Name: graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy at JoVE.com

Hücre kültürü protokolüne yardım ettiği için D. B. Peckys'e, f. Weinberg'e el yazmasını gözden geçirdiği için, T. Trampert'a deneylerve rakamlarla ilgili yardımları için, S. Smolka'ya rakamlarla yardım ları için ve E. Arzt'a INM aracılığıyla verdiği destek için teşekkür ederiz. Bu araştırma Else Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından finanse edilmektedir.

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-field+optical+nanoscopy.">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Transmission Electron Microscope. , (2009).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology.">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li><li>Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+cells:+connecting+structure+and+function.">Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).</li><li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture/freeze-etch+in+biological+electron+microscopy.">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).</li><li>Dahmke, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+Liquid+Enclosure+for+Single-Molecule+Analysis+of+Membrane+Proteins+in+Whole+Cells+Using+Electron+Microscopy.">Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).</li><li>Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno+EM-OM+correlative+microscopy+in+solution+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy+(ASEM).">Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM).</a> Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).</li><li>Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy+to+study+in+situ+nanocrystal+etching.">Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Graphene+and+Its+Derivatives+for+Liquid-Phase+Transmission+Electron+Microscopy+of+Radiation-Sensitive+Specimens.">The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens.</a> Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-Based+Fibers:+A+Review.">Graphene-Based Fibers: A Review.</a> Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).</li><li>Sun, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+on+gas+impermeability+of+graphene.">Limits on gas impermeability of graphene.</a> Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).</li><li>Kato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+thickness+control+of+ice+layer+on+CVD+grown+bilayer+graphene+for+cryo-TEM.">High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM.</a> Carbon. 160, 107-112 (2020).</li><li>Keskin, S., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Radiation+Damage+in+Transmission+Electron+Microscopy+of+Proteins+in+Graphene+Liquid+Cells.">Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells.</a> Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2, 743-749 (2005).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).</li><li>Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+HER2+receptor+binding+by+an+engineered+protein.">Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).</li><li>Textor, M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Preparing+Graphene+Liquid+Cells+for+Transmission+Electron+Microscopy.">Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy.</a> Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).</li><li>Henjes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+EGFR+signaling+in+cell+line+models+of+ERBB2-amplified+breast+cancer+attenuates+response+towards+ERBB2-targeting+drugs.">Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs.</a> Oncogenesis. 1, 16 (2012).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Stoichiometry+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Intact+Cells+using+Correlative+Microscopy.">Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).</li><li>Kohl, H., Reimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transmission electron microscopy: physics of image formation. , (2008).</li><li>Yi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+immunogold+labeling+of+cell+surface+proteins+and+viral+glycoproteins+for+cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applications.">Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).</li><li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells.">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li><li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3+nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy.">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).</li><li>Meier, C., Beckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+fracture:+new+avenues+for+the+ultrastructural+analysis+of+cells+in+vitro.">Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+scanning+transmission+electron+microscopy:+imaging+protein+complexes+in+their+native+environment+in+whole+eukaryotic+cells.">Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).</li><li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+radiation+damage+in+the+TEM.">Control of radiation damage in the TEM.</a> Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).</li><li>Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-enabled+electron+microscopy+and+correlated+super-resolution+microscopy+of+wet+cells.">Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells.</a> Nature Communications. 6, 7384 (2015).</li><li>Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+mobility+and+associated+reshuffling+of+cytoplasm+during+chemical+fixation.">Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).</li><li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Electron+Microscopy+Using+Graphene+Veils.">Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , (1995).</li><li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Protein fonksiyonunu daha iyi anlamak için, bozulmamış hücrelerin plazma zarındaki protein konumları hakkında bilgi almak önemlidir. Bu bilgileri elde etmek için yöntemler süper çözünürlüklü floresan mikroskopi1,2içerir. Süper çözünürlüklü mikroskopi son yıllarda daha da gelişmiş olmasına rağmen, çözünürlüğü hücre deneylerinin pratik koşulları için hala yaklaşık 20 nm ile sınırlı iken, tipik reseptör proteinleri 1-10 nm aralığında boyutlara sahiptir. Proteinlerin tek hücreli ve tek molekül düzeyinde proteinlerin görselleştirilmesi için yeterli çözünürlüğe sahip olarak görüntülenmesi EM ile mümkündür. Ama kesit nedeniyle, konvansiyonel EM yöntemleri genellikle hücre bozulmadan bırakmayın26, hangi bağlam ve plazma zarında proteinlerin mekansal dağılımı hakkında önemli bilgilerin kaybına yol açar. Kriyo-TEM ile tüm hücreler için yöntemler geliştirilmiştir6, bu kriyo-EM27ile protein etiketleme birleştirmek mümkün, ayrıca kriyo-STEMgösterilmiştir 28. Ancak, kriyo-EM iş akışları hücresel ultrayapı ve protein yapısını incelemek için optimize edilmiştir ve membran protein uzamsal dağılımlarını analiz etmek için çok fazla değildir. Kritik nokta kurutma başka bir bütün hücre hazırlama yöntemidir ancak numuneler birkaç kurutma adımına tabi tutulur ve teknik son derece zaman alıcıdır 29. Membran proteinleri de donma kırığı7ile incelenmiştir. Bu yöntemde hücreler sabitlenir, donar ve kırılır. Kırık parçalar karbon ve platin tabakaları tarafından çoğaltılır ve biyolojik örnek çıkarılır. Kopyaları daha sonra EM30ile analiz edilebilir. Tüm hücre analizi donma fraksiyonu ile mümkün değildir, çünkü tüm hücre bağlamında membrandaki proteinlerin dağılımı hakkında bilgi kaybolur.
Burada sunulan yöntem hücre zarının numuneyi ince dilimlemeye gerek kalmadan incelenmesini sağlar9,31. Hücreler, membran proteinlerinin lokalizasyonunun EM görüntüleriyle ilişkili floresan görüntülerden görülebilmesi için bozulmadan tutulur. Sulu durumda bozulmamış hücreler içinde tek hücreli ve tek molekül düzeyinde proteinlerin incelenmesi bu grafen muhafaza yöntemi9kullanarak QD etiketli proteinlerin STEM kullanılarak 2 nm çözünürlüğü ile mümkün olduğu gösterilmiştir . Proteinleri doğal hallerinde tutmak çok önemlidir, çünkü membran proteinlerinin mekansal dağılımını korur, bu da protein fonksiyonlarını anlamak ve tedavi yaklaşımları için yeni ilaçlar geliştirmek için önemli olan tek hücre ve tek molekül düzeyinde analizler mümkündür.
Biyolojik numunelerin EM ile görüntülenmesinin bir diğer kritik yönü de elektron ışınının neden olduğu örneklerin radyasyon hasarıdır. Çözeltiler genellikle mümkün olduğunca elektron dozu veya karbon32ince katmanları arasında örnek kapsülleme gibi çeşitli kaplama yöntemleri, azaltılması içerir. Yöntemimiz grafen kaplamanın, kaplamasız numuneler için hücre yüzeyinde ortaya çıkan ışınkaynaklı objeleri azalttığını göstermektedir. Kimyasal olarak sabitlenen ve grafen kaplı biyolojik numunelerin, numunede parlak noktalar gibi radyasyon hasarı olmadan 200 keV ışın enerjisinde 200 keV ışın lama altında incelenmesi mümkündür = (7.8±0.4) x 103 e-ş2 radyasyon hasarı olmadan. Ayrıntılı numune hazırlama içeren diğer EM yöntemleri ile karşılaştırıldığında, örneğin, boyama, katıştırma, (kriyo-) kesit, kırma, vb. burada açıklanan yöntem daha az zaman alır. Proteinlerin etiketlemi birkaç saat içinde yapılır ve grafen kaplama eğitimli araştırmacılar için sadece yaklaşık 15 dakika gerektirir. Numune hazırlama floresan mikroskopisi için gerekli prosedürlerle karşılaştırılabilir.
Protokol bazı adımlarda değiştirilebilir. Mikroçip üzerindeki grafen, bir filtre kağıdıyla lekelendiğinde grafenin hareket etmediğinden emin olmak için havayla kurutulabilir. Grafen tuzla kirlenmişse, tuzu eritmek ve böylece kontaminasyonu en aza indirmek için yaklaşık bir saat boyunca su yüzeyinde yüzdürülmesini sağlamak mümkündür. Grafende meydana gelen bakır veya PMMA kontaminasyonu protokoldeki ilgili gravür adımlarını uzatarak azaltılabilir. Diğer grafen kaplama yöntemleri, örneğin, grafen-PMMA doğrudan hücrelere yatırıldı ve PMMA daha sonra aseton yıkanarak kaldırıldı tarif edilmiştir33. Yöntemimizde, ek aseton yıkama adımlarından kaynaklanan hücrelerde olası hasarları önlemek için kaplamadan önce PMMA çıkarıldı. NaCl düz olduğu için burada bir substrat olarak seçildi, bu yüzden grafen kırışıklık yok, ve grafen serbest bırakmak için suda çözünür9. Ayrıca istenilen boyutta kesilebilir ve grafende substrat kalıntısı bırakılmaz. Ama dikkate bu kriterleri göz önünde bulundurarak, potasyum klorür gibi diğer substratlar muhtemelen de kullanılabilir.
Potansiyel etiket kaynaklı kümelenme olasılığını azaltmak için, GA fiksasyon adımı FA fiksasyonundan hemen sonra uygulanabilir ve bundan sonra tüm membran proteinleri hareketsiz hale getirilmiştir. FA ile ilk fiksasyon adım zaten biyolojik yapıyı düzeltir ama membran protein difüzyon azaltılmış düzeyde hala oluşabilir34, muhtemelen qd başına birden fazla Streptavidin varlığı nedeniyle etiket indüklenen kümelenme yol açan. GA ile fiksasyon LM sırasında bir otofloresan sinyaline yol açabilir ve bu nedenle, açıklanan protokolde LM sonra yapılır, ancak başka bir yerde açıklandığı gibi azaltılabilir34. Cacodylate tampon oldukça toksik, ve diğer fiksatifler de kullanılabilir, ama cacodylate em protokolleri için yaygın olarak kullanılan bir tampon olarak burada kullanılır, çökelti önler, bakteriyel ve mantar büyümesini önler, ve lipid membranların ultrayapısal bütünlüğünü korumak için gerekli olan kalsiyum iyonları ile uyumludur35. Gerekirse, osmiyum tetroksit lipidler stabilize etmek için ek fiksasyon olarak kullanılabilir. Bu hücre yapısının kontrast geliştirmek için yardımcı olur, ama aynı zamanda sisteme başka bir metal eklemek ve QDs elde edilen kontrastı azaltmak.
Burada açıklanan protokol, iyi bir yönerge gerektiren birçok adım içerir. Mikroçiplerin SiN yüzeyinin çizilmesini önlemek ve kırılmayı önlemek için mikroçipleri kullanmadan önce bazı eğitimler gereklidir. Daha önce de belirtildiği gibi, SiN penceresi zaman zaman kırılabilir gibi yinelenen mikroçipler hazırlamak için tavsiye edilir. Bir mikroçip üzerinde gerekli sayıda hücre elde etmek de bazı deneyim gerektirir. Grafen ile hücreleri kaplama su üzerinde grafen float doğru eğim açısı bulmak zor olabilir gibi bazı eğitim ihtiyacı var. Sudan grafen yakalarken, aynı zamanda ince grafen görmek zor olabilir. Grafen mikroçipin üzerinde olur olmaz, fazla suyun bir filtre kağıdıyla silinmesi gerekir. Bu sadece mikroçipgrafen çıkarmadan önlemek için bir filtre kağıdı ucu ile yapılmalıdır.
Grafen kaplama, örneklerde yer alan eserlerin görünmesini engelledi. Ancak D < 4 x 102 e-/ş2 için de kaplamasız numune için hiçbir eser ortaya çıkmamış ve sadece 2 kaplamasız örnek için eserler ortaya çıkmıştır. Böylece, kaplamasız hücrelerin incelenmesi de mümkün görünse de, grafen kullanmak ve artifakı oluşma riskini önlemek daha iyi olacaktır. Bu eserlerin bileşimi gelecekte nasıl oluşumunu önlemek için ipuçları vermek için analiz edilebilir. Hücrelerin yapısal stabilitesi ile ilgili olarak grafen kaplamada sadece küçük bir iyileşme gözlenmiştir. Sabit hücreler görünüşe göre incelenen ince alanlarda stabilize edildi, onların yapısı SiN membran yakın olduğu. Ancak burada incelemediğimiz şey, vakum4'emaruz kaldığında hücresel numuneler için oluştuğu bilinen objeleri kurutmaktı. Hücrelerin kurutulması hücrelerin küçülmesine yol açar, böylece QD mesafeleri de bunun sonucu olarak değişir. Burada kullanılan elektron dozu için grafen kaplı ve kaplamasız örneklerin QD'lerinin uzaklığı sabit kalmıştır. Grafen kaplamanın EM hücreleri üzerindeki etkisini incelemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Bu yöntemin bir sınırlama hücrelerin kimyasal fiksasyon gerekli olmasıdır; bu nedenle, hiçbir canlı hücre deneyleri yapılabilir. Ancak etiketleme gerekli değildir ve daha yüksek bir yapısal kararlılık ile hücreler kullanılır, örneğin bakteri, daha sonra sabitlenmemiş hücreler farklı bir elektron doz toleransı ile de olsa EM36 için grafen eklenebilir. Ayrıca, proteinler doğrudan tespit edilemez, bu yüzden qds proteinleri görselleştirmek için gereklidir. Yöntem, daha küçük etiketlerden yararlanacaktır. Tartışma konusu, ultrayapının net bir şekilde görülememesi iyi mi kötü mü? Yöntemimiz sadece seçilmiş proteinlerin görülebildiği floresan mikroskobuna benzer37. Ultrayapının görünürlüğünü artırmak da görüntüye çok daha fazla bilgi ekler ve bir noktada tek tek etiket konumlarının algılanmasını engeller. Ayrıca, burada açıklanan yöntem bir protein türü içindir ve birden fazla proteini etiketleyebilmek için protokol eklemeleri gerekmektedir. Son olarak, yöntem, antikor mimetik21 veya nanobody38 gibi küçük bir yüksek afinite özellikle bağlayıcı molekül mevcut olduğunda çalışır. Yaygın olarak kullanılan antikorlar çok daha büyüktür ve protein alt birimlerinin oligomerlere işlevsel durumunun saptanmasını önler.
Yöntemimiz, hücreleri sulu durumda tutarken EM kullanarak tüm hücrelerde protein fonksiyonunu incelemek için yararlıdır. Hücre serilerini incelemek kolayca mümkündür. Diğer hücre ve protein ler de incelenebilir. Protein etiketleme gerekli değilse, protokolün bir alt kümesi biyolojik örneklerin çok çeşitli grafen kaplama için kullanılabilir. Tüm hücreleri inceleme yeteneği moleküler düzeyde membran protein fonksiyonunun korelasyonları anlamak için hücresel araştırma da ilgilidir.

Membran protein fonksiyonunun analizi hücre biyolojik araştırmaları ve ilaç gelişimi için gereklidir. Önemli deneyler sınıfı hücrelerdeki membran protein pozisyonlarının incelenmesini içerir. Bu bilgiler, protein komplekslerindeki proteinlerin biraraya gelip plazma zarındaki belirli konumları hakkında sonuçlar elde etmek için kullanılabilir, bu da dinamik montaj ve sökme yoluyla çok çeşitli hücresel fonksiyonları yönlendirir. Diğer tekniklerin yanı sıra, hücrelerdeki protein fonksiyonlarının incelenmesinde ışık mikroskobu (LM) ve elektron mikroskobu (EM) kullanılmaktadır. LM sıvı tüm hücrelerin analizini sağlar; ancak, çözünürlük 200-300 nm konvansiyonel ve 20 nm kadar pratik koşullar altında süper çözünürlüklü floresan mikroskopi için sınırlıdır1,2. EM yaklaşık 1 şçözünürlükleri 3sağlar, ancak geleneksel numune hazırlama dehidratasyon gerektirir, görüntü kontrastı artırmak için metal boyama, ve reçin gibi bir montaj maddesi gömme, iletim elektron mikroskobu için (TEM)4. Biyolojik numuneleri daha yerli benzeri bir ortamda korumak için kriyo-EM teknikleri5,6olarak kullanılabilir. Örnekler hızla amorf buza dondurulur ve gerekirse kesitlenir. Başka bir seçenek donma-em7kırma olduğunu.
Kendi yerli, sıvı durumda bozulmamış hücreler içinde membran proteinleri incelenmesi için EM teknikleri son on yılda ortaya çıkmıştır8,9,10,11. Bir SiN membran üzerinde yetişen ve grafen9tabakası ile çevrili tüm hücrelerde kuantum nokta (QD) etiketli membran proteinleri üzerinde 2 nm'lik bir mekansal çözünürlük elde edilmiştir.
Burada protein etiketleme ve grafen kaplama protokolünün ayrıntıları9,12 açıklanmıştır. Bu protokolün amacı, her2'nin bütün, sabit hücrelerin zarındaki mekansal dağılımını analiz etmek ve hücreleri sulu bir durumda korumaktır. Grafen ile kaplama vakum hücrelerinin kurumasını önler, ve aynı zamanda radyasyon hasarı azaltır13. Bu yöntem bozulmamış plazma membran içinde etiketli membran proteinleri hakkında bilgi sağlar, ancak bu yöntem genellikle EM ile yapıldığı gibi hücresel ultrayapının incelenmesinde yararlı değildir.
Grafen bilinen en ince nanomalzeme, ve tek bir karbon atomu kalın kristal levha bir petek kafes14düzenlenmiş oluşur. Yüksek esneklik ve mekanik mukavemet gibi benzersiz özelliklere sahiptir. Son araştırmalar, hatasız grafenin gazlar ve sıvılar için geçirimsiz olduğunu göstermiştir, ancak kusurlar hidrojen geçirgenliği15sağlar. Bu sızıntı burada kullanıldığı gibi çok katmanlı grafen kullanılarak azaltılabilir. Bilayer grafen son zamanlarda kriyo-EM örnekleri için bir destek olarak yararlı olduğu gösterilmiştir, sadece tekdüze olmayan katmanları oluşturulabilir grafen oksit ile karşılaştırıldığında ince buz tabakasının homojenliğini artırmak16. Grafen de sıvı faz iletim elektron mikroskobu 13 sırasında biyolojik örneklerin ışın hasarı azaltmak için gösterilmiştir13,17. Örnek bir deney olarak, HER2 memeli meme kanseri hücre hattı SKBR3 ifade QDs18 ile etiketlendi ve mekansal dağılımı STEM kullanılarak kaydedildi. Hücreler elektron şeffaf SiN membran19ile bir Si mikroçip üzerinde tohumlu edildi. Mikroçipler sağlam, LM ve EM ile uyumlu olduğu için destek olarak seçilmiştir ve tüm etiketleme işlemi doğrudan mikroçip19üzerinde gerçekleştirilebilir. Hücre eki sonra, HER2 iki adımlı etiketleme protokolü20ile etiketlendi. İlk olarak, bir biyotinylated anti-HER2 antikor mimetik bileşik21 HER2 bağlıydı. Hücreler daha sonra kimyasal etiket kaynaklı reseptör kümelenmeönlemek için sabit, ve hücresel ultrayapının istikrarını artırmak için. Streptavidin kaplı QD'lar daha sonra HER2 antikor mimetik kompleksine bağlandı. Parlak floresan sinyali ve QD'lerin elektron yoğun çekirdeği, korgöreceli floresan ve elektron mikroskobu (CLEM) 20.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00020 KÖK analizi için hücresel ilgi bölgeleri hücrelerde HER2 lokalizasyonunu vurgulayan genel floresan mikroskopi görüntülerinden seçilebildiği için CLEM özellikle yararlıdır. Hücreler floresan mikroskopi ile yüksek HER2 düzeylerine sahip hücresel bölgeleri belirlemek için analiz edildi. Bundan sonra, grafen 3-5 kat kalınlığında levha kaplama için hücrelere transfer edildi9,22. Daha sonra, numune bir EM numune tutucuya monte edildi. KÖK verileri, her2'nin hücre yüzeyindeki mekansal dağılımı hakkında bilgi veren, ancak hücrenin ultrayapısı hakkında bilgi veren anüler karanlık alan (ADF) dedektörü kullanılarak elde edildi. Elektron ışını ışınlaması altında numunenin stabilitesini belirlemek için, örnekler bir görüntü serisinde artan dozda(D)incelenmiştir. Grafen kaplı ve kaplamasız numuneler arasındaki fark araştırıldı. Çeşitli radyasyon hasarı değerlendirildi.
Burada açıklanan protokol HER2 her2 aşırı ifade memeli meme kanseri hücre hattı SKBR3 HER223hedeflemek için bir model sistemi olarak kullanır. Protokol, grafen kaplı bir numunenin hazırlanmasını ve benzer bir numunenin ancak karşılaştırma için grafen kaplama içermeyen bir numunenin hazırlanmasını içerir. SiN penceresi her zaman bir kez kırılabileceğinden ve çoğu durumda deneysel bir yineleme elde edebileceğinden, deneme yinelenen olarak hazırlanır. Yöntemin genel verimi yüksektir, grafen kaplı hücrelere sahip mikroçipler genellikle istisnai bir hata ile elde edilir, ancak tüm SiN penceresi her durumda grafen ile kapsanabilir. Yinelenenler protokolde açıklanmaz.
Etiketleme protokolü (adım 1-5) daha önce24yayınlanan COS7 fibroblast hücrelerinde epidermal büyüme faktörü reseptörünün etiketleme protokolü ile karşılaştırılabilir; bu kağıttaki ayrıntılar mikroçiplerin işlenmesi ve kuyu plakalarının kullanımı ile ilgili olarak adlandırılır. Aşağıdaki protokol HER2, grafen kaplama9ve numunenin radyasyon toleransını incelemek için optimize edilmiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone for HPLC (min. 99.8 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2626-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL54 analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany</td>
			<td>30029077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free, &#8805; 98 %, for molecular biology</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 &#181;M</td>
			<td>Affibody, Solna, Sweden</td>
			<td>10.0817.02.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F</td>
			<td>JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylic acid sodium salt trihydrate &#8805; 98 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5169.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>627861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>5401000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 ml sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>9286.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>PK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>4430000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2222-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>F8141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Leica DMI6000</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>10099141</td>
			<td>lot number: 1751893</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Goat Serum, New Zealand origin</td>
			<td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>lot number: 1788320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy 48R CO2 Incubator</td>
			<td>New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>CO48310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan Model 950 Solarus&#151; Plasma Cleaner</td>
			<td>Gatan GmbH, M&#252;nchen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine &#8805; 98.5 % Ph.Eur., USP, BP</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Heidolph Instruments GmbH &#38; CO. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>MR 3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0557-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSc-Advantage&#151; Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocean Microchips SiN window 400x150 &#181;m, 200 nm spacer</td>
			<td>DENSsolutions, Delft, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>10 mL: C542.1 20 ml: T550.1</td>
			<td>purchased via Carl Roth GmbH&#38;Co. KG, Karlsruhe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany</td>
			<td>VO 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td>#291-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfekt-Kescher with handle</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>2-200&#181;l: 7695892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>0.1-10 &#181;l: 7695880 2-100 &#181;l: 7695883 100-1000 &#181;l: 7695886 1250 &#181;l XL: 7695887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 &#181;M</td>
			<td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased</td>
			<td>Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA</td>
			<td>94-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell, Dassel, Germany</td>
			<td>300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo Microscope Leica M60</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td>
			<td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml)</td>
			<td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td>
			<td>5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath SW22</td>
			<td>Julabo GmbH, Seelbach, Germany</td>
			<td>9550322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>HN00.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm</td>
			<td>International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA</td>
			<td>9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, &#8805; 99.5 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium persulfate</td>
			<td>carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>4365.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 &#181;m</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P668.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm</td>
			<td>ACS material, Pasadena, CA, USA</td>
			<td>TTG30011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Dumoxel 03</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0103-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Inox 02</td>
			<td>Manufactures D&#8217;Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td>
			<td>0102-7-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, plastic replaceable tip</td>
			<td>Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland</td>
			<td>5SVR.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water ROTISOLV HPLC gradient grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>A511.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

graphene enclosure of chemically fixed mammalian cells for liquid-phase electron microscopy

Taramalı iletim elektron mikroskobu (STEM) kullanılarak meme kanseri hücrelerinin bozulmamış plazma zarında insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) araştırmak için bir protokol tanımlanmıştır. Memeli meme kanseri hücre hattı SKBR3 hücreleri silikon nitrür (SiN) pencereler ile silikon mikroçipler üzerinde büyüdü. Hücreler kimyasal olarak sabitlendi ve HER2 proteinleri iki aşamalı biotin-streptavidin bağlama protokolü kullanılarak kuantum nokta nano partikülleri (QDs) ile etiketlendi. Hücreler sulu bir durumu korumak ve STEM sırasında elektron ışını hasarından korumak için çok katmanlı grafen ile kaplandı. Elektron ışını ışınlaması altındaki örneklerin stabilitesini incelemek için bir doz serisi deney yapıldı. Grafen kaplamalı ve kaplamasız numuneler karşılaştırıldı. Işın kaynaklı hasar, parlak eserler şeklinde, artan elektron dozu Dbazı kaplamasız örnekler için ortaya çıktı , hiçbir eserler kaplamalı örnekler üzerinde ortaya çıkarken.

Şekil 1A, pencerenin kapalı olduğu şekilde tohumlanmış hücreleri gösterir, ancak düzleşmesine ve yapışmasına izin verecek yeterlird alana sahip olur, bu da yaklaşık 2/3'lük bir kesişmeye yol açarak(Şekil 1B). Bir mikroçipüzerinde çok fazla hücre nin tohumlanmış olması durumunda(Şekil 1C),tüm hücrelerin mikroçipe yapışması için yeterli alan yoktur. Şekil 1D 24 saat sonra aynı mikroçip gösterir. Hücrelerin yarısından fazlası düzolmadı. Öte yandan, çok az hücre tohumlu ise(Şekil 1E),SiN penceresi Şekil 1F'degörüldüğü gibi 24 saat sonra büyük bir boş alanla son bulur. Şekil 1G, Şekil 1A ve Şekil 1B'dekihücrelerin DIC görüntüsünü gösterir. Şekil 1H, HER2'nin başarılı bir şekilde etiketlendiğini gösteren sarı renkte sahte renkte karşılık gelen floresan görüntüsünü gösterir.
Temsili STEM verileri Şekil 4'tegösterilmiştir. Grafen kaplı (sol kolon) ve kaplamasız (sağ kolon) SKBR3 hücreleri araştırıldı. Şekil 4A,B penceredeki hücrelerin M = 800x genel bakış görüntülerini gösterir. Insets olarak gösterilen alanlar doz serisi sırasında M = 80.000x olarak görüntülendi, Bkz. Şekil 4C,D. QD'ler burada parlak noktalar kadar görünür. Şekil 4E ve Şekil 4F, Şekil 4C'dekidikdörtgenlerin konumlarında elde edilen M = 50.000x büyütülmüş görüntülerin D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/ş2ile bir doz serisi nin elde edilmesinden sonra kaydedildi.D. Doz serisi M = 80.000x olarak kaydedildi. Açıkta kalan alanlar dikdörtgen olarak tanınabilir ve dikdörtgen kaplamasız örnek için açıkça görülebilir (Şekil 4F).
Grafenin varlığını doğrulamak için, hücresi olmayan, ancak Grafenli veya Grafensiz alanların kırınım desenleri elde edildi. Grafenin altıgen yapısı, grafen kaplı numunenin kırınım deseninde(Şekil 4G)gözlenirken, kaplamasız numunede bulunmamaktadır (Şekil 4H). Tek kristal grafenin kırınım deseni grafenin yüksek sıralı altıgen yapısı nedeniyle altı kat simetriye sahip olacaktır. Altıgen yapı örneklerde grafen in varlığını gösteriyor.
Elektron ışını aydınlatmasının numune üzerindeki etkisini araştırmak için STEM görüntüleri biriken elektron dozu ile bir görüntü serisinde elde edilebildi. Kaplamalı olmayan ve grafen kaplamalı numuneler için temsilsonuçları sırasıyla Şekil 5A-D ve Şekil 5E-G'degösterilmiştir. Tüm veriler hücrenin en düz olduğu hücrenin kenarında elde edildi ve gözlenen yapı böylece SiN zarına en yakın olan yapıdır. Kaplamasız örneklerin maruz ilerledilmesi, Hücre yüzeylerinde D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/ş2 (Şekil 5B)parlak yapılara yol açmıştır. Bu yapılar daha yüksek dozlarda büyüdü, bu nedenle serinin son görüntüsünde D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/ş2 (Şekil 5C,D)olarak açıkça görülebildi. Bu lekeler grafen kaplı örneklerin hiçbirinde görünmedi(Şekil 5E-G).
Yukarıda açıklanan protokol kullanılarak ek mikroçipler hazırlandı ve incelendi. Toplam altı kaplamalı ve yedi kaplamasız örnek araştırıldı. Kaplamasız yedi örnekten ikisi bu eserleri gösterdi. Kaplamalı örneklerin hiçbiri ek parlak noktalar göstermedi.
Radyasyon hasarının bir başka ölçüsü olarak, QD'ler arasındaki mesafe incelendi. Yapısal hasar meydana olsaydı, bir QDs arasındaki mesafelerdeğiştirmek için beklenebilir. Mesafelerdeki değişiklikler farklı QD çiftleri için ölçüldü ve çift mesafeler için D birikti. Şekil 5H, kaplamalı olmayan numuneler için parçacıkların göreceli değişiminin ortalama %1,3'ün altında kaldığını, kaplanmış numuneler için ise ortalama göreceli mesafenin %0,8'in altında kaldığını göstermektedir. Bu nedenle grafen kaplamanın numuneyi stabilize ettiği, ancak grafen kaplama içermeyen kurutulmuş numunelerin de son derece kararlı olduğu sonucuna varılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> Şekil 1: Silikon mikroçip ve HER2 etiketli bir SiN penceresinde hücre tohumlama. (A) Mikroçip üzerinde tohumlama sonra SKBR3 hücreleri 5 dk ile bir SiN pencere bölgesi örnek görüntü. (B) Aynı hücreler tohumlamadan sonra si mikroçip 5 dk üzerinde 24 saat. (C) SKBR3 hücrelerinden sonra aynı SiN penceresine yayılır. (D) 24 saat sonra (C) ile aynı hücreler. Tohumlama üzerine cips üzerinde çok fazla hücre olduğu gibi hücreler düzgün düzleştirmek değildi. (E) Bir mikroçip üzerindeki hücreler 5 dk sonra tohumlama. (F) Pencerede çok az hücre görülebiliyordu çünkü mikroçipte çok az hücre vardı. (G) HER2'nin QD etiketlemesi sonrasında aynı SKBR3 hücrelerinin DIC görüntüsü. (H) DIC'nin yer kaplaması görüntüsü ve her2-QD655 etiketli SKBR3 hücrelerinin ilgili floresan görüntüsü (sarı renkte yanlış renkli). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> Şekil 2: Grafenin NaCl kristallerine temizlenmesi ve aktarılması. (A) PMMA-grafen-on-polimer PMMA grafen serbest bırakmak için saf suya batırılır. PMMA-grafen cam bir slayt ile yakalanabilir. (B) Bakır bazlı kontaminasyonlar sodyum persülfat çözeltisi kullanılarak kazındı. Grafeni temizlemek için, deiyonize su içeren bir kabına aktarıldı. Bu adımlar 3 kez tekrarlandı. PMMA-grafen daha sonra saf suda NaCl doymuş çözeltisine aktarıldı. Tuz çözeltisinden grafenalmak için bir NaCl kristali kullanıldı. (C) NaCl kristalüzerindeki PMMA-grafen oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurutuldu. PMMA 30 dakika için aseton blok kuluçka ile <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">kaldırıldı.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> Şekil 3: Si mikroçipi üzerine tohumlanmış hücrelerin grafen kaplaması. (A) Grafen kaplama prosedürü. NaCl kristalüzerinde grafen su yüzeyine serbest bırakılır. Grafen parçası daha sonra metal bir döngü ile yakalanır ve Si mikroçip üzerine aktarılır. (B) Grafen içermeyen 400 x 160 μm boyutlarında SiN penceresi olan mikroçip (2,0 x 2,6 mm). SKBR3 hücreleri koyu noktalar olarak görülebilir. (C) Grafen (kırmızı daire) su dolu bir kabın yüzeyinde yüzen. (D) Grafen metal bir döngü ile yakalandı. (E) Su damlacılığa bağlı mikroçip, grafenin SiN penceresinin üstünde olması için. (F) Grafen kaplama dan sonra mikroçip. Grafen mor bir parıltı olarak görülüyordu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> Şekil 4: SiN penceresinde grafen kaplı ve kaplamasız SKBR3 hücrelerinin GÖVDESI. (A) M = 800x. (B) M = 800x. (C) M = 80.000x görüntüde elde edilen kaplamasız bir numunenin grafen kaplı bir numunenin STEM görüntüsü, A. Sarı çizgilerdeki mavi dikdörtgenin konumunda kaydedilen örneklerin parçacık içinde ölçülen mesafeyi temsil eder. (D) M = B. Sarı çizgideki mavi dikdörtgenin konumunda kaydedilen 80.000x görüntü, parçacıklar içinde ölçülen örneklerin uzaklıklarını temsil eder. (E) M = 50.000x aynı bölgenin D = (7.8±0.4) x 103 e-/ş2'yemaruz kalan görüntüsü . (F) M = D ile aynı bölgenin 50.000x görüntü ve D = (7.8±0.4) x 103 e-/ ş2maruz . Maruz kalan alan açıkça görüldü. (G) Hücreleri olmayan bir bölgeden grafen kaplı bir numunenin kırınım deseni. Grafenin altı kat simetrisi parlak noktalar olarak görülebilir. (H) Grafen içermeyen bir numunenin kırınım deseni 6 kat parlak noktalar göstermez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> Şekil 5: Grafen kaplama içermeyen numunelerden doğan eserler. (A) Grafen kaplaması olmayan ve D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-ş2'yemaruz kalan grafen kaplaması olmayan numunelerin ilk görüntüleri . (B) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/ş2 (sarı ok) ile ortaya çıkan ilk eserlerle görüntüler. (C, D) D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/ş2ile elde edilen serinin son görüntüsü . Eserler parlak noktalar olarak görülüyordu. (E-G) Grafen kaplamalı örnekler ortaya çıkan eserler olmadan. (E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/ş2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/ş2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/ş2. (H) Grafen kaplamalı ve kaplamasız numuneler için parçacık mesafelerinde göreceli değişim. Biri (A-C)'de gösterilen eserler, d'deki ikinci numunenin son görüntüsü ve üç kaplamalı örnek incelenmiştir (biri E-G ile gösterilmiştir). Toplam da numune başına 250 nm ile 3 μm arasında değişen mesafelerde on QD çifti incelenmiştir. Göreceli değişiklik, bir gruptaki tüm ölçümlerin ortalamasını yansıtır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Çözümler ve tamponlar için tarifler. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy at JoVE.com

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

Burada sunulan memeli hücrelerde membran proteinleri etiketleme ve sıvı faz lı iletim elektron mikroskopisi için grafen ile örnek kaplama için bir protokoldür. Örneklerin radyasyonun neden olduğu hasara karşı stabilitesi de bu protokol ile incelenebilir.

Sıvı Fazlı Elektron Mikroskobu için Kimyasal Olarak Sabit Memeli Hücrelerinin Grafen Muhafazası

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Bu yöntem biyolojik örnekleri yerli bir ortamda tutar ve elektron ışını kaynaklı objeyi azaltır. Ana avantajı bu tekniğin tüm hücreler için geçerli olmasıdır. Yani elektron mikroskobundan önce hücrelerin susuz, lekeli veya kesitli olması gerekmez.Tüm bozulmamış plazma membran bağlamında kanser hücreleri üzerinde görüntü reseptörleri yeteneği yeni tedavi yaklaşımları ve yeni antikanser ilaçların geliştirilmesine yol açabilir önemli bir yönüdür. Hücreleri, grafen kaplama ve mikroskopi ile çalışmaları mı göstereceğim, Sercan Keskin ise grafenin nasıl hazırlanacağını gösterecektir. Başlamak için, silikon nitrür membran yukarı bakan ve serum içermeyen orta 50 mikrolitre ile PLL ve FLP kaplı mikroçipler içeren 96 kuyu plaka iki kuyu hücre süspansiyon 100 mikrolitre ekleyin.Hücrelerin mikroçipe bağlanmasıiçin plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle beş dakika kuluçkaya yatırın. Ters mikroskopla mikroçipteki hücrelerin yoğunluğunu kontrol edin ve hücrelerin pencereyi düzleştirmek ve yapışmak için yeterli alana sahip olmasını sağla. HÜCRELERDE HER2 etiketlemek için, etiketleme plakasının ilk satırının kuyularına mikroçipleri yerleştirin.Daha sonra mikroçipleri PBS BSA ile yıkayın. Antikor mimetik spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için mikroçipleri PBS BSA GS ile beş dakika kuluçkaya yatırın. Sonra 200 nanomolar antikor mimetik ile 10 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit.Polimer PMMA grafen kaldırmak için, pipet PMMA grafen etrafında polimer üzerinde su birkaç damlacıkları. Daha sonra, PMMA grafen serbest bırakmak için 30 ila 45 derecelik bir açı ile suya batırın. Bakır bazlı kirleticileri eforlamak için, suda 0,42 molar sodyum persülfat 50 mililitre çözeltiprepair.PMMA grafenini sodyum persülfat çözeltisine, grafen tarafı aşağı yassı bir şekilde aktarmak için standart bir cam kaydırak kullanın. PMMA grafeni çözümün en üstüne yüzer. Bir gece orada bırak.Ertesi gün, PMMA grafenini sodyum persülfat çözeltisinden temiz suya aktarın. Yarım saat suda yüzsün. PMMA grafenintüm sodyum persülfat kalıntılarını çıkarmak için toplam üç kez yıkayın.Sonra, PMMA grafenini sodyum klorür kristaline aktarın. Petri kabındaki suda doymuş sodyum klorür çözeltisi hazırlayın ve pmma grafenini grafen tarafı aşağı ile çözeltinin üzerine aktarın. Sodyum klorür kristalini cımbızla tutun ve yüzen PMMA grafenini toplayıp.Daha sonra, aşırı su akışını sağlamak için iki dakika dikey olarak tutun. 30 dakika oda sıcaklığına kadar kurumasını bekleyin ve 100 derecede 20 dakika fırında pişirin. Suyu tamamen çıkarın.Bir cam Petri kabında asetonu duman kaputundaki bir sıcak tabakta yaklaşık 50 dereceye ısıtın. Yangından kaçınmak için sıcaklığı dikkatle izleyin. PmMA grafenini tuz üzerine aseton dolu Petri kabına batırın ve PMMA'yı 30 dakika eritmeye bırakın.Numune hazırlama için kullanmadan önce grafenin tuz üzerinde iyice kurutulmasına izin verin. Tampondan tuz artıklarını çıkarmak ve filtre kağıdına yerleştirmek için hazırlanmış ve etiketlenmiş bir mikroçipi saf suda yıkayın. Hücreler koyu noktalar olarak görünür olmalıdır.Sodyum klorür kristalindeki çok katmanlı grafeni bir mikroçipin silikon nitrür penceresine uyan bir parçaya kesmek için jilet kullanın. Grafeni sodyum klorür kristalinden çıkararak bir su kabına batırın, kristali yüzeye göre 45 derecelik bir açıyla yatırın. Su yüzeyinden metal bir döngü ile grafen yakalamak, sonra alt döngü yüzeyi ile mikroçip üst yüzeyine dokunun, mikroçip metal döngü sopa neden.Grafen mikroçipin üstünde görülebilir. Stereomikroskop altında, grafensilikon nitrür penceresindeki tüm hücreleri kapsayacak şekilde mikroçipten kalan suyu çıkarmak için filtre kağıdı kullanın. Mikroçipi cımbızlı bir filtre kağıdına yerleştirin.Grafen mikroçip üzerinde mor bir Parıltı olarak görülebilir. Mikroçipi kağıttan bir bölme Petri kabına aktarın. Pipet serbest bölmelerinden birine bir damlacık su ve su doymuş bir atmosfer sağlamak için kapağı kapatın.Daha sonra, parafin film ile bölme çanak mühür ve buzdolabında dört derece santigrat saklayın. Kondansatör merceçlerini ayarlayarak en az 0,2 nanometre lik bir prob boyutuiçin bir hizalama örneği kullanarak STEM'i 200 kilovolt'luk ışın enerjisine ayarlayın. Bir diyafram ekleyerek 180 Picoampere ve 13,2 miliradians bir ışın yakınsama yarı açı bir sonda akımı ayarlayın.Projektör lens ayarlarını ayarlayarak ADF STEM dedektörü açma yarı açı aralığını 68-280 miliradan'a ayarlayın. Ardından, STEM görüntü boyutunu 2048 piksele 2048'e, pikselin ise altı mikrosaniyeye kadar süresini ayarlayın. Mikroçipi grafen kaplı hücrelerle tem için standart bir numune tutucuya, hücreler yukarı bakacak şekilde yükleyin ve tutucuyu elektron mikroskobuna yükleyin.800 X büyütme de genel bir resim edinin. Daha sonra, 1,3 nanometre piksel boyutu ile 80, 000 X kuantum nokta nano tanecikleri ilgi ve görüntü bir bölge tanımlayın. En iyi şekilde tohumlanmış hücreler burada gösterilir.Pencere kapalıdır, ancak düzleştirmek ve uymak için yeterli alan vardır. Bir mikroçipüzerinde çok fazla hücre tohumlandığında, tüm hücrelerin yapışması için yeterli alan yoktu. 24 saat sonra hücrelerin yarısından fazlası düzolmadı.Çok az hücre tohumlu ise, silikon nitrür penceresi 24 saat sonra büyük bir boş alan ile sona erecek. Dic ve en iyi tohumlanmış hücrelerin floresan görüntüleri burada gösterilmektedir, HER2 başarılı etiketleme gösteren. STEM grafen kaplı ve kaplamasız SKBR3 hücrelerinde yapıldı.800 X büyütme görüntülerindeki insets 80, 000 X.Kuantum nokta nano tanecikleri 50, 000 X büyütme parlak noktalar olarak görülebilir görüntülendi. Elektron ışını aydınlatmasının numune üzerindeki etkisini araştırmak için STEM görüntüleri biriken elektron dozu ile bir görüntü serisinde elde edilebildi. Kaplamalı olmayan ve grafen kaplamalı numuneler için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir.Kaplamasız örneklerin pozması, grafen kaplı örneklerin hiçbirinde oluşmayan hücre yüzeylerinde parlak yapılara yol açmıştır. Parçacık çiftlerin ortalama göreceli mesafe değişimi kaplamasız numuneler için %1,3'ün altında, kaplamalı numuneler için ise %0,8'in altında kalmıştır. Bu işlemden sonra, diğer mikroskopi yöntemleri kullanılarak tüm hücrelerde farklı türde membran proteinleri görüntülenebilir.Bu teknik, plazma zarının organizasyonu ve proteinler arasındaki etkileşim hakkında daha fazla bilgi edinmek için bozulmamış plazma zarındaki proteinlerin görüntülemimümkün kalmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...