtro. Se o grafeno estiver contaminado com sal, é possível deixá-lo flutuar na superfície da água por cerca de uma hora para dissolver o sal e, assim, minimizar a contaminação. A contaminação por cobre ou PMMA no grafeno pode ser reduzida estendendo as etapas de gravação correspondentes no protocolo. Outros métodos de revestimento de grafeno foram descritos onde, por exemplo, o grafeno-PMMA foi depositado diretamente nas células, e o PMMA foi removido por lavagem em acetona depoisde 33. Em nosso método, o PMMA foi removido antes do revestimento para evitar possíveis danos às células causados por etapas adicionais de lavagem de acetona. O NaCl foi escolhido como substrato aqui porque é plano, por isso não enruga o grafeno, e dissolve-se em água para liberar o grafeno9. Além disso, pode ser cortado no tamanho desejado e nenhum resíduo de substrato é deixado no grafeno. Mas levando esses critérios em consideração, outros substratos como cloreto de potássio também podem ser usados.
Para reduzir a chance de agrupamento potencial induzido pelo rótulo, a etapa de fixação de GA pode ser implementada diretamente após a fixação da FA, após a qual todas as proteínas de membrana são imobilizadas. A primeira etapa de fixação com fa já fixa a estrutura biológica, mas um nível reduzido de difusão de proteína de membrana ainda pode ocorrer34, possivelmente levando ao agrupamento induzido pelo rótulo devido à presença de múltiplos Streptavidin por QD. A fixação com GA pode levar a um sinal de autofluorescência durante o LM, e é, portanto, feita após O LM no protocolo descrito, mas pode ser reduzida conforme descrito em outros lugares34. O tampão de cacodilato é bastante tóxico, e outros fixativos também podem ser usados, mas o cacodilato é usado aqui, pois é um tampão comumente usado para protocolos EM, evita precipitados, previne o crescimento de bactérias e fungos, e é compatível com íons de cálcio que são necessários para preservar a integridade ultraestrutural das membranas lipídicas35. Se necessário, o tetroxida de ósmio pode ser usado como fixação adicional para estabilizar os lipídios. Isso ajudaria a melhorar o contraste da estrutura celular, mas também adicionar outro metal ao sistema e reduzir o contraste obtido nos QDs.
O protocolo descrito aqui contém muitas etapas que requerem boas instruções. Alguns treinamentos são necessários antes de manusear microchips para evitar arranhar a superfície sin dos microchips e evitar quebras. Como mencionado anteriormente, recomenda-se preparar microchips em duplicatas, pois a janela SiN pode quebrar de tempos em tempos. A obtenção do número necessário de células em um microchip também requer alguma experiência. Revestir as células com grafeno precisa de algum treinamento, pois pode ser difícil encontrar o ângulo de inclinação reto para flutuar grafeno na água. Ao pegar o grafeno da água, também pode ser difícil ver o grafeno fino. Assim que o grafeno estiver no microchip, o excesso de água precisa ser apagado com um papel filtro. Isso só deve ser feito com a ponta de um papel filtro, de tal forma, para evitar a remoção do grafeno do microchip.
O revestimento de grafeno impediu que artefatos aparecessem na amostra. Mas para D < 4 x 102 e-/Å2 também não surgiram artefatos para a amostra não revestida, e artefatos apareceram apenas para 2 amostras não revestidas. Assim, exames de células não revestidas também parecem possíveis, embora seria melhor usar grafeno e evitar o risco de formação de artefatos. A composição desses artefatos pode ser analisada no futuro para dar dicas sobre como evitar sua formação. Quanto à estabilidade estrutural das células, observou-se apenas uma pequena melhora do revestimento do grafeno. As células fixas foram aparentemente estabilizadas nas áreas finas examinadas, onde sua estrutura estava próxima da membrana SiN. O que não examinamos aqui, no entanto, foram a secagem de artefatos que são conhecidos por ocorrer em amostras celulares quando expostos ao vácuo4. A secagem das células levaria ao encolhimento das células para que as distâncias de QD mudassem como consequência. Para a dose eletrônica usada aqui, a distância de QDs de amostras revestidas de grafeno e não revestidas permaneceu estável. Outros estudos são necessários para examinar o efeito do revestimento de grafeno nas células para EM.
Uma limitação deste método é que a fixação química das células é necessária; portanto, nenhum experimento de células vivas pode ser realizado. Mas caso a rotulagem não seja necessária e as células com maior estabilidade estrutural sejam usadas, por exemplo, bactérias, então as células não fixadas podem ser fechadas em grafeno para EM36, embora com uma tolerância de dose de elétron diferente. Além disso, as proteínas não são diretamente detectáveis, por isso os QDs são necessários para visualizar as proteínas. O método beneficiaria de rótulos menores. Um ponto de discussão é se é bom ou ruim que a ultraestrutura não seja claramente visível. Nosso método é semelhante ao da microscopia de fluorescência, onde apenas proteínas selecionadas são visíveis37. Aumentar a visibilidade da ultraestrutura também adicionaria muito mais informações à imagem e, em algum momento, impediria a detecção das posições individuais do rótulo. Além disso, o método descrito aqui é para uma espécie de proteína, e adições do protocolo são necessárias para ser capaz de rotular múltiplas proteínas. Por último, o método funciona quando uma pequena molécula de alta afinidade especificamente vinculativo, como anticorposmiméticos 21 ou nanocorpo38, está disponível. Anticorpos comumente usados são muito maiores e impediriam a detecção do estado funcional das subunidades proteicas em oligômeros.
Nosso método é útil para estudar a função proteica em células inteiras usando EM, mantendo as células em estado hidratado. É facilmente possível examinar séries de células. Outros tipos de células e proteínas também podem ser estudadas. Se a rotulagem de proteínas não for necessária, um subconjunto do protocolo pode ser usado para revestimento de grafeno de grande variedade de espécimes biológicos. A capacidade de estudar células inteiras é relevante na pesquisa celular para entender correlações da função da proteína da membrana no nível molecular.

A análise da função proteica da membrana é essencial para a pesquisa biológica celular e para o desenvolvimento de medicamentos. Uma classe de experimentos importantes envolve o exame de posições de proteína de membrana nas células. Essas informações podem ser usadas para deduzir conclusões sobre a montagem de proteínas em complexos proteicos e seus locais específicos na membrana plasmática, que, através de montagem dinâmica e desmontagem, impulsiona uma grande variedade de funções celulares. Entre outras técnicas, microscopia leve (LM) e microscopia eletrônica (EM) são utilizadas para estudar funções proteicas em células. O LM permite a análise de células inteiras em líquido; no entanto, a resolução é restrita a 200-300 nm para convencional e até 20 nm para microscopia de fluorescência de super resolução em condições práticas1,,2. EM fornece cerca de 1 Å resoluções3,mas a preparação convencional da amostra requer desidratação, coloração metálica para melhorar o contraste da imagem e incorporação em uma substância de montagem, como resina, para microscopia eletrônica de transmissão (TEM)4. Para preservar amostras biológicas em um ambiente mais nativo, as técnicas crio-EM podem ser utilizadas5,,6. As amostras são rapidamente congeladas em gelo amorfo, e, se necessário, seccionadas. Outra opção é o EM7 defraturamento de congelamento .
Técnicas em EM para estudar proteínas de membrana dentro de células intactas em seu estado líquido nativo surgiram na última década8,9,10,11. Uma resolução espacial de 2 nm foi alcançada em proteínas de membrana rotuladas de ponto quântico (QD) em células inteiras cultivadas em uma membrana SiN e fechadas por uma camada de grafeno9.
Aqui, são descritos detalhes de um protocolo para rotulagem de proteínas e revestimento de grafeno9,12. O objetivo deste protocolo é analisar a distribuição espacial de HER2 na membrana de células fixas inteiras, preservando as células em estado hidratado. O revestimento com grafeno evita a secagem das células no vácuo, e também reduz os danos causados pela radiação13. Este método fornece informações sobre proteínas de membrana rotuladas dentro da membrana plasmática intacta, mas o método não é útil para estudar a ultraestrutura celular, como geralmente é feito com EM.
O grafeno é o nanomaterial mais fino conhecido, e consiste em uma única folha cristalina de espessura de átomo de carbono disposta em uma rede de favo de mel14. Possui propriedades únicas, incluindo alta flexibilidade e resistência mecânica. Pesquisas recentes mostraram que o grafeno livre de defeitos é impermeável a gases e líquidos, mas defeitos permitem a permeação de hidrogênio15. Este vazamento pode ser reduzido usando grafeno multicamadas como usado aqui. O grafeno bicamado mostrou-se recentemente útil como suporte para amostras de crio-EM, melhorando a homogeneidade da fina camada de gelo em comparação com o óxido de grafeno, onde apenas camadas não uniformes podem ser formadas16. O grafeno também foi mostrado para reduzir os danos do feixe de amostras biológicas durante a microscopia eletrônica de transmissão em fase líquida13,17. Como um experimento exemplar, o HER2 expresso na linha de células cancerígenas de mama de mamíferos SKBR3 foi rotulado com QDs18 e sua distribuição espacial registrada usando STEM. As células foram semeadas em um microchip Si com uma membrana SiN transparentede elétrons 19. Os microchips foram escolhidos como suporte, pois são robustos, compatíveis com LM e EM, e todo o procedimento de rotulagem pode ser realizado diretamente no microchip19. Após o anexo da célula, o HER2 foi rotulado com um protocolo de rotulagem de duas etapas20. Primeiro, um composto mimético anti-HER2 biotinilado21 foi anexado ao HER2. As células foram então quimicamente fixadas para evitar o agrupamento de receptores induzidos pelo rótulo, e para aumentar a estabilidade da ultraestrutura celular. QDs revestidos de streptavidin foram posteriormente ligados ao complexo mimético de anticorpos HER2. O sinal de fluorescência brilhante e o núcleo eletrônico-denso dos QDs permitiram a fluorescência correlativa e a microscopia eletrônica (CLEM)20. O CLEM é especialmente útil porque as regiões de interesse celular para a análise de STEM podem ser selecionadas a partir da visão geral imagens de microscopia de fluorescência destacando a localização de HER2 nas células. As células foram analisadas por microscopia de fluorescência para identificar regiões celulares com altos níveis de HER2. Depois disso, uma folha de grafeno de 3-5 camadas de espessura foi transferida para as células para revestimento9,22. Posteriormente, a amostra foi montada em um suporte de espécime EM. Os dados STEM foram adquiridos utilizando-se o detector de campo escuro anular (ADF), fornecendo informações sobre a distribuição espacial de HER2 na superfície celular em relação à localização da superfície celular, mas não fornecendo informações sobre a ultraestrutura da célula. Para determinar a estabilidade da amostra sob irradiação do feixe de elétrons, as amostras foram examinadas em dose crescente (D) em uma série de imagens. Foi investigada a diferença entre amostras revestidas de grafeno e não revestidas. Vários tipos de danos causados por radiação foram avaliados.
O protocolo descrito aqui usa a linha de células cancerígenas de mama her2 superexpressivas DE mamíferos SKBR3 como um sistema modelo para atingir HER223. O protocolo inclui a preparação de uma amostra revestida de grafeno, e uma amostra semelhante, mas sem revestimento de grafeno para comparação. O experimento é preparado em duplicata, uma vez que a janela SiN pode quebrar de vez em quando, e para obter uma duplicata experimental na maioria dos casos. O rendimento geral do método é alto, o que significa que microchips com células cobertas de grafeno são geralmente obtidos com um erro excepcional, embora nem toda a janela SiN possa ser coberta com grafeno em todos os casos. Duplicatas não são descritas no protocolo.
O protocolo de rotulagem (etapas 1-5) é comparável ao protocolo de rotulagem do receptor do fator de crescimento epidérmico em células fibroblastos COS7 publicados anteriormente24; detalhes nesse papel são referidos em relação ao manuseio dos microchips e ao uso das placas do poço. O protocolo a seguir é otimizado para rotular HER2, revestimento de grafeno9e examinar a tolerância à radiação da amostra.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone for HPLC (min. 99.8 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2626-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL54 analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany</td>
			<td>30029077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free, &#8805; 98 %, for molecular biology</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 &#181;M</td>
			<td>Affibody, Solna, Sweden</td>
			<td>10.0817.02.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F</td>
			<td>JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylic acid sodium salt trihydrate &#8805; 98 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5169.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>627861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>5401000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 ml sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>9286.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>PK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>4430000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2222-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>F8141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Leica DMI6000</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>10099141</td>
			<td>lot number: 1751893</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Goat Serum, New Zealand origin</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>lot number: 1788320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy 48R CO2 Incubator</td>
			<td>New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>CO48310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan Model 950 Solarus&#151; Plasma Cleaner</td>
			<td>Gatan GmbH, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine &#8805; 98.5 % Ph.Eur., USP, BP</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Heidolph Instruments GmbH &#38; CO. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>MR 3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0557-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSc-Advantage&#151; Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocean Microchips SiN window 400x150 &#181;m, 200 nm spacer</td>
			<td>DENSsolutions, Delft, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>10 mL: C542.1 20 ml: T550.1</td>
			<td>purchased via Carl Roth GmbH&#38;Co. KG, Karlsruhe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>VO 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td>#291-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfekt-Kescher with handle</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2-200&#181;l: 7695892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>0.1-10 &#181;l: 7695880 2-100 &#181;l: 7695883 100-1000 &#181;l: 7695886 1250 &#181;l XL: 7695887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 &#181;M</td>
			<td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased</td>
			<td>Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA</td>
			<td>94-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell, Dassel, Germany</td>
			<td>300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo Microscope Leica M60</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath SW22</td>
			<td>Julabo GmbH, Seelbach, Germany</td>
			<td>9550322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>HN00.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm</td>
			<td>International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA</td>
			<td>9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, &#8805; 99.5 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium persulfate</td>
			<td>carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>4365.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 &#181;m</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P668.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm</td>
			<td>ACS material, Pasadena, CA, USA</td>
			<td>TTG30011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Dumoxel 03</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0103-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Inox 02</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0102-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, plastic replaceable tip</td>
			<td>Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland</td>
			<td>5SVR.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water ROTISOLV HPLC gradient grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>A511.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy

Um protocolo é descrito para investigar o receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) na membrana plasmática intacta das células cancerígenas de mama usando microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM). Células da linha de células cancerígenas de mama de mamíferos SKBR3 foram cultivadas em microchips de silício com janelas de nitreto de silício (SiN). As células foram quimicamente fixas, e as proteínas HER2 foram rotuladas com nanopartículas de ponto quântico (QDs), usando um protocolo de ligação biotina-streptavidina de duas etapas. As células foram revestidas com grafeno multicamadas para manter um estado hidratado, e para protegê-las contra danos causados pelo feixe de elétrons durante o STEM. Para examinar a estabilidade das amostras sob irradiação do feixe de elétrons, foi realizado um experimento de série de doses. Foram comparadas amostras revestidas de grafeno e não revestidas. Os danos induzidos pelo feixe, na forma de artefatos brilhantes, apareceram para algumas amostras não revestidas no aumento da dose de elétrons D,enquanto nenhum artefato apareceu em amostras revestidas.

A Figura 1A mostra as células semeadas de tal forma que a janela é coberta, mas com espaço suficiente para permitir que elas se achatem e aderam, levando à confluência de cerca de 2/3rd (Figura 1B). No caso de muitas células serem semeadas em um microchip(Figura 1C),não há espaço suficiente para todas as células aderirem ao microchip. A Figura 1D mostra o mesmo microchip depois das 24h. Mais da metade das células não achatava. Por outro lado, se poucas células forem semeadas(Figura 1E),a janela SiN acabará com um grande espaço vazio após 24 horas, como visto na Figura 1F. A Figura 1G mostra a imagem DIC das células na Figura 1A e Figura 1B. A Figura 1H mostra a imagem de fluorescência correspondente falsa colorida em amarelo indicando rotulagem bem sucedida de HER2.
Os dados stem representativos são mostrados na Figura 4. Foram investigadas células SKBR3 revestidas de grafeno (coluna esquerda) e não revestidas (coluna direita). Figura 4A,B mostrar M = 800x imagens de visão geral das células na janela. As áreas mostradas como insets foram imagens em M = 80.000x durante a série de dose, ver Figura 4C,D. Os QDs são visíveis como pontos brilhantes aqui. Figura 4E e Figura 4F mostram M = 50.000x imagens ampliadas adquiridas nos locais dos retângulos na Figura 4C,D. Ambas as imagens foram registradas após a aquisição de uma série de doses com D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. A série de doses foi registrada em M = 80.000x. As áreas expostas podem ser reconhecidas como retângulos, pelos quais o retângulo era claramente visível para a amostra não revestida(Figura 4F).
Para verificar a presença de grafeno, foram adquiridos padrões de difração de áreas sem células, mas com ou sem grafeno na janela sin. A estrutura hexagonal do grafeno foi observada no padrão de difração da amostra revestida de grafeno(Figura 4G),enquanto estava ausente para a amostra não revestida(Figura 4H). O padrão de difração do grafeno de cristal único terá simetria de seis vezes devido à estrutura hexagonal altamente ordenada do grafeno. Assim, a estrutura hexagonal indica a presença de grafeno nas amostras.
Para investigar o efeito da iluminação do feixe de elétrons na amostra, as imagens STEM foram adquiridas em uma série de imagens com uma dose eletrônica acumulada. Os resultados representativos para amostras não revestidas e revestidas de grafeno são mostrados nas Figuras 5A-D e Figura 5E-G,respectivamente. Todos os dados foram adquiridos na borda da célula, onde a célula é a mais plana, e a estrutura observada é, portanto, a mais próxima da membrana SiN. A exposição de amostras não revestidas levou a estruturas brilhantes que aparecem nas superfícies celulares em D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (Figura 5B). Essas estruturas tornaram-se maiores com doses mais altas, por isso foram claramente visíveis na última imagem da série em D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2 (Figura 5C,D). Essas manchas não apareceram em nenhuma das amostras revestidas de grafeno(Figura 5E-G).
Microchips adicionais foram preparados e examinados usando o protocolo descrito no anterior. No total, foram investigadas seis amostras revestidas e sete não revestidas. Duas das sete amostras não revestidas mostraram esses artefatos. Nenhuma das amostras revestidas mostrou nenhum ponto brilhante adicional.
Como outra medida de dano por radiação, a distância entre os QDs foi examinada. Se os danos estruturais ocorressem, seria de esperar que as distâncias entre os QDs mudassem. Mudanças nas distâncias foram medidas para diferentes pares de QDs com o acúmulo de D para uma gama de distâncias de pares. A Figura 5H mostra que a variação relativa das partículas para amostras não revestidas permaneceu abaixo de 1,3% em média, enquanto a distância relativa média permaneceu abaixo de 0,8% para as amostras revestidas. Pode-se, portanto, concluir que o revestimento de grafeno estabilizou a amostra, mas as amostras secas sem revestimento de grafeno também foram notavelmente estáveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> Figura 1: Semeadura celular em uma janela SiN de um microchip de silício e HER2 rotulado. (A) Imagem exemplar de uma região da janela SiN com células SKBR3 5 min após a semeadura no microchip. (B) As mesmas células se espalham na mesma janela sin após 24 h. (C) células SKBR3 em um microchip Si 5 min após a semeadura. (D) Mesmas células que em (C) após 24 h. As células não se achataram corretamente, pois havia muitas células nos chips ao semear. (E) Células em um microchip 5 min após a semeadura. (F)Apenas poucas células eram visíveis na janela porque poucas células foram semeadas no microchip. (G) Imagem DIC das mesmas células SKBR3 após a rotulagem QD de HER2. (H) Imagem de sobreposição de DIC e imagem de fluorescência correspondente de células SKBR3 rotuladas com HER2-QD655 (cor falsa em amarelo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> Figura 2: Limpeza e transferência de grafeno para cristais NaCl. (A) PMMA-grafeno-on-polymer está imerso em água pura para liberar grafeno PMMA. O grafeno PMMA pode ser pego com um escorregador de vidro. (B) As contaminações à base de cobre foram gravadas utilizando-se uma solução de persulfato de sódio. Para limpar o grafeno, foi transferido para um béquer contendo água deionizada. Esses passos foram repetidos 3 vezes. O PMMA-grafeno foi então transferido para solução saturada de NaCi em água pura. Um cristal NaCl foi usado para pegar o grafeno da solução de sal. (C) O PMMA-grafeno no cristal NaCl foi seco por 30 minutos à temperatura ambiente. PMMA foi removido incubando o bloco em acetona por 30 minutos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> Figura 3: Revestimento de grafeno de células semeadas em um microchip Si. (A) Procedimento de revestimento de grafeno. O grafeno no cristal NaCl é liberado na superfície da água. A peça de grafeno é então capturada com um laço de metal e transferida para o microchip Si. (B) Microchip (2,0 x 2,6 mm) com uma janela SiN de dimensões 400 x 160 μm sem grafeno. As células SKBR3 eram visíveis como manchas escuras. (C) Grafeno (círculo vermelho) flutuando na superfície de um béquer cheio de água. (D) Grafeno pego com um laço de metal. (E) O microchip anexado à gota d'água de modo que o grafeno estivesse em cima da janela SiN. (F) Microchip após revestimento de grafeno. O grafeno era visível como um brilho roxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> Figura 4: HAS de células SKBR3 revestidas de grafeno e não revestidas na janela SiN. (A) Imagem STEM de uma amostra revestida de grafeno adquirida a uma imagem DE M = 800x. (B) STEM de uma amostra não revestida adquirida em M = 800x. (C) M = imagem de 80.000x registrada na posição do retângulo azul em A. Linhas amarelas representam exemplos de distâncias medidas dentro de partícula. (D) M = imagem de 80.000x registrada na posição do retângulo azul em B. Linha amarela representa exemplos de distâncias medidas dentro de partículas. (E) M = imagem de 50.000x da mesma região que C exposta a D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. (F) M = imagem de 50.000x da mesma região de D e exposta a D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. A área exposta foi claramente vista. (G) Padrão de difração de uma amostra revestida de grafeno de uma área sem células. A simetria de seis vezes do grafeno é visível como pontos brilhantes. (H) Padrão de difração de uma amostra sem grafeno não mostrando pontos brilhantes de 6 vezes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> Figura 5: Artefatos surgidos em amostras sem revestimento de grafeno. (A) Primeiras imagens de regiões em amostras sem revestimento de grafeno adquiridas em M = 80.000x, e expostas a D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2. (B) Imagens com os primeiros artefatos surgidos em D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (setas amarelas). (C, D) Última imagem da série adquirida com D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Artefatos eram visíveis como pontos brilhantes. (E-G) Amostras revestidas de grafeno sem surgir artefatos. (E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. (H) Mudança relativa nas distâncias de partículas para amostras revestidas de grafeno e não revestidas. Duas das amostras não revestidas que mostram artefatos, uma das quais mostradas em (A-C), e a última imagem da segunda amostra em D, bem como três amostras revestidas foram analisadas (uma é mostrada em E-G). No total, foram examinados dez pares de QD por amostra com distâncias que variavam entre 250 nm e 3 μm. A mudança relativa reflete a média de todas as medidas em um grupo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela Suplementar 1: Receitas para soluções e tampões. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

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Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

Apresentado aqui é um protocolo para rotular proteínas de membrana em células de mamíferos e revestir a amostra com grafeno para microscopia eletrônica de transmissão de transmissão de fase líquida. A estabilidade das amostras contra os danos causados pela radiação também pode ser estudada com este protocolo.

Gabinete de grafeno de células mamíferas quimicamente fixas para microscopia eletrônica de fase líquida

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Este método mantém amostras biológicas em um ambiente nativo e reduz o artefato induzido pelo feixe de elétrons. A principal vantagem é que essa técnica é aplicável a células inteiras. Assim, as células não precisam ser desidratadas, manchadas ou seccionadas antes da microscopia eletrônica.A capacidade de imagem de receptores em células cancerosas no contexto de toda a membrana plasmática intacta é um aspecto importante que pode levar a novas abordagens terapêuticas e ao desenvolvimento de novas drogas anticancerígenas. Vou demonstrar o trabalho com células, revestimento de grafeno e microscopia, e Sercan Keskin mostrará como preparar o grafeno. Para começar, adicione 100 microliters de suspensão celular a dois poços de uma placa de 96 poços contendo microchips revestidos PLL e FLP com a membrana de nitreto de silício voltada para cima e 50 microliters de meio livre de soro.Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco minutos para permitir que as células se conectem ao microchip. Verifique a densidade das células do microchip com um microscópio invertido e certifique-se de que as células cobrem a janela com espaço suficiente para achatar e aderir. Para rotular HER2 nas células, coloque os microchips nos poços da primeira linha da placa de rotulagem.Em seguida, lave os microchips com PBS BSA. Para evitar a ligação inespecífica do mimético do anticorpo, incubar os microchips com PBS BSA GS por cinco minutos. Em seguida, com 200 anticorpos nanomolar miméticos por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Para remover o grafeno PMMA do polímero, pipeta algumas gotas de água no polímero ao redor do grafeno PMMA. Em seguida, mergulhe-o na água com um ângulo de 30 a 45 graus para liberar o grafeno PMMA. Para gravar contaminantes à base de cobre, prepair uma solução de 50 mililitros de 0,42 persulfeto de sódio molar na água.Use uma lâmina de vidro padrão para transferir o grafeno PMMA para a solução de persulfito de sódio com o lado do grafeno para baixo. O grafeno PMMA flutuará até o topo da solução. Deixe lá durante a noite.No dia seguinte, transfira o grafeno PMMA da solução de persulfeto de sódio para água limpa. Deixe flutuar na água por meia hora. Repita a lavagem um total de três vezes para remover todos os resíduos de persulfito de sódio do grafeno PMMA.Em seguida, transfira o grafeno PMMA para um cristal de cloreto de sódio. Prepare uma solução saturada de cloreto de sódio na água em uma placa de Petri e transfira o grafeno PMMA em cima da solução com o lado do grafeno para baixo. Segure o cristal do cloreto de sódio com pinças e pegue o grafeno PMMA flutuante.Em seguida, segure-o verticalmente por dois minutos para deixar o excesso de água fluir. Deixe secar até a temperatura ambiente por 30 minutos e asse em um forno a 100 graus Celsius por 20 minutos. Remova completamente a água.Pré-aqueça acetona em uma placa de vidro Petri a aproximadamente 50 graus Celsius em uma placa quente no capô da fumaça. Observe a temperatura cuidadosamente para evitar o fogo. Mergulhe o grafeno PMMA no sal na placa de Petri cheia de acetona e deixe dissolver o PMMA por 30 minutos.Deixe o grafeno sobre o ar salgado secar completamente antes de usá-lo para preparação da amostra. Lave um microchip preparado e rotulado em água pura para remover quaisquer resíduos de sal do tampão e coloque-o no papel filtro. As células devem ser visíveis como manchas escuras.Use uma lâmina de barbear para cortar o grafeno multicamadas no cristal do cloreto de sódio em uma peça que se encaixa na janela de nitreto de silício de um microchip. Remova o grafeno do cristal do cloreto de sódio mergulhando-o em um béquer de água, inclinando o cristal em um ângulo de 45 graus em relação à superfície. Pegue o grafeno com uma alça metálica da superfície da água, depois toque na superfície superior do microchip com a superfície inferior do laço, fazendo com que o microchip grude na alça metálica.O grafeno pode ser visto em cima do microchip. Sob um estereótipo, use papel filtro para remover a água restante do microchip para que o grafeno cubra todas as células da janela do nitreto de silício. Coloque o microchip em um papel filtro com pinças.O grafeno é visível como um brilho roxo no microchip. Transfira o microchip do papel para uma placa de Petri compartimental. Pipeta uma gota de água em um dos compartimentos livres e feche a tampa para fornecer uma atmosfera saturada de água.Em seguida, sele o prato do compartimento com filme de parafina e guarde-o na geladeira a quatro graus Celsius. Ajuste o STEM para 200 quilovolt de energia do feixe usando uma amostra de alinhamento para um tamanho de sonda de pelo menos 0,2 nanômetros, ajustando as lentes do condensador. Defina uma corrente de sonda de 180 Picoampere e um feixe de convergência semiângulo de 13,2 milagrianos inserindo uma abertura.Ajuste o detector ADF STEM abrindo faixa de semiângulo para 68 a 280 milradianos ajustando as configurações da lente do projetor. Em seguida, defina o tamanho da imagem STEM para 2048 por 2048 pixels e o tempo de consumo de pixels para seis microsegundos. Carregue o microchip com células revestidas de grafeno em um suporte padrão de espécime para ter de tal forma que as células estejam viradas para cima e carregue o suporte no microscópio eletrônico.Adquira uma imagem geral na ampliação de 800 X. Em seguida, identifique uma região de interesse e imagem das nanopartículas de ponto quântico a 80.000 X com um tamanho de pixel de 1,3 nanômetros. Células semeadas são mostradas aqui.A janela está coberta, mas há espaço suficiente para permitir que eles se achatem e aderam. Quando muitas células foram semeadas em um microchip, não havia espaço suficiente para todas as células aderirem. Depois de 24 horas, mais da metade das células não se achatava.Se poucas células forem semeadas, a janela do nitreto de silício acabará com um grande espaço vazio após 24 horas. Imagens de DIC e fluorescência de células semeadas são mostradas aqui, demonstrando rotulagem bem sucedida de HER2. O STEM foi realizado em células SKBR3 revestidas de grafeno e não revestidas.Os insets nas imagens de ampliação de 800 X foram imagens a 80.000 X.As nanopartículas de ponto quântico são visíveis como pontos brilhantes na ampliação de 50.000 X. Para investigar o efeito da iluminação do feixe de elétrons na amostra, as imagens STEM foram adquiridas em uma série de imagens com uma dose eletrônica acumulada. Os resultados representativos para amostras não revestidas e revestidas de grafeno são mostrados aqui.A exposição de amostras não revestidas levou a estruturas brilhantes que apareciam nas superfícies celulares, o que não ocorreu com nenhuma das amostras revestidas de grafeno. A variação média da distância relativa dos pares de partículas permaneceu abaixo de 1,3% para amostras não revestidas e abaixo de 0,8% para as amostras revestidas. Após este procedimento, diferentes tipos de proteínas de membrana podem ser imagens em células inteiras usando outros métodos de microscopia.Esta técnica permite a imagem de proteínas na membrana plasmática intacta para obter mais informações sobre a organização da membrana plasmática e a interação entre proteínas.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...