Name: graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy at JoVE.com

Vi tackar D. B. Peckys för hjälp med cellkulturprotokollet, F. Weinberg för att ha granskat manuskriptet, T. Trampert för hjälp med experimenten och figurerna, S. Smolka för hjälp med figurerna, och E. Arzt för hans stöd genom INM. Denna forskning finansieras av Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

1. Rengöring av mikrochips och beläggning med poly-L-lysin (PLL) och fibronectinliknande protein (FLP)
<ol><li>Placera två mikrochips med ett SiN-membran (2,0 x 2,6 mm) i 50 mL aceton. Hantera mikrochipsen försiktigt med den platta sidan uppåt. Undvik att bryta kanterna genom att använda flat-näbbpincett. Undvik att vidröra den övre ytan på mikrochipsen vid hantering med pincetter för att förhindra brott på SiN-fönstret. OBS: Man kan också använda polytetrafluoretylenbelagda eller kolspetspincett för att förhindra skador på mikrochipsen.</li>
	<li>Tvätta chipsen i 2 min genom att försiktigt skaka bägaren, titta på mikrochips inte vända över.</li>
	<li>Överför mikrochipsen till 50 mL etanol och tvätta i 2 min genom att försiktigt skaka bägaren. Se till att överföringen går snabbt så att överskottet av aceton inte torkar in.</li>
	<li>Tvätta mikrochipsen med 50 mL vatten i 10 min.</li>
	<li>Doppa mikrochipsen i en nyberedd bägare på 20 mL etanol.</li>
	<li>Placera mikrochips på en renrumsvävnad för torkning.</li>
	<li>Plasma rengöra mikrochips med 11,5 sccm O2 och 35 sccm Ar på 70 mTorr och radiofrekvens (RF)-mål på 50 W i 5 min.</li>
	<li>Placera mikrochipsen i en laminär flödeshuva för sterilcellsarbete.</li>
	<li>Bered en lösning på 0,01% PLL i vatten. Bered en lösning på 15 μg/mL FLP i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).</li>
	<li>Förbered en 24 brunnsplatta under laminär flödeshuven och fyll 5 brunnar individuellt med 1 mL av lösningarna i följande ordning: brunn 1 – PLL; brunn 2 – vatten; brunn 3 – vatten; brunn 4 – FLP; väl 5 – PBS och väl 6 – PBS. OBS: Genomför tvättsteg genom att doppa ett mikrochip i den angivna 24 eller 96 brunnen i några sekunder med hjälp av pincett. Utför inkubationssteg genom att inkubera mikrochipsen i 24 eller 96-brunnen i den indikerade lösningen för indikerad tid och temperatur. Överför mikrochipsen till en annan brunn inom några sekunder.</li>
	<li>Inkubera mikrochipsen i PLL-lösning i 5 min. Tvätta sedan mikrochipsen i vatten två gånger.</li>
	<li>Inkubera mikrochipsen i FLP i 5 min. Tvätta sedan mikrochipsen i PBS två gånger.</li>
	<li>Överför båda mikrochipsen till brunnar (ett för varje mikrochip) av en ny 96 brunnsplatta som förfylls med 50 μL serumfritt medium för cellsådd.</li>
	<li>Inkubera mikrochipsen vid 37 °C och 5 % CO2 tills cellupphängningen är förberedd.</li>
</ol>2. Såddceller på SiN membran mikrochips
<ol><li>Ställ in alla förnödenheter och utrustning i en laminär flödeshuva för att säkerställa sterilt arbete.</li>
	<li>Tvätta bröstcancer cellinjen, SKBR3, i en cellodling kolv med tillväxtmedium en gång. Använd Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) som innehåller 10% fetalt kalvserum (FCS), och 1% icke-essentiella aminosyror (NEAAs) som tillväxtmedium.</li>
	<li>Inkubera cellerna med 1 mL av cellavlossningslösningen tills cellerna lossnat från kolven.</li>
	<li>Tillsätt 5 mL tillväxtmedium till de fristående cellerna i kolven. Överför denna suspension till ett centrifugrör.</li>
	<li>Pipetter 20 μL av cellupphängningen till en hemocytometer för att erhålla cellkoncentrationen. Använd följande formel. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ01.jpg">.</li>
	<li>Förbered en dispergerad cellupphängning på 2,5 x 105 celler/mL. Beräkna det beeddade cellupphängningens beedd med: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ02.jpg"> och fyll på med tillväxtmedium till önskad volym.</li>
	<li>Tillsätt 100 μL av cellupphängningen till de två brunnarna i en 96 brunnsplatta som innehåller PLL- och FLP-belagda mikrochips med SiN-membranet vänt uppåt och 50 μL serumfritt medium så att varje brunn innehåller 25 000 celler.</li>
	<li>Inkubera plattan vid 37 °C och 5% CO2 i 5 min för att vänta på att cellerna fäster vid mikrochipet. OBS: Vid denna punkt kan celler lossna från mikrochip eftersom de inte har anslutit sig ännu.</li>
	<li>Kontrollera cellernas densitet på mikrochipet med ett inverterat mikroskop. Se till att celler täcker fönstret med tillräckligt med utrymme för att platta ut och hålla sig (se bild 1A). OBS: Fler celler kan vid behov tillsättas på denna punkt.</li>
	<li>Överför mikrochipsen till nya brunnar som innehåller 200 μL tillväxtmedium och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 över natten.</li>
	<li>På eftermiddagen nästa dag, överföra både mikrochips till serum-fria medium (serum svält medium) om celler har plattat ut och anslutit sig till en visuellt inspekterade konfluency (dvs. den fraktion av fönstret området täckt med celler) på ca 2/3 (se figur 1B). Byt till serumfritt medium efter behov för att få cellerna i ett definierat startvillkor efter behov för jämförelse mellan olika experiment25.</li>
	<li>Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 över natten. OBS: Var medveten om att cellmängderna kan skilja sig åt beroende på tillväxthastigheter och cellmorfologi för andra cellinjer.</li>
</ol>3. HER2 märkning och fixering
<ol><li>Förbered lösningarna enligt beskrivningen i kompletterande tabell 1.<ol>
<li>Arbeta under laminär flödeshuven för att säkerställa sterilt arbete. Använd en 96 brunnsplatta kallad märkningsplatta I, och fyll 6 brunnar per mikrochip med 200 μL av märkningsplattan I-lösningar: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, antikroppsmimetik, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. Använd en rad (en bokstav per rad, t.ex., A1 till A6) av brunnsplattan per mikrochip. Värm märkningsplattan till 37 °C.</li>
		<li>Under en fume huva, förbereda en 24 brunnsplatta kallad fixeringsplatta, och fyll 8 brunnar per mikrochip med 500 μL av fixeringsplattan lösningar: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS / glycin, PBS / BSA. FÖRSIKTIGHET: CB är akut giftigt genom inandning eller oralt intag och är farligt för vatten. Arbeta under draghuven med lämpligt skydd och kassera CB enligt säkerhetsdatabladet (SDS). FA är frätande och skadligt för hud och hälsa. Arbeta under draghuven och hänvisa till SDS för information om hantering och kassering.</li>
		<li>Förbered en 96 brunnsplatta som benämns märkningsplatta II och fyll på 4 brunnar per mikrochip med 200 μL av etiketteringsplattan II-lösningar: QDs, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. OBS: Här används en 24 brunnsplatta för att bättre se mikrochipsen i brunnarna. Om du vill använda mindre antikroppsmimetiska (steg 3.2) och QDs (steg 3.4), använd 96 brunnsplattor för dessa steg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Märk IN HER2 i cellerna.<ol>
<li>När dessa plattor är klara, börja märka genom att placera mikrochips i brunnarna i den första raden av märkningsplatta 1.</li>
		<li>Tvätta mikrochipsen med PBS/BSA i 96 brunnsplattan som är markerad som märkningsplatta I.</li>
		<li>Blockera ospecifika platser för att förhindra ospecifik bindning av antikroppsimimetiska genom att inkubera med PBS/BSA/GS i 5 min vid 37 °C och 5% CO2.</li>
		<li>Inkubera med 200 nM antikroppsmimetiskt i 10 min vid 37 °C och 5% CO2.</li>
		<li>Tvätta mikrochip tre gånger i PBS/BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixa cellerna.<ol>
<li>Överför mikrochipsen till 24 brunnsfixeringsplattan i fumhuven. OBS: Inget sterilt arbete behövs härifrån.</li>
		<li>Tvätta en gång med CB i några sekunder.</li>
		<li>Fixa celler med 3% FA i 10 min.</li>
		<li>Tvätta en gång med CB och tre gånger med PBS.</li>
		<li>Blockera fria aldehydgrupper av FA genom att inkubera med PBS-glycin i 2 min.</li>
		<li>Tvätta mikrochips med PBS-BSA en gång.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fäst QDs-na.<ol>
<li>Flytta mikrochipsen till 96 välmärkningsplattan II.</li>
		<li>Inkubera med 20 nM QDs i 12 min.</li>
		<li>Tvätta mikrochipsen med PBS/BSA två gånger.</li>
		<li>Förvara mikrochipsen i en brunn som innehåller PBS/BSA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Lätt mikroskopi av de fasta cellerna
<ol><li>Förbered en 3,5 cm diameter glas botten skålen med 2 mL PBS / BSA lösning.</li>
	<li>Ta de första mikrochips, placera den upp och ner (celler nedåt) i glaset botten skålen och placera skålen i fluorescens mikroskop. Sänk ner mikrochipet långsamt i vätskan för att förhindra skador på cellerna.</li>
	<li>Förvärva differentialinterferens kontrast (DIC) och fluorescensbilder av varje mikrochip med ett 40x-mål och lämplig fluorescenskanal. OBS: Här används en excitationsvåglängd på 540-580 nm och en avgivande våglängd på 607-683 nm för att detektera QD655.</li>
	<li>Upprepa proceduren för det andra mikrochipet.</li>
</ol>5. Efter fixering
<ol><li>Utför alla steg under draghuven.</li>
	<li>Fyll på 6 brunnar per mikrochip av en 96 brunnsplatta med 200 μL av efterfixeringslösningarna: CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS. VARNING: GA är farligt för vatten, skadligt för hud, andningsorganen och ögon. Arbeta under draghuven och hänvisa till SDS för information om hantering och kassering.</li>
	<li>Placera båda mikrochips i sina respektive brunnar med cellerna uppåt.</li>
	<li>Tvätta en gång med CB.</li>
	<li>Fixa celler med 2% GA i 10 min.</li>
	<li>Tvätta en gång med CB.</li>
	<li>Tvätta tre gånger med PBS/BSA. OBS: Det första fixeringssteget med FA fixar redan den biologiska strukturen men en reducerad nivå av membranproteindiffusion kan fortfarande förekomma, eventuellt vilket leder till etikettinducerad klustring på grund av närvaron av flera streptavider per QD. Håll tiden för de experimentella stegen från FA fixering till GA, därför, så kort som möjligt för att minimera diffusion av proteinerna i membranet.</li>
	<li>Förvaras i PBS/BSA för att förhindra osmotiska stötar och 0,02 % natriumazid (NaN3) för att förhindra bakterietillväxt vid 4 °C tills grafenbeläggning i en ny brunnsplatta. Täta väl platta med paraffinfilm för att förhindra torkning. Mikrochipsen och cellerna är stabila upp till 2 veckor vid förvaring vid 4 °C. FÖRSIKTIGHET: NaN3 är farligt för vatten och akut giftigt genom oralt intag, för hud och andningsorganen. Arbeta under draghuven och hänvisa till SDS för information om hantering och kassering.</li>
</ol>6. Rengöring och överföring av grafen på saltkristaller
<ol><li>Avlägsna poly(metylmetakrylat) (PMMA)-grafen från PMMA-grafen-på-polymer (Bild 2A).<ol>
<li>Pipett några droppar vatten på polymeren runt PMMA-grafen. OBS: Se till att PMMA-grafen lätt lossnar den stödjande polymeren när den flyter på vattenytan.</li>
		<li>Sänk ned PMMA-grafen-på-polymeren i vatten med en vinkel på 30-45° för att frigöra PMMA-grafen. OBS: Polymeren ska endast vätas något. Pipetting för mycket vatten på polymeren kommer att lyfta upp och eventuellt vika PMMA-grafen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etsa kopparbaserade föroreningar med hjälp av en natriumpersulfatlösning (Figur 2B). OBS: Kommersiell grafen som odlas på kopparfolie innehåller ofta submikrometerkopparrester, som kan avlägsnas med en kopparsetatanlösning22.<ol>
<li>Bered en 50 mL-lösning på 0,42 M natriumpersulfat i vatten.</li>
		<li>Överför PMMA-grafen till natriumpersulfatlösningen med grafensidan nedåt med hjälp av en glasskiva av standard. PMMA-grafen kommer att flyta ovanpå lösningen.</li>
		<li>Lämna PMMA-grafen i natriumpersulfatlösningen över natten.</li>
		<li>Ta bort PMMA-grafen från natriumpersulfatlösningen och placera den ovanpå rent vatten med hjälp av en glasrutschkana. Låt den flyta på vattnet i en halvtimme.</li>
		<li>Upprepa föregående steg totalt tre gånger för att avlägsna alla natriumpersulfatrester från PMMA-grafen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Överför PMMA-grafen på en natriumklorid (NaCl) kristall.<ol>
<li>Förbered en mättad lösning av NaCl i vatten i en petriskål.</li>
		<li>Överför PMMA-grafen ovanpå NaCl-lösningen med grafensidan nedåt med hjälp av en glasrutschbana.</li>
		<li>Håll en NaCl kristall med pincett och plocka upp den flytande PMMA-grafen. OBS: Storleken på NaCl-kristallen bör vara något större än storleken på PMMA-grafen för att undvika att den utskjutande grafenen viks i kanten av saltet eller att grafenet med pincetter kontaktas. I dessa experiment används NaCl kristall av 12 mm x 12 mm x 0,5 mm för att plocka upp en 10 mm x 10 mm grafen ark och stödja den efteråt.</li>
		<li>Håll PMMA-grafen-på-salt vertikalt i 2 min för att låta överflödigt vatten rinna ut.</li>
		<li>Låt PMMA-grafen-på-salt torka i rumstemperatur i 30 min och grädda den i en ugn vid 100 °C i 20 min för att helt ta bort vatten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ta bort PMMA med hjälp av en acetontvätt (Bild 2C).<ol>
<li>Förvärmning aceton i en glas Petriskål till ~ 50 °C på en värmeplatta i rökhuven. Titta noga på temperaturen för att undvika brand.</li>
		<li>Sänk ner PMMA-grafen-på-salt i Petri-skålen fylld med aceton och låt den lösa upp PMMA i 30 min.</li>
		<li>Upprepa föregående steg totalt tre gånger med ny, ren aceton.</li>
		<li>Låt grafen-på-salt lufttorka ordentligt innan du använder den för provberedning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Beläggning av grafen
OBS: Proceduren för grafenbeläggning visas schematiskt i figur 3A.
<ol><li>Tvätta ett mikrochip förberett med fasta celler och märkt HER2 i rent vatten för att avlägsna eventuella rester av salt från bufferten. Placera mikrochipet på ett filterpapper. Cellerna syns som mörka fläckar (Bild 3B).</li>
	<li>Skär flerskiktsgrafen på NaCl-kristallen i en bit som passar SiN-fönstret på ett mikrochip med hjälp av ett rakblad.</li>
	<li>Förbered en bägare med rent vatten och ta bort grafenet från NaCl-kristallen genom att luta kristallen ca 45° vinkel med avseende på vattenytan och vidrör vattnet. Grafenet kommer att flyta upp på vattenytan (Figur 3C).</li>
	<li>Fånga grafenet med en metallslinga från vattenytan. Grafenet kommer att flyta inom droppen under slingan (Bild 3D).</li>
	<li>Rör vid mikrochipmens övre yta med den nedre slingans yta. Mikrochipet kommer att hålla sig till metallslingan. Grafenet kan ses ovanpå mikrochipet (Bild 3E).</li>
	<li>Använd under ett stereomikroskop filterpapper för att ta bort det återstående vattnet från mikrochipet, så att grafenet täcker alla celler på SiN-fönstret. OBS: Grafen kommer att röra sig när blottade. Se till att grafen stannar på toppen av fönstret genom att röra mikrochipet bara med kanten av filterpapper.</li>
	<li>Använd pincett för att ta bort mikrochipet från metallslingan och placera det på ett filterpapper. Grafenet syns som ett lila skimmer på mikrochipet (Figur 3F).</li>
	<li>Överför mikrochipet från papperet till ett fack Petriskål.</li>
	<li>Pipa en vattendropp i ett av de fria facken och stäng locket för att ge en vattenmättad atmosfär.</li>
	<li>Täta kupéfatet med paraffinfilm och förvara i kylen vid 4 °C om det krävs för ytterligare mätningar.</li>
</ol>8. STEM
<ol><li>Justera STEM vid 200 kV strålenergi med hjälp av ett uppriktnings-/testprov för en sondstorlek på minst 0,2 nm genom att justera kondensorlinserna, en sondström I = 180 pA (information om sondströmmen för olika mikroskopinställningar tillhandahålls av tillverkaren inom 5 % noggrannhet) och en strålekonvergenss semivinkel på 13,2 mrad genom att sätta in en bländare. Ställ in ADF STEM-detektorn som öppnar semivinkelintervall (inre och yttre) på 68-280 mrad genom att justera projektorns linsinställningar. Ställ in STEM-bildstorleken på 2048 x 2048 pixlar, och pixeln uppehåller sig t = 6 μs.</li>
	<li>Ladda mikrochipet med grafenbelagda celler i en standardplagrehåll för TEM på ett sådant sätt att cellerna är vända uppåt.</li>
	<li>Ladda hållaren i elektronmikroskopet.</li>
	<li>Skaffa en översiktsbild vid förstoring (M) = 800x (Bild 4) med hjälp av inställningarna i steg 8.1.</li>
	<li>Identifiera en region av intresse på en cell.</li>
	<li>Avbilda QDs-enheten med en ADF-detektor vid M = 80 000x vid en pixelstorlek d = 1,3 nm (Bild 4) med hjälp av inställningarna i steg 8.1.</li>
	<li>Skaffa en bild av området efter exponering med en lägre förstoring (här, M = 50,000x) för att visa det utsatta området (Bild 4).</li>
	<li>Beräkna elektrondosen <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ03.jpg"> där e är den elementära laddningen. Med de inställningar som anges i ovanstående, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ04.jpg"> och ett fel på 5 %.</li>
	<li>Skaffa 20 bilder för en dosserie med samma inställningar, men med t = 60 μs som resulterar i en ackumulerad dos på <img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/61458/image001.png">.</li>
	<li>För att bekräfta förekomsten av grafen, växla mikroskopet till TEM vid M = 1,200x, välj en region nära en cell och växla till diffraktionsläge. Spela in ett diffraktionsmönster vid en exponeringstid på 0,5 s, 2048 x 2048 x 3 pixlar, och en vald områdesöppning på 50 μm (bild 4).</li>
	<li>I slutet av sessionen, ta bort provet från mikroskopet, placera mikrochipet tillbaka in i fackfatet, försegla skålen med paraffinfilm och förvara den i kylen vid 4 °C om det krävs för ytterligare mätningar.</li>
	<li>Välj det andra mikrochipet som är förberett på samma sätt som det första mikrochipet men utan grafenbeläggning.</li>
	<li>Upprepa steg 8.2-8.11 men nu för detta prov. Spela in ett diffraktionsmönster med samma inställningar som i ovanstående, som jämförelse (Bild 4).</li>
</ol>9. Analys
OBS: För automatiserad upptäckt av QD positioner i en STEM-bild, använder analysen en plugin av lokal design för ImageJ (NIH), som beskrivs på andraställen 20. Insticksprogrammet finns tillgängligt på begäran.
<ol><li>Programvaran tillämpar automatiskt följande steg för att upptäcka partiklar i en STEM-bild:<ol>
<li>Använd ett Gaussiskt filter för att minska bildpunktsbruset.</li>
		<li>Applicera ett FFT-bandpassfilter (Fast Fourier Transform) för att endast erhålla nanopartiklar.</li>
		<li>Ange ett tröskelvärde för att binarize bilden.</li>
		<li>Använd en partikeldiameter på 10 nm med toleransfaktorn 2 för partikeldetektering.</li>
		<li>Detektera partikelpositioner.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mät mitt-till-mittenavståndet mellan tio par QDs per serie. Här mättes 10 avstånd med varierande storlek per serie.</li>
	<li>Beräkna den relativa förändringen i partikelavstånd genom att jämföra varje partikelavstånd med avståndet i den första bilden med hjälp av: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ05.jpg">.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-field+optical+nanoscopy.">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Transmission Electron Microscope. , (2009).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology.">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li><li>Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+cells:+connecting+structure+and+function.">Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).</li><li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture/freeze-etch+in+biological+electron+microscopy.">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).</li><li>Dahmke, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+Liquid+Enclosure+for+Single-Molecule+Analysis+of+Membrane+Proteins+in+Whole+Cells+Using+Electron+Microscopy.">Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).</li><li>Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno+EM-OM+correlative+microscopy+in+solution+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy+(ASEM).">Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM).</a> Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).</li><li>Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy+to+study+in+situ+nanocrystal+etching.">Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Graphene+and+Its+Derivatives+for+Liquid-Phase+Transmission+Electron+Microscopy+of+Radiation-Sensitive+Specimens.">The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens.</a> Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-Based+Fibers:+A+Review.">Graphene-Based Fibers: A Review.</a> Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).</li><li>Sun, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+on+gas+impermeability+of+graphene.">Limits on gas impermeability of graphene.</a> Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).</li><li>Kato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+thickness+control+of+ice+layer+on+CVD+grown+bilayer+graphene+for+cryo-TEM.">High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM.</a> Carbon. 160, 107-112 (2020).</li><li>Keskin, S., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Radiation+Damage+in+Transmission+Electron+Microscopy+of+Proteins+in+Graphene+Liquid+Cells.">Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells.</a> Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2, 743-749 (2005).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).</li><li>Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+HER2+receptor+binding+by+an+engineered+protein.">Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).</li><li>Textor, M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Preparing+Graphene+Liquid+Cells+for+Transmission+Electron+Microscopy.">Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy.</a> Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).</li><li>Henjes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+EGFR+signaling+in+cell+line+models+of+ERBB2-amplified+breast+cancer+attenuates+response+towards+ERBB2-targeting+drugs.">Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs.</a> Oncogenesis. 1, 16 (2012).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Stoichiometry+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Intact+Cells+using+Correlative+Microscopy.">Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).</li><li>Kohl, H., Reimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transmission electron microscopy: physics of image formation. , (2008).</li><li>Yi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+immunogold+labeling+of+cell+surface+proteins+and+viral+glycoproteins+for+cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applications.">Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).</li><li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells.">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li><li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3+nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy.">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).</li><li>Meier, C., Beckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+fracture:+new+avenues+for+the+ultrastructural+analysis+of+cells+in+vitro.">Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+scanning+transmission+electron+microscopy:+imaging+protein+complexes+in+their+native+environment+in+whole+eukaryotic+cells.">Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).</li><li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+radiation+damage+in+the+TEM.">Control of radiation damage in the TEM.</a> Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).</li><li>Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-enabled+electron+microscopy+and+correlated+super-resolution+microscopy+of+wet+cells.">Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells.</a> Nature Communications. 6, 7384 (2015).</li><li>Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+mobility+and+associated+reshuffling+of+cytoplasm+during+chemical+fixation.">Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).</li><li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Electron+Microscopy+Using+Graphene+Veils.">Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , (1995).</li><li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

För att bättre förstå proteinfunktion är det viktigt att få information om proteinplatser i plasmamembranet hos intakta celler. Metoder för att få denna information inkluderar super-upplösning fluorescens mikroskopi1,2. Även om super-upplösning mikroskopi har vidareutvecklats under de senaste åren, är dess upplösning fortfarande begränsad till ca 20 nm för praktiska förhållanden av cellexperiment, medan typiska receptorproteiner har storlekar i intervallet 1-10 nm. Avbildning av proteiner på encellig och enkelmolekylnivå med tillräcklig upplösning för att visualisera proteiner är möjlig med EM. Men på grund av snittning lämnar konventionella EM-metoder vanligtvis inte cellen intakt26, vilket leder till förlust av viktig information om sammanhanget och den rumsliga fördelningen av proteiner i plasmamembranet. Metoder för hela celler med kryo-TEM har utvecklats6, det är genomförbart att kombinera proteinmärkning med kryo-EM27, även kryo-STEM har påvisats28. Kryo-EM-arbetsflöden är dock optimerade för att studera den cellulära ultrastrukturen och proteinstrukturen, och inte så mycket för att analysera membranprotein spatiala fördelningar. Kritisk punkt torkning är en annan hel cell beredningsmetod men proverna utsätts för flera torkning steg, och tekniken är mycket tidskrävande29. Membranproteiner har också undersökts via frysfraktur7. I denna metod är celler fasta, frysta och brutna. De splittrade delarna replikeras av kol- och platinaskikt, och det biologiska provet avlägsnas. Replikerna kan sedan analyseras med EM30. Hel cellanalys är omöjlig med frysfraktion eftersom information om proteiners fördelning i membranet inom ramen för hela cellen går förlorad.
Den metod som presenteras här gör att cellmembranet kan studeras utan att behöva tunnskiva preparatet9,31. Cellerna hålls intakta så att lokaliseringen av membranproteinerna syns från fluorescensbilderna, som korreleras med EM-bilderna. Att studera proteiner på singelcells- och singelmolekylnivå inom intakta celler i hydratiskt tillstånd har visat sig vara möjligt med en upplösning på 2 nm med hjälp av STEM av QD-märkta proteiner med hjälp av denna grafenkapsmetod9. Att hålla celler i sitt hemland är avgörande, eftersom det bevarar den rumsliga fördelningen av membranproteiner så att analyser är möjliga på encells- och enmolekylnivå, vilket är viktigt för att förstå proteinfunktioner, och utveckla nya läkemedel för terapimetoder.
En annan kritisk aspekt av bildbehandling biologiska prover med EM är strålningsskador av proverna som orsakas av elektronstrålen. Lösningarna innefattar ofta reduktion av elektrondosen så mycket som möjligt eller olika beläggningsmetoder, som att kapsla in exemplaret mellan tunnalager av kol 32. Vår metod visar att grafenbeläggning minskar strålinducerade artefakter som dyker upp på cellytan för icke-belagda prover. Undersökning av de kemiskt fasta, och grafenbelagda biologiska proverna är möjlig under elektronstrålebestrålning vid 200 keV-strålenergi upp till D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2 utan strålningsskador, såsom ljuspunkter, som syns på provet. Jämfört med andra EM-metoder som involverar utarbeta provberedning, till exempel färgning, inbäddning, (kryo-) snittning, spräckning, etc., är den metod som beskrivs här mindre tidskrävande. Märkning av proteinerna utförs inom några timmar, och grafenbeläggning kräver endast ca 15 min för utbildade forskare. Provberedningen är jämförbar med de förfaranden som behövs för fluorescensmikroskopi.
Protokollet kan ändras i vissa steg. Grafenet på mikrochipet kan också lufttorkas för att se till att grafen inte rör sig när det blottas med ett filterpapper. Om grafenet är förorenat med salt, är det möjligt att låta det flyta på vattenytan i ungefär en timme för att lösa upp saltet och därmed minimera föroreningen. Förekommande förorening av koppar eller PMMA på grafen kan minskas genom att motsvarande etsningssteg i protokollet utökas. Andra grafenbeläggningsmetoder har beskrivits där till exempel grafen-PMMA sattes direkt på celler, och PMMA avlägsnades genom tvättning i aceton efteråt33. I vår metod, PMMA togs bort före beläggning för att undvika eventuella skador på cellerna som orsakas av ytterligare aceton tvättsteg. NaCl valdes som ett substrat här eftersom det är platt, så det inte skrynkla grafen, och det löser sig i vatten för att frigöra grafen9. Förutom, det kan skäras i önskad storlek och inga substratrester är kvar på grafen. Men med dessa kriterier i beaktande, andra substrat som kaliumklorid kan möjligen användas också.
För att minska risken för potentiell etikettinducerad klustring kan GA-fixeringssteget implementeras direkt efter FA-fixering, varefter alla membranproteiner immobiliseras. Den första fixering steg med FA redan fixar den biologiska strukturen men en reducerad nivå av membran protein diffusion kan fortfarandeuppstå 34, eventuellt leder till etikett inducerad klustring på grund av förekomsten av flera Streptavidin per QD. Fixering med GA kan leda till en autofluorescenssignal under LM, och görs därför efter LM i det beskrivna protokollet men kan reduceras enligt beskrivningen på andraställen 34. Cacodylat buffert är ganska giftigt, och andra fixativ kan användas också, men cacodylat används här som det är en vanligt förekommande buffert för EM-protokoll, undviker fällningar, förhindrar tillväxten av bakteriell och svampar, och är kompatibel med kalciumjoner som behövs för att bevara den ultrastrukturella integriteten hos lipidmembran35. Om det behövs kan osmiumtetroxid användas som ytterligare fixering för stabilisering av lipiderna. Detta skulle bidra till att öka kontrasten av cellstrukturen, men också lägga till en annan metall till systemet och minska kontrasten som erhållits på QDs.
Protokollet som beskrivs här innehåller många steg som kräver bra instruktioner. Viss utbildning krävs innan man hanterar mikrochips för att undvika att mikrochipsens SiN-yta repas och för att förhindra brott. Som tidigare nämnts rekommenderas att man förbereder mikrochips i dubbletter då SiN-fönstret kan gå sönder då och då. Att få det erforderliga antalet celler på ett mikrochip kräver också viss erfarenhet. Beläggning cellerna med grafen behöver lite träning eftersom det kan vara svårt att hitta rätt lutningsvinkel för att flyta grafen på vatten. När man fångar grafen från vatten kan det också vara svårt att se den tunna grafen. Så snart grafen är på mikrochip, överskott vatten måste blottas bort med ett filterpapper. Detta bör endast göras med spetsen på ett filterpapper sådant för att undvika att ta bort grafen från mikrochipet.
Grafenbeläggning hindrade artefakter från att visas på provet. Men för D < 4 x 102 e-/Å2 också inga artefakter uppstod för icke-belagda provet, och artefakter dök upp för 2 icke-belagd prover bara. Således verkar undersökningar av icke-belagda celler också möjligt, även om det skulle vara bättre att använda grafen och undvika risken för artefaktbildning. Sammansättningen av dessa artefakter kan analyseras i framtiden för att ge tips om hur man kan förhindra deras bildning. Angående den strukturella stabiliteten i cellerna endast en mindre förbättring av grafenbeläggningen observerades. De fasta cellerna var tydligen stabiliseras i de undersökta tunna områden, där deras struktur var i närheten av SiN membranet. Vad vi inte undersöka här, var dock torkning artefakter som är kända för att uppstå för cellulära prover när de utsätts för vakuum4. Uttorkning av cellerna skulle bly- till krympning av cellerna så att QDEN distanserar också skulle ändring som en följd. För den här använda elektrondosen förblev avståndet för QDs av grafenbelagda och icke-belagda prover stabilt. Ytterligare studier behövs för att undersöka effekten av grafenbeläggning på cellerna för EM.
En begränsning av denna metod är att cellernas kemiska fixering är nödvändig; därför kan inga experiment med levande celler utföras. Men i fall märkningen inte behövs och celler med en högre strukturell stabilitet används, till exempel bakterier, då ofixerade celler kan inneslutas i grafen för EM36 om än med en annan elektrondos tolerans. Dessutom är proteinerna inte direkt detekterbara, så QDs behövs för att visualisera proteinerna. Metoden skulle gynnas av mindre etiketter. En diskussionspunkt är om det är bra eller dåligt att ultrastrukturen inte syns tydligt. Vår metod liknar den för fluorescensmikroskopi där endast utvalda proteiner är synliga37. Öka synligheten av ultrastrukturen skulle också lägga till mycket mer information till bilden, och sedan någon gång förhindra upptäckt av de enskilda etikettpositionerna. Vidare är den metod som beskrivs här för en proteinart, och tillägg av protokollet behövs för att kunna märka flera proteiner. Sist fungerar metoden när en liten hög affinitet specifikt bindande molekyl som antikroppmimimiskt21 eller nanokropp38 är tillgänglig. Vanligt förekommande antikroppar är mycket större och skulle förhindra detektering av det funktionella tillståndet hos proteinets underenheter till oligomerer.
Vår metod är användbar för att studera proteinfunktion på hela celler med hjälp av EM samtidigt som cellerna förvaras i hydratiskt tillstånd. Det är lätt möjligt att undersöka serier av celler. Annan typ av celler och proteiner kan studeras också. Om proteinmärkning inte behövs kan en delmängd av protokollet användas för grafenbeläggning av vitt växling av biologiska exemplar. Förmågan att studera hela celler är relevant i cellulär forskning för att förstå korrelationer av membranproteinfunktion på molekylär nivå.

Analys av membranproteinfunktion är avgörande för cellbiologisk forskning, och för läkemedelsutveckling. En klass av viktiga experiment innebär undersökning av membranproteinpositioner i celler. Denna information kan användas för att utläsa slutsatser om montering av proteiner i proteinkomplex och deras specifika platser i plasmamembranet, som via dynamisk montering och demontering driver en mängd olika cellulära funktioner. Bland andra tekniker används ljusmikroskopi (LM) och elektronmikroskopi (EM) för att studera proteinfunktioner i celler. LM tillåter analys av hela celler i vätska; dock är upplösningen begränsad till 200-300 nm för konventionella och upp till 20 nm för super upplösning fluorescensmikroskopi under praktiska förhållanden1,2. EM tillhandahåller runt 1 Å-upplösningar3, men konventionell provberedning kräver uttorkning, metallfärgning för att förstärka bildkontrasten och inbäddning i ett monteringsämne, såsom harts, för transmissionselektronmikroskopi (TEM)4. För att bevara biologiska prover i en mer infödd-liknande miljö, kan cryo-EM-tekniker användas5,6. Proverna fryses snabbt in i amorf is, och om det behövs, sektionerade. Ett annat alternativ är frys-sprickbildning EM7.
EM tekniker för att studera membranproteiner inom intakta celler i deras infödda, flytande tillstånd har uppstått under det senaste decenniet8,9,10,11. En rumslig upplösning på 2 nm uppnåddes på kvantprick (QD) märkta membranproteiner i hela celler som odlas på ett SiN-membran och omsluts av ett lager av grafen9.
Här beskrivs detaljer om ett protokoll för proteinmärkning ochgrafenbeläggning 9,12. Målet med detta protokoll är att analysera den rumsliga fördelningen av HER2 i membranet av hela, fasta celler, samtidigt som cellerna bevaras i ett hydratiskt tillstånd. Beläggning med grafen förhindrar torkning av cellerna i vakuum, och minskar även strålningsskador13. Denna metod ger information om märkta membranproteiner inom det intakta plasmamembranet, men metoden är inte användbar för att studera den cellulära ultrastrukturen som vanligtvis görs med EM.
Grafen är den tunnaste nanomaterial kända, och består av en enda kolatom tjock kristallin ark arrangerade i en bikakestruktur gitter14. Den har unika egenskaper inklusive hög flexibilitet och mekanisk hållfasthet. Ny forskning har visat att defektfri grafen är ogenomtränglig för gaser och vätskor, men defekter tillåter vätepermeation15. Detta läckage kan minskas genom att använda flerskiktsgrafen som används här. Bilayer grafen har nyligen visat sig vara användbart som ett stöd för cryo-EM prover, förbättra homogeniteten i det tunna isskiktet jämfört med grafenoxid där endast nonuniform lager kan bildas16. Grafen visades också minska strålskador av biologiska prover under flytande-fas överföring elektronmikroskopi13,17. Som ett exemplariskt experiment, HER2 uttryckt i däggdjur bröstcancer cellinje SKBR3 var märkt med QDs18 och dess rumsliga fördelning registreras med hjälp av STEM. Celler var sådd på en Si mikrochip med en elektron transparent SiN membran19. Mikrochipsen valdes som ett stöd eftersom de är robusta, kompatibla med LM och EM, och hela märkningsproceduren kan utföras direkt påmikrochipset 19. Efter cellbilaga, her2 var märkt med en tvåstegsmärkning protokoll20. Först var en biotinylerade anti-HER2 antikropp mimeticförening 21 bifogas HER2. Cellerna var sedan kemiskt fast för att förhindra etikett-inducerad receptor klustring, och för att öka stabiliteten i den cellulära ultrastructure. Streptavidin-belagda QDs var därefter kopplade till HER2-antikropp mimetic komplex. Den ljusa fluorescenssignalen och den elektrontäta kärnan i QDs tillät korreringsfluorescens- och elektronmikroskopi (CLEM)20. CLEM är särskilt användbart eftersom cellulära regioner av intresse för STEM-analys kan väljas från översikten fluorescens mikroskopi bilder som belyser lokaliseringen av HER2 på cellerna. Celler analyserades av fluorescens mikroskopi att identifiera cellulära regioner med höga HER2 nivåer. Därefter överfördes en 3-5 skikt tjockt ark grafen på cellerna för beläggning9,22. Därefter monterades provet i en EM-preparathållare. STEM-data förvärvades med hjälp av den ringformiga mörka fältet (ADF) detektor, som ger information om den rumsliga fördelningen av HER2 på cellytan i förhållande till cellens yta plats, men ger ingen information om ultrastruktur av cellen. För att bestämma provets stabilitet under bestrålning av elektronstråle undersöktes proverna vid ökande dos (D) i en bildserie. Skillnaden mellan grafenbelagda och icke-belagda prover undersöktes. Flera sorter av utstrålningsskada utvärderades.
Det protokoll som beskrivs här använder HER2 överuttryckande bröstcancer cellinje SKBR3 som en modell system för inriktning HER223. Protokollet omfattar beredning av ett grafenöverdragna prov, och ett liknande prov men utan grafenbeläggning för jämförelse. Experimentet är förberett i två exemplar eftersom SiN-fönstret kan brytas en gång varje stund, och för att få en experimentell dubblett i de flesta fall. Metodens totala utbyte är hög betydelse för att mikrochips med grafentäckta celler vanligtvis erhålls med ett exceptionellt fel trots att inte hela SiN-fönstret får täckas med grafen i samtliga fall. Dubbletter beskrivs inte i protokollet.
Märkningsprotokollet (steg 1-5) är jämförbart med protokollet för märkningen av den epidermala tillväxtfaktorreceptorn i COS7 fibroblastceller som publiceratstidigare 24; detaljer i att papper hänvisas till avseende hantering av mikrochips, och användningen av brunnsplåtarna. Följande protokoll är optimerat för märkning av HER2,grafenbeläggning 9, och undersökning av provets strålningstolerans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone for HPLC (min. 99.8 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2626-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL54 analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany</td>
			<td>30029077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free, &#8805; 98 %, for molecular biology</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 &#181;M</td>
			<td>Affibody, Solna, Sweden</td>
			<td>10.0817.02.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F</td>
			<td>JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylic acid sodium salt trihydrate &#8805; 98 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5169.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>627861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>5401000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 ml sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>9286.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>PK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>4430000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2222-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>F8141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Leica DMI6000</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>10099141</td>
			<td>lot number: 1751893</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Goat Serum, New Zealand origin</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>lot number: 1788320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy 48R CO2 Incubator</td>
			<td>New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>CO48310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan Model 950 Solarus&#151; Plasma Cleaner</td>
			<td>Gatan GmbH, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine &#8805; 98.5 % Ph.Eur., USP, BP</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Heidolph Instruments GmbH &#38; CO. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>MR 3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0557-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSc-Advantage&#151; Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocean Microchips SiN window 400x150 &#181;m, 200 nm spacer</td>
			<td>DENSsolutions, Delft, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>10 mL: C542.1 20 ml: T550.1</td>
			<td>purchased via Carl Roth GmbH&#38;Co. KG, Karlsruhe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>VO 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td>#291-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfekt-Kescher with handle</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2-200&#181;l: 7695892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>0.1-10 &#181;l: 7695880 2-100 &#181;l: 7695883 100-1000 &#181;l: 7695886 1250 &#181;l XL: 7695887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 &#181;M</td>
			<td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased</td>
			<td>Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA</td>
			<td>94-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell, Dassel, Germany</td>
			<td>300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo Microscope Leica M60</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath SW22</td>
			<td>Julabo GmbH, Seelbach, Germany</td>
			<td>9550322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>HN00.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm</td>
			<td>International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA</td>
			<td>9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, &#8805; 99.5 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium persulfate</td>
			<td>carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>4365.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 &#181;m</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P668.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm</td>
			<td>ACS material, Pasadena, CA, USA</td>
			<td>TTG30011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Dumoxel 03</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0103-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Inox 02</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0102-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, plastic replaceable tip</td>
			<td>Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland</td>
			<td>5SVR.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water ROTISOLV HPLC gradient grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>A511.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy

Ett protokoll beskrivs för undersökning av den humana epidermala tillväxtfaktorreceptorn 2 (HER2) i det intakta plasmamembranet hos bröstcancerceller med hjälp av svepningstransmissionselektronmikroskopi (STEM). Celler av bröstcancer cellinje SKBR3 odlades på kisel mikrochips med kiselnitrid (SiN) fönster. Celler var kemiskt fast, och HER2 proteiner var märkta med quantum dot nanopartiklar (QDs), med hjälp av en två-stegs biotin-streptavidin bindande protokoll. Cellerna var belagda med flerskiktsgrafen för att upprätthålla ett hydratiskt tillstånd, och för att skydda dem från elektronstråleskador under STEM. För att undersöka stabiliteten hos proverna under elektronstråle bestrålning, utfördes en dos serie experiment. Grafenbelagda och icke-belagda prover jämfördes. Beam inducerad skada, i form av ljusa artefakter, dök upp för vissa icke-belagda prover vid ökad elektrondos D, medan inga artefakter dök upp på belagda prover.

Bild 1A visar celler som är seedade på ett sådant sätt att fönstret är täckt men med tillräckligt utrymme för att de ska kunna platta ut och hålla sig, vilket leder till konfluency på ca 2/3rd (Figur 1B). I fall alltför många celler är seedade på ett mikrochip (Figur 1C), det finns otillräckligt utrymme för alla celler att hålla sig till mikrochip. Bild 1D visar samma mikrochip efter 24 h. Mer än hälften av cellerna planade inte ut. Om man däremot sådd för få celler (bild 1E) kommer SiN-fönstret att sluta med ett stort tomt utrymme efter 24 h som man ser i figur 1F. Bild 1G visar DIC-bilden av cellerna i figur 1A och bild 1B. Bild 1H visar motsvarande fluorescensbild falsk färgad i gult som indikerar lyckad märkning av HER2.
Representativa STEM-uppgifter visas i figur 4. Grafen-belagda (vänster kolumn) och icke-belagd (höger kolumn) SKBR3 celler undersöktes. Bild 4A,B visa M = 800x översiktsbilder av cellerna på fönstret. De områden som visas som insets avbildades vid M = 80 000x under dosserien, se figur 4C,D. QDs är synliga som ljusa fläckar här. Bild 4E och bild 4F visar M = 50 000x förstorade bilder som förvärvats på rektanglarnas platser i figur 4C,D. Båda bilderna spelades in efter förvärvet av en dosserie med D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Dosserien spelades in vid M = 80 000x. De exponerade områdena kan kännas igen som rektanglar, varvid rektangeln var tydligt synlig för det icke-belagda provet (Figur 4F).
För att verifiera förekomsten av grafen, diffraktion mönster av områden utan celler, men med eller utan grafen på SiN fönstret förvärvades. Grafenets sexkantiga struktur observerades i diffraktionsmönstret för det grafenbelagda provet (Figur 4G), medan det uteblev för det icke-överdragna provet (Figur 4H). Diffraktionsmönstret av enkristall grafen kommer att ha sexfaldig symmetri på grund av mycket ordnad sexkantig struktur av grafen. Så indikerar den sexkantiga strukturen närvaron av grafen på proverna.
För att undersöka effekten av elektronstrålebelysning på provet förvärvades STEM-bilder i en bildserie med en ackumulerande elektrondos. Representativa resultat för icke-belagda och grafenbelagda prover visas i figur 5A-D respektive figur 5E-G. Alla data förvärvades vid kanten av cellen, där cellen är den planaste, och den observerade strukturen är alltså den närmast SiN-membranet. Exponeringen av ett icke-belagda prover ledde till att ljusa strukturer uppträdde på cellytorna vid D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (Figur 5B). Dessa strukturer blev större med högre doser, så de var tydligt synliga i den sista bilden av serien vid D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2 (Figur 5C,D). Dessa fläckar visade sig inte på något av de grafenbelagda proverna (Figur 5E-G).
Ytterligare mikrochips utarbetades och undersöktes med hjälp av protokollet som beskrivs i ovanstående. Sex belagda och sju icke-belagda prover undersöktes totalt. Två av sju icke-belagda prover visade dessa artefakter. Inget av de belagda proverna visade några ytterligare ljuspunkter.
Som ytterligare ett mått på strålningsskador undersöktes avståndet mellan QDs. Om strukturella skador skulle uppstå, skulle man förvänta sig avstånd mellan QDs att förändras. Förändringar i avstånd mättes för olika par QDs med ackumulera D för en rad paravstånd. Av figur 5H framgår att den relativa förändringen av partiklarna för icke-belagda prover stannade under 1,3 % i genomsnitt, medan det genomsnittliga relativa avståndet låg kvar under 0,8 % för de belagda proverna. Man kan därför dra slutsatsen att grafenbeläggningen stabiliserade provet, men de intorkade proverna utan grafenbeläggning var också anmärkningsvärt stabil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> Figur 1: Cellsådd på ett SiN-fönster på ett kiselmikrochip och HER2 märkt. (A) Exemplarisk bild av en SiN fönster region med SKBR3 celler 5 min efter seedning på mikrochip. (B) Samma celler sprids på samma SiN fönster efter 24 h. (C) SKBR3 celler på en Si mikrochip 5 min efter seedning. (D) Samma celler som i (C) efter 24 h. Celler inte platta ordentligt eftersom det fanns för många celler på chips på sådd. (E) Celler på ett mikrochip 5 min efter sådd. (F) Endast få celler var synliga på fönstret eftersom för få celler var seedade på mikrochipet. (G) DIC-bild av samma SKBR3-celler efter QD-märkning av HER2. (H) Överlagra bild av DIC och motsvarande fluorescens bild av märkta SKBR3 celler med HER2-QD655 (falsk färgad i gult). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> Bild 2: Rengöring och överföring av grafen på NaCl-kristaller. (A) PMMA-grafen-på-polymer är nedsänkt i rent vatten för att frigöra PMMA grafen. PMMA-grafen kan fångas med en glasglas. (B) Kopparbaserade kontaminationer etsades med hjälp av natriumpersulfatlösning. För att rengöra grafen, överfördes den till en bägare som innehåller avjoniserat vatten. Dessa steg upprepades 3 gånger. PMMA-grafen överfördes sedan till mättad lösning av NaCl i rent vatten. En NaCl kristall användes för att plocka upp grafen från saltlösningen. (C) PMMA-grafen på NaCl kristallen var torkas ut i 30 min vid rumstemperatur. PMMA togs bort genom att inkubera blocket i aceton i 30 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> Figur 3: Grafenbeläggning av celler som är seedade på ett Si-mikrochip. (A) Förfarande av grafen beläggning. Grafen på NaCl kristall släpps ut på vattenytan. Grafenbiten fångas sedan med en metallslinga och överförs till Si-mikrochipet. (B) Microchip (2,0 x 2,6 mm) med ett SiN-fönster med måtten 400 x 160 μm utan grafen. SKBR3 celler var synliga som mörka fläckar. (C) Grafen (röd cirkel) som flyter på ytan av en bägare fylld med vatten. (D) Grafen fångad med en metallslinga. (E) Mikrochipet fäst vid vattendroppen så att grafenet var ovanpå SiN-fönstret. (F) Microchip efter grafenbeläggning. Grafenet var synligt som ett lila skimmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> Figur 4: STEM av grafenbelagda och icke-belagda SKBR3-celler på SiN-fönster. (A) STEM-bild av ett grafenöverdragna prov som förvärvats vid en M = 800x. (B) STEM-bild av ett icke-överdragat prov som förvärvats vid M = 800x. (C) M = 80,000x bild som registrerats på den blå rektangelns placering i A. Gula linjer representerar exempel avstånd som uppmätts inom partikel. (D) M = 80,000x bild som spelats in på positionen för den blå rektangeln i B. Gul linje representerar exempel avstånd som uppmätts inom partiklar. (E) M = 50,000x bild av samma region som C utsätts för D = (7,8 ±0,4) x 103 e-/Å2. (F) M = 50,000x bild av samma region som D och utsätts för D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. Det utsatta området sågs tydligt. (G) Diffraktionsmönster av ett grafenöverdragna prov från ett område utan celler. Grafenens sexfaldiga symmetri syns som ljusa fläckar. (H) Diffraktionsmönster av ett prov utan grafen som inte visar några 6-faldiga ljuspunkter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> Bild 5: Artefakter som uppstår på prover utan grafenbeläggning. (A) Första bilder av regioner på prover utan grafenbeläggning som förvärvats vid M = 80,000x, och utsatt för D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2. (B) Bilder med de första artefakterna som uppstår vid D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (gula pilar). (C, D) Sista bilden av serien som förvärvats med D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Artefakter var synliga som ljuspunkter. (E-G) Grafenbelagda prover utan att uppstå artefakter. (E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. (H) Relativ förändring av partikelavstånd för grafenbelagda och icke-belagda prover. Två av de icke-belagda prover som visar artefakter, varav en visas i (A-C), och den sista bilden av det andra provet i D, samt tre belagda prover analyserades (en visas i E-G). Totalt undersöktes tio QD-par per prov med avstånd som sträcker sig mellan 250 nm och 3 μm. Den relativa förändringen återspeglar medelvärdet av alla mätningar i en grupp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Tilläggstabell 1: Recept på lösningar och buffertar. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy at JoVE.com

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

Presenteras här är ett protokoll för märkning av membranproteiner i däggdjursceller och beläggning provet med grafen för flytande-fas scanning transmission elektronmikroskopi. Proverna stabilitet mot de skador som strålningen orsakar kan också studeras med detta protokoll.

Grafen Enclosure av kemiskt fasta däggdjursceller för flytande-faselektronmikroskopi

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Denna metod håller biologiska prover i en inhemsk miljö och minskar elektronstråle inducerad artefakt. Den största fördelen är att denna teknik är tillämplig på hela celler. Så celler behöver inte vara uttorkad, färgade, eller sektionerade innan elektronmikroskopi.Förmågan att avbilda receptorer på cancerceller i samband med hela det intakta plasmamembranet är en viktig aspekt som kan leda till nya terapiansatser och utveckling av nya läkemedel mot cancer. Jag kommer att visa arbetet med celler, grafen-beläggning, och mikroskopi, och Sercan Keskin kommer att visa hur man förbereder grafen. Till att börja med, tillsätt 100 mikroliter cell suspension till två brunnar av en 96 brunnsplatta som innehåller PLL och FLP belagda mikrochips med kisel nitrid membran vänd uppåt och 50 mikroliter av serum-fri medium.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i fem minuter så att cellerna kan fästas på mikrochipet. Kontrollera cellernas densitet på mikrochipet med ett inverterat mikroskop och se till att cellerna täcker fönstret med tillräckligt utrymme för att platta ut och hålla. För att märka HER2 i cellerna placerar du mikrochipsen i brunnarna i den första raden på märkningsplattan.Sedan tvätta mikrochips med PBS BSA. För att förhindra ospecifik bindning av antikroppen mimetiska, inkubera mikrochipsen med PBS BSA GS i fem minuter. Sedan med 200 nanomolar antikropp mimetiska i 10 minuter vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid.För att ta bort PMMA-grafen från polymeren, pipettera några droppar vatten på polymeren runt PMMA grafen. Sänk sedan ner den i vatten med en vinkel på 30 till 45 grader för att frigöra PMMA-grafen. För att etsa kopparbaserade föroreningar, prepair en 50 milliliter lösning av 0,42 molar natrium persulfate i vatten.Använd en vanlig glasrutschbana för att överföra PMMA-grafen till natriumpersulfatlösningen med grafensidan nedåt. PMMA grafen kommer att flyta till toppen av lösningen. Lämna den där över natten.Nästa dag överför du PMMA-grafen från natriumpersulfatlösningen till rent vatten. Låt den flyta i vattnet i en halvtimme. Upprepa tvätten totalt tre gånger för att avlägsna alla natriumpersulfatrester från PMMA-grafen.Sedan överför PMMA grafen på en natriumklorid kristall. Bered en mättad lösning av natriumklorid i vatten i en Petri-skål och överför PMMA-grafen ovanpå lösningen med grafensidan nedåt. Håll natriumkloridkristallen med pincett och plocka upp den flytande PMMA grafen.Håll den sedan vertikalt i två minuter för att låta överflödigt vatten rinna ut. Låt det torka till rumstemperatur i 30 minuter och grädda den i en ugn på 100 grader Celsius i 20 minuter. Ta bort vattnet helt.Förvärm aceton i en glasgjätt till cirka 50 grader Celsius på en värmeplatta i rökhuven. Titta noga på temperaturen för att undvika brand. Sänk ner PMMA-grafen på salt i petriskålen fylld med aceton och låt den lösa upp PMMA i 30 minuter.Låt grafen på salt lufttorka ordentligt innan du använder den för provberedning. Tvätta en beredd och märkt mikrochip i rent vatten för att ta bort eventuella rester av salt från bufferten och placera den på filterpapper. Cellerna ska synas som mörka fläckar.Använd ett rakblad för att skära flerskiktsgrafen på natriumkloridkristallen i en bit som passar kiselnitridfönstret på ett mikrochip. Ta bort grafen från natriumkloridkristallen genom att doppa den i en glasbägare med vatten, luta kristallen i 45 graders vinkel med avseende på ytan. Fånga grafenet med en metallslinga från vattenytan och rör sedan vid mikrochipsens övre yta med den nedre slingans yta, vilket gör att mikrochipet fastnar på metallslingan.Grafenet kan ses ovanpå mikrochipet. Använd under ett stereomikroskop filterpapper för att ta bort det återstående vattnet från mikrochipet så att grafenet täcker alla celler på kiselnitridfönstret. Placera mikrochipet på ett filterpapper med pincett.Grafenet syns som ett lila skimmer på mikrochipet. Överför mikrochipet från papperet till ett fack Petriskål. Pipa en vattendropp i ett av de fria facken och stäng locket för att ge en vattenmättad atmosfär.Sedan försegla kupéfatet med paraffinfilm och förvara den i kylen i fyra grader Celsius. Ställ in STEM till 200 kilovoltsstråleenergi med hjälp av ett inriktningsprov för en sondstorlek på minst 0,2 nanometer genom att justera kondensorlinserna. Ställ in en sondström på 180 Picoampere och en balkkonvergensssemi vinkel på 13,2 milliradianer genom att sätta in en bländare.Ställ in ADF STEM-detektorn som öppnar semivinkelintervall till 68 till 280 milliradianer genom att justera inställningarna för projektorlinsen. Ställ sedan in STEM-bildstorleken till 2048 med 2048 pixlar och pixeln uppehåller sig till sex mikrosekonden. Ladda mikrochipet med grafenbelagda celler i en standardprovkroppshållare för tem på ett sådant sätt att cellerna är vända uppåt och lasta hållaren i elektronmikroskopet.Skaffa en översiktsbild vid 800 X förstoring. Identifiera sedan en region av intresse och bild av kvantpunktnanopartiklarna vid 80 000 X med en pixelstorlek på 1,3 nanometer. Här visas optimalt seedade celler.Fönstret är täckt, men det finns tillräckligt med utrymme för att tillåta dem att platta ut och följa. När alltför många celler såddes på ett mikrochip, det fanns otillräckligt utrymme för alla celler att följa. Efter 24 timmar plattade mer än hälften av cellerna inte till.Om för få celler är seedade, kisel nitrid fönstret kommer att sluta med ett stort tomt utrymme efter 24 timmar. DIC och fluorescens bilder av optimalt seedade celler visas här, visar framgångsrik märkning av HER2. STEM utfördes på grafen-belagda och icke-belagd SKBR3 celler.Inuppsättningarna i 800 X-förstoringsbilderna avbildades vid 80, 000 X.The kvantpunkt nanopartiklar är synliga som ljusa fläckar vid 50, 000 X förstoring. För att undersöka effekten av elektronstrålebelysning på provet förvärvades STEM-bilder i en bildserie med en ackumulerande elektrondos. Representativa resultat för icke-belagda och grafenbelagda prover visas här.Exponeringen av icke-belagda prover ledde till att ljusa strukturer uppträdde på cellytorna, som inte företräddes med något av de grafenbelagda proverna. Den genomsnittliga relativa avståndsförändringen av partikelpar stannade under 1,3 %för icke-belagda prover och under 0,8 %för de belagda proverna. Efter detta förfarande kan olika sorters membranproteiner avbildas på hela celler med hjälp av andra mikroskopimetoder.Denna teknik gör det möjligt att avbilda proteiner i det intakta plasmamembranet för att få mer information om hur plasmamembranet är uppsnul och växelverkan mellan proteiner.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Långsiktiga Imaging däggdjursceller med Wide-området mikroskopi

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Mätning av hemsyntesen nivåer i däggdjursceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Högtrycks Frysning och Quick Freeze Substitution av växtvävnad för transmissionselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniatyriserade provberedning för transmissionselektronmikroskopi

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Flerfärgade lokalisering mikroskopi av enda membranproteiner i organeller av levande däggdjursceller

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

CryoAPEX-metoden för elektronmikroskopi analys av membranproteinlokalisering inom ultrastrukturellt bevarade celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...