Name: quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det polske nationale videnskabscenter under tilskud nr.

1. Forberedende skridt
<ol><li>Cellesåning for at opnå sammenløbende monolag<ol>
<li>Før såning, pels brøndene i en 4-brønde kammer dias med kollagen I (eller anden ECM komponent valg). For kollagen I belægning, følg en kommerciel protokol: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html ved en koncentration på 8 μg/cm2.</li>
		<li>Seed 400.000 celler til en brønd af en 4-brønd kammer dias.</li>
		<li>Cellerne dyrkes i 24 timer (eller længere, ...

<ol>
	<li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion.">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006 (2016).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).</li><li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours.">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP,+a+bisphenol+A+analog,+as+a+novel+AR+down-regulator.">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAX1+impact+on+collective+cell+migration,+cell+adhesion,+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility.">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li><li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+analysis+of+cell,+nucleus+and+focal+adhesion+morphology.">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).</li><li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics,+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour.">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707 (2016).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration.">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images.">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients.">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li><li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces.">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li></ol>

Celle-celle og celle-substrat vedhæftning udgør iboende attributter af epitelceller og spiller den afgørende rolle i væv morfogenese og embriogenese. I voksne væv den korrekte regulering af mekaniske egenskaber af cellelaget er afgørende for at opretholde homøostase og forebygge patologiske reaktioner som tumor progression og metastase. Størrelsen og antallet af fokale sammenvoksninger afhænger af styrken af celle-substrat vedhæftning, mens celleform afhænger af kontraktile kræfter og er relateret til status ...

Epitelcellemonolayers fungerer som et kollektiv , hvor celle - og celleunderlag vedhæftning samt kontraktile kræfter og spændinger repræsenterer vigtige parametre , og deres rette balance bidrager til enhed1,2,3's overordnede integritet . Derfor repræsenterer en vurdering af disse parametre en måde at fastslå cellelagets aktuelle status på.
De to metoder, der er beskrevet her repræsenterer en to-dimensionel analyse af sammenløbet monolag af klæbende, epitelceller (i dette tilfælde MCF7 brystkræft cellelinje). Analysen udføres ved hjælp af konfokale billeder (enkelte Z-udsnit) fra forskellige områder på Z-aksen; basalområde nær et substrat til fokal vedhæftningsmålinger (FA) og apical region for celleformmålinger. De præsenterede metoder er relativt enkle og kræver standard laboratorieteknikker og open source-software. Konfokal mikroskopi er tilstrækkelig til denne protokol, så det kan udføres uden at anvende mere specialiseret TIRF (Total Internal Reflection Fluorescens) mikroskopi. Protokollen kan således gennemføres i et relativt standardlaboratorium. Selv om nøjagtigheden af metoderne er begrænset, kan de skelne grundlæggende forskelle i fokal vedhæftning og celleform.
Begge metoder, der er beskrevet her, består af standardforsøgsprocedurer såsom cellekultning, immunstaining, konfokal billeddannelse og billedanalyse udført ved hjælp af ImageJ. Der kan dog bruges billedbehandlingssoftware med de relevante funktioner. De præsenterede metoder kan spore og sammenligne ændringer forårsaget af farmakologisk behandling eller minimal genetisk modifikation. Det anbefales ikke at opnå bestemte værdier på grund af disse metoders begrænsede præcision. To automatiserede makroer blev inkluderet, for at lette målinger af mange billeder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>goat anti-rabbit, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junction plakoglobin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2309S</td>
			<td>rabbit, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow cabinet class 2</td>
			<td>Alpina</td>
			<td></td>
			<td>standard equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td>
			<td>Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019</td>
			<td></td>
			<td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 cell line (CONTROL)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td>epithelial, adherent breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CK2 light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paxillin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>rabbit, 1:250, Y113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers

De metoder, der præsenteres her kvantificere nogle parametre for sammenfaldende klæbende celle monolag fra flere passende farvede konfokale billeder: vedhæftning til substratet som en funktion af antallet og størrelsen af fokale sammenvoksninger, og celle form, karakteriseret ved celleform indeks og andre form deskriptorer. Fokale sammenvoksninger blev visualiseret af paxillin farvning og celle-celle grænser var præget af krydset plakoglobin og actin. Metoderne til cellekultur og farvning var standard; billeder repræsenterer enkelte brændpunkter; billedanalyse blev udført ved hjælp af offentligt tilgængelig billedbehandlingssoftware. De præsenterede protokoller bruges til at kvantificere antallet og størrelsen af fokale sammenvoksninger og forskellene i celleformfordeling i monolagene, men de kan repurposed til kvantificering af størrelsen og formen af enhver anden særskilt cellulær struktur, der kan farves (f.eks mitokondrier eller kerner). Vurdering af disse parametre er vigtig i karakteriseringen af de dynamiske kræfter i klæbende cellelag, herunder celleadhæsion og actomyosin-kontraktilitet, der påvirker celleformen.

Analyse af adhæsion Knockdown af HAX1-genet har tidligere vist sig at påvirke fokale sammenvoksninger6. Celler blev dyrket på kollagen I-belagt overflade for 48 h. Billeder af MCF7 kontrolceller og MCF7 celler med en HAX1 knockdown(HAX1 KD) fra tre uafhængige eksperimenter farves med fokal vedhæftning protein paxillin blev opnået ved hjælp af en konfokal mikroskop (billede fra enkelt brændvidde / Z-slice fra basal region). 3-2.500 celler fra h...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

Artiklen beskriver kvantificering af 1) størrelsen og antallet af fokale sammenvoksninger og 2) celleform indeks og dens fordeling fra konfokale billeder af sammenløbet monolayers af MCF7 celler.

Kvantificering af celleunderlagsadhæsionsområde og celleformfordelinger i MCF7-cellemonolag

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Denne protokol gør det muligt at kvantificere området, omkredsen og formen af den intracellulære struktur fra dens todimensionelle billede. Denne teknik er hurtig og nem, kræver kun standard laboratorieindstillinger og et konfokal mikroskop og bruger opensource software. Demonstration af proceduren vil være Anna Balcerak, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium.Begynd med at så fire gange 10 til de femte celler i 0,5 milliliter kulturmedium pr. brønd i en fire-brønd kollagen en belagt kammer dias for en 24-timers kultur i en 37 grader Celsius og fem graders kuldioxid inkubator. Den næste morgen, bruge en optisk omvendt mikroskop til at kontrollere tilstedeværelsen af mindst 90% sammenløbet monolag og bruge en konfokal mikroskop for at opnå enkelt Z-slice billeder. Hvis du vil analysere fokale vedhæftning, skal du åbne billederne i ImageJ og vælge analyser, indstille skalering, fjerne skalering og global for at indstille billedskalaen i pixel.Hvis du vil medtage filnavnet og området for det område, der er af interesse for måleindstillingerne, skal du klikke på Analyser og angive målinger og kontrollere indstillingerne for området og få vist etiketet. Hvis du vil trække baggrunden fra, skal du vælge proces og trække baggrunden fra. Indstil den rullende kugleradius til 50 pixels og kontroller glidende paraboloid.For at bestemme området for den mindste interesseområde skal du skitsere den mindste enkelt brændvidde og klikke analysere og måle for at måle området. Når der er udvalgt og målt mindst 20 interesseregioner, beregnes og gemmes gennemsnittet af de opnåede resultater. Angiv den øverste grænse til 25 % af et typisk celleområde.Hvis du vil give billedet til binært, skal du klikke på billede, justere og tærskel og kontrollere standard, sort-hvid og mørk baggrund. Hvis du vil måle antallet og områderne i de områder, der er af interesse, skal du vælge analysere og analysere partikel- og kontrolpixelenheder, vise resultater, klare resultater og opsummere. Overfør de udsnits-, optællings- og samlede områdegennemsnitstørrelsesdata fra oversigtsvinduet til det datastyringsprogram, du vælger.For fokal adhesion kvantificering, åbne fokale vedhæftning ImageJ makro og indtaste området af den mindste region af interesse som det område af den mindste region af interesse parameter. Indstil tærskeltypeværdien til manuel eller automatisk, og gem ændringerne. Ring derefter til makroen fra ImageJ, og vælg det billede, der skal behandles.Hvis du vil have manuel cellefiguranalyse, skal du åbne et billede i et passende billedbehandlingsprogram og vælge de parametre, der skal måles. Brug frihåndsmarkeringsværktøjet til manuelt at afgrænse cellekanterne, som er markeret med de forskellige samlingsproteiner. De valgte parametre beregnes automatisk for hver celle.Når alle cellerne er skitseret, skal du vælge rediger, markering og føj til leder. Der skal kun vælges fuldstændige helt synlige celler med uafbrudte kanter. Hvis du vil foretage målingen, skal du markere alle de tal, der vises i venstre boks i interesselederområdet, og klikke på målpunkt.Resultaterne vises i resultatboksen og kan importeres til det regneark, du vælger. Automatiseret celleanalyse letter kvantificeringen af det store antal celler. For hver ny celletype skal du først afspille makroen for at oprette parametre.Når makroen er færdig, skal du markere angiv cellestørrelsesgrænser. Klik på etiketten på de mindste og største celler, og klik på målpunkt. Angiv værdien af den mindste celle og de største cellevariabler, og gem ændringerne.Luk alle makrovinduerne, og vælg det billede, der skal behandles i gråtoneskala. Kør derefter makroen igen. Makroen indeholder en tabel over resultaterne, der omfatter cellefigurindekset, højde-bredde-forholdet og områder med interessevalglistedata.Her kan repræsentative billeder af fokale sammenvoksninger tælles med ImageJ, herunder de endelige nummererede konturer og overlejringerne af fokale vedhæftningskonturer med det oprindelige billede til både kontrol- og knockdown-cellelinjer, observeres. Som illustreret i denne analyse viste knockdown-cellerne et højere antal sammenvoksninger pr. celle samt sammenvoksninger, der er større i størrelse sammenlignet med kontrolcellelinjeceller. I disse billeder vises repræsentative regioner med ubehandlede og kemoterapibehandlede cellemonologer.Konturcellerne var karakteriseret i henhold til deres celleformindeksværdier, for eksempel i denne analyse, der viste en stigning i den sidste bin og en udfladning af de vigtigste toppe for de stofbehandlede celler sammenlignet med ubehandlede kontroller. Der kan derefter genereres en frekvensfordeling og kumulativ fordeling for hver cellekultur. Gråtonebilleddannelse af monolagene som påvist gjorde det muligt at analysere og kvantificere 512 celler fra 12 synsfelter, der afslørede en relativ frekvensfordeling af celleformindekset.For at denne protokol kan fungere, er det vigtigt at bruge billeder af den bedst mulige kvalitet. Korrekt cellesåning, farvning og billeddannelse bør sikre billeder af tilstrækkelig eksperimentel kvalitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk Stimulation-induceret Calcium bølgeudbredelse i cellemonolag: eksempel med Bovin hornhindeendothelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantificering af krystallinsk cellulose Ophobning i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots til Monitor Tissue-specifikke Cell Wall Ændringer

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analyse Cell Surface Vedhæftning Remodeling i Reaktion på Mekanisk Tension Brug magnetiske perler

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Kvantificering af interbakteriel konkurrence ved hjælp af enkeltcellet fluorescens imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisering af aggregeret kvantificering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...