Name: quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par le Centre national polonais des sciences sous la subvention no 2014/14/M/NZ1/00437.

1. Étapes préparatoires
<ol><li>Ensemencement cellulaire pour obtenir des monocouches confluentes<ol>
<li>Avant l’ensemencement, enduisez les puits d’une lame de chambre de 4 puits de collagène I (ou d’un autre composant ECM de choix). Pour le revêtement de collagène I, suivez un protocole commercial : https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html à une concentration de 8 μg/cm2.</li>
		<li>Ensemencez 400 000 cellules dans un puits d’une lam...

<ol>
	<li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion.">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006 (2016).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).</li><li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours.">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP,+a+bisphenol+A+analog,+as+a+novel+AR+down-regulator.">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAX1+impact+on+collective+cell+migration,+cell+adhesion,+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility.">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li><li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+analysis+of+cell,+nucleus+and+focal+adhesion+morphology.">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).</li><li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics,+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour.">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707 (2016).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration.">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images.">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients.">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li><li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces.">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li></ol>

L’adhérence cellule-cellule et cell-substrat constitue des attributs inhérents des cellules épithéliales et jouent le rôle critique dans la morphogenèse des tissus et l’embriogenèse. Dans les tissus adultes, la régulation appropriée des propriétés mécaniques de la couche cellulaire est cruciale pour maintenir l’homéostasie et prévenir les réponses pathologiques comme la progression et la métastase de tumeur. La taille et le nombre d’adhérences focales dépendent de la force de l’adhérence cell...

Les monocouches épithéliales de cellules agissent comme un collectif dans lequel l’adhérence cellule-cellule et cellule-substrat ainsi que les forces contractiles et les tensions représentent des paramètres importants et leur juste équilibre contribue à l’intégrité globale de l’unité1,2,3. Ainsi, l’évaluation de ces paramètres représente un moyen d’établir l’état actuel de la couche cellulaire.
Les deux méthodes décrites ici représentent une analyse bidimensionnelle des monocouches confluentes des cellules épithéliales adhérentes (dans ce cas mcf7 ligne cellulaire de cancer du sein). L’analyse est effectuée à l’aide d’images confocales (seules tranches de Z) provenant de différentes régions de l’axe Z; région basale près d’un substrat pour les mesures d’adhérence focale (FA) et la région apicale pour les mesures de la forme cellulaire. Les méthodes présentées sont relativement simples et nécessitent des techniques de laboratoire standard et des logiciels open-source. La microscopie confocale est suffisante pour ce protocole, de sorte qu’elle peut être effectuée sans employer plus spécialisée tirf (total internal reflection Fluorescence) microscopie. Ainsi, le protocole pourrait être mis en œuvre dans un cadre de laboratoire relativement standard. Bien que l’exactitude des méthodes soit limitée, elles peuvent distinguer les différences de base dans l’adhérence focale et la forme cellulaire.
Les deux méthodes décrites ici consistent en les procédures expérimentales standard telles que la culture cellulaire, l’immunostaining, l’imagerie confocale et l’analyse d’image effectuées à l’aide de ImageJ. Toutefois, tout logiciel de traitement d’image avec les fonctions appropriées peut être utilisé. Les méthodes présentées peuvent suivre et comparer les changements subis par le traitement pharmacologique ou la modification génétique minimale. L’obtention de valeurs précises n’est pas recommandée, en raison de la précision limitée de ces méthodes. Deux macros automatisées ont été incluses, afin de faciliter la mesure de nombreuses images.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>goat anti-rabbit, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junction plakoglobin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2309S</td>
			<td>rabbit, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow cabinet class 2</td>
			<td>Alpina</td>
			<td></td>
			<td>standard equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td>
			<td>Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019</td>
			<td></td>
			<td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 cell line (CONTROL)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td>epithelial, adherent breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CK2 light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paxillin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>rabbit, 1:250, Y113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers

Les méthodes présentées ici quantifient certains paramètres des monocouches de cellules adhérentes confluentes à partir de multiples images confocales correctement tachées : adhérence au substrat en fonction du nombre et de la taille des adhérences focales, et de la forme cellulaire, caractérisée par l’indice de forme cellulaire et d’autres descripteurs de forme. Les adhérences focales ont été visualisées par la coloration de paxilline et les bordures de cellules-cellules ont été marquées par la plakoglobine de jonction et l’actine. Les méthodes de culture cellulaire et de coloration étaient standard; les images représentent des plans focals uniques; l’analyse d’image a été effectuée à l’aide d’un logiciel de traitement d’images accessible au public. Les protocoles présentés sont utilisés pour quantifier le nombre et la taille des adhérences focales et les différences dans la distribution de la forme cellulaire dans les monocouches, mais ils peuvent être réutilisés pour la quantification de la taille et de la forme de toute autre structure cellulaire distincte qui peut être tachée (p. ex., mitochondries ou noyaux). L’évaluation de ces paramètres est importante dans la caractérisation des forces dynamiques dans la couche cellulaire adhérente, y compris l’adhérence cellulaire et la contractilité de l’actomyosine qui affecte la forme cellulaire.

Analyse focale de l’adhérence Le knockdown du gène HAX1 a été précédemment montré pour affecter les adhérences focales6. Les cellules ont été cultivées sur la surface enduite de collagène I pendant 48 h. Des images des cellules témoins MCF7 et des cellules MCF7 avec un knockdown HAX1 (HAX1 KD) de trois expériences indépendantes tachées de paxilline de protéine d’adhérence focale ont été obtenues à l’aide d’un microscope co...

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Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

L’article décrit la quantification de 1) la taille et le nombre d’adhérences focales et 2) l’indice de forme cellulaire et sa distribution à partir d’images confocales des monocouches confluentes des cellules MCF7.

Quantification des distributions de zone d’adhérence cellule-substrat et de forme cellulaire dans les monocouches cellulaires MCF7

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Ce protocole permet la quantification de la zone, du périmètre et de la forme de la structure intracellulaire à partir de son image bidimensionnelle. Cette technique est rapide et facile, ne nécessite que des réglages de laboratoire standard et un microscope confocal et utilise un logiciel opensource. Anna Balcerak, doctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure.Commencez par ensemencement quatre fois 10 à la cinquième cellule dans 0,5 millilitres de milieu de culture par puits dans un collagène de quatre puits une diapositive de chambre enduite pour une culture de 24 heures dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et cinq degrés. Le lendemain matin, utilisez un microscope optique inversé pour vérifier la présence d’au moins 90 % de monocouche confluente et utilisez un microscope confocal pour obtenir des images en tranches Z. Pour l’analyse de l’adhérence focale, ouvrez les images d’ImageJ et sélectionnez analyser, définir l’échelle, supprimer l’échelle et global pour définir l’échelle d’image en pixels.Pour inclure le nom de fichier et la zone de la région d’intérêt dans les options de mesure, cliquez sur analyser et définir les mesures et vérifiez la zone et affichez les options d’étiquette. Pour soustraire l’arrière-plan, sélectionnez le processus et soustrayez l’arrière-plan. Réglez le rayon de la boule roulante à 50 pixels et vérifiez le paraboloïde coulissant.Pour déterminer la zone de la plus petite région d’intérêt, décrivons la plus petite adhérence focale et cliquez sur analyser et mesurer pour mesurer la zone. Lorsqu’au moins 20 régions d’intérêt ont été sélectionnées et mesurées, calculer et enregistrer la moyenne des résultats obtenus. Réglez la limite supérieure à 25 % d’une zone cellulaire typique.Pour conférer l’image au binaire, cliquez sur l’image, ajustez et seuilz, et vérifiez par défaut, noir et blanc, et fond foncé. Pour mesurer le nombre et les zones des régions d’intérêt, sélectionnez analyser et analyser les unités de particules et de pixels, afficher les résultats, obtenir des résultats clairs et résumer. Transférez les données de taille moyenne de la tranche, du nombre et de la superficie totale de la fenêtre récapitulatif au programme de gestion des données de choix.Pour la quantification de l’adhérence focale, ouvrez l’adhérence focale ImageJ macro et entrez dans la zone de la plus petite région d’intérêt comme zone de la plus petite région de paramètre d’intérêt. Réglez la valeur de type seuil à manuelle ou automatique et enregistrez les modifications. Ensuite, appelez la macro d’ImageJ et sélectionnez l’image à traiter.Pour l’analyse manuelle de la forme des cellules, ouvrez une image dans un logiciel de traitement d’image approprié et sélectionnez les paramètres à mesurer. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour délimité manuellement les bordures cellulaires marquées par les protéines de jonction de choix. Les paramètres choisis seront automatiquement calculés pour chaque cellule.Lorsque toutes les cellules ont été décrites, sélectionnez modifier, sélectionner et ajouter au gestionnaire. Seules les cellules entièrement visibles complètes avec des bordures ininterrompues doivent être sélectionnées. Pour effectuer la mesure, marquez tous les numéros apparaissant dans la boîte gauche du gestionnaire de la région d’intérêt et cliquez sur la mesure.Les résultats apparaîtront dans la boîte de résultats et peuvent être importés sur la feuille de calcul de choix. L’analyse cellulaire automatisée facilite la quantification du grand nombre de cellules. Pour chaque nouveau type de cellule, exécutez d’abord la macro pour établir des paramètres.Lorsque la macro est terminée, sélectionnez définir les limites de taille des cellules. Cliquez sur l’étiquette des cellules les plus petites et les plus grandes et cliquez sur mesurer. Définissez la valeur de la plus petite cellule et des plus grandes variables cellulaires et enregistrez les modifications.Fermez toutes les fenêtres macro et sélectionnez l’image à traiter en gris. Ensuite, exécutez la macro à nouveau. La macro fournira un tableau des résultats qui inclut l’indice de forme cellulaire, le rapport d’aspect et les données de liste des régions de sélection d’intérêt.Ici, des images représentatives des adhérences focales comptées avec ImageJ, y compris les contours numérotés finaux et les superpositions des contours d’adhérence focale avec l’image originale pour les lignes cellulaires de contrôle et de knockdown peuvent être observées. Comme illustré dans cette analyse, les cellules knockdown ont démontré un plus grand nombre d’adhérences par cellule aussi bien que des adhérences qui sont plus grandes dans la taille comparée aux cellules de ligne de cellules de contrôle. Dans ces images, des régions représentatives de monocouches cellulaires non traitées et traitées par chimiothérapie sont montrées.Les cellules de contour ont été caractérisées en fonction de leurs valeurs d’index de forme cellulaire, par exemple dans cette analyse montrant une augmentation dans le dernier bac et un aplatissement des pics principaux pour les cellules médicamenteuses par rapport aux contrôles non traités. Une distribution de fréquences et une distribution cumulative pourraient alors être générées pour chaque culture cellulaire. L’imagerie à échelle grise des monocouches, telle qu’elle a été démontrée, a permis l’analyse et la quantification de 512 cellules provenant de 12 champs de vision révélant une répartition relative de la fréquence de l’indice de forme cellulaire.Pour que ce protocole fonctionne, il est important d’utiliser des images de la meilleure qualité possible. Un ensemencement, une coloration et une imagerie cellulaires appropriés devraient assurer des images d’une qualité expérimentale suffisante.

Research

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Biology

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