Name: quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Nazionale Scientifico Polacco sotto la concessione n. 2014/14/M/ NÀ1/00437.

1. Passi preparatori
<ol><li>Semina cellulare per ottenere monostrati confluenti<ol>
<li>Prima della seminazione, ricoprire i pozze di uno scivolo camera 4-pozzi con collagene I (o altro componente ECM di scelta). Per il rivestimento i collagene, seguire un protocollo commerciale: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html ad una concentrazione di 8 g/cm2.</li>
		<li>Seme 400.000 cellule ad un pozzo di uno scivolo a 4 camere.</li>
		<li>Coltura le cellu...

<ol>
	<li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion.">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006 (2016).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).</li><li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours.">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP,+a+bisphenol+A+analog,+as+a+novel+AR+down-regulator.">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAX1+impact+on+collective+cell+migration,+cell+adhesion,+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility.">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li><li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+analysis+of+cell,+nucleus+and+focal+adhesion+morphology.">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).</li><li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics,+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour.">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707 (2016).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration.">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images.">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients.">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li><li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces.">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li></ol>

L'adesione cellulare e substrato cellulare costituiscono attributi intrinseci delle cellule epiteliali e svolgono il ruolo critico nella morfogenesi dei tessuti e nell'embriogenesi. Nei tessuti adulti la corretta regolazione delle proprietà meccaniche dello strato cellulare è cruciale per mantenere l'omeostasi e prevenire le risposte patologiche come la progressione del tumore e la metastasi. La dimensione e il numero di adere focali dipendono dalla forza dell'adesione delle cellule-substrato, mentre la forma cellulare...

I monostrati cellulari epiteliali agiscono come un collettivo in cui l'adesione cellulare e substrato cellulare, così come le forze e le tensioni contrattuali rappresentano parametri importanti e il loro corretto equilibrio contribuisce all'integrità complessiva dell'unità1,2,3. Pertanto, la valutazione di questi parametri rappresenta un modo per stabilire lo stato corrente del livello della cella.
I due metodi qui descritti rappresentano un'analisi bidimensionale dei monostrati confluenti delle cellule epiteliali aderenti (in questo caso la linea cellulare del cancro al seno MCF7). L'analisi viene eseguita utilizzando immagini confocali (singole sezioni z) provenienti da diverse regioni sull'asse z; regione basale vicino a un substrato per misurazioni di adesione focale (FA) e regione apicale per le misurazioni della forma delle cellule. I metodi presentati sono relativamente semplici e richiedono tecniche di laboratorio standard e software open-source. La microscopia confocale è sufficiente per questo protocollo, quindi può essere eseguita senza utilizzare una microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) più specializzata. Pertanto, il protocollo potrebbe essere implementato in un ambiente di laboratorio relativamente standard. Anche se l'accuratezza dei metodi è limitata, possono distinguere le differenze di base nell'adesione focale e nella forma delle cellule.
Entrambi i metodi qui descritti consistono nelle procedure sperimentali standard come la coltura cellulare, l'immunostaining, l'imaging confocale e l'analisi delle immagini eseguite utilizzando ImageJ. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi software di elaborazione delle immagini con le funzioni appropriate. I metodi presentati possono monitorare e confrontare i cambiamenti inflitti dal trattamento farmacologico o dalla modificazione genetica minima. Non è consigliabile ottenere valori definiti, a causa della precisione limitata di questi metodi. Sono state incluse due macro automatizzate, per facilitare le misurazioni di molte immagini.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>goat anti-rabbit, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junction plakoglobin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2309S</td>
			<td>rabbit, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow cabinet class 2</td>
			<td>Alpina</td>
			<td></td>
			<td>standard equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td>
			<td>Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019</td>
			<td></td>
			<td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 cell line (CONTROL)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td>epithelial, adherent breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CK2 light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paxillin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>rabbit, 1:250, Y113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers

I metodi qui presentati quantificano alcuni parametri dei monostrati cellulari aderenti confluenti da più immagini confocali opportunamente macchiate: adesione al substrato in funzione del numero e delle dimensioni delle adere focali e della forma cellulare, caratterizzata dall'indice di forma cellulare e da altri descrittori di forma. Le adesioni focali sono state visualizzate dalla colorazione paxillin a zintillina e i confini delle cellule cellulari sono stati contrassegnati da plakoglobina di giunzione e actina. I metodi per la coltura cellulare e la colorazione erano standard; le immagini rappresentano singoli piani focali; l'analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando un software di elaborazione delle immagini disponibile pubblicamente. I protocolli presentati vengono utilizzati per quantificare il numero e le dimensioni delle ademonie focali e le differenze nella distribuzione della forma cellulare nei monostrati, ma possono essere riutilizzati per la quantificazione delle dimensioni e della forma di qualsiasi altra struttura cellulare distinta che può essere macchiata (ad esempio, mitocondri o nuclei). La valutazione di questi parametri è importante nella caratterizzazione delle forze dinamiche nello strato cellulare aderente, compresa l'adesione cellulare e la contrattiglio anomiosina che influenza la forma delle cellule.

Analisi dell'adesione focale L'abbattimenti del gene HAX1 è stato precedentemente dimostrato che influisce sulle aderene focali6. Le cellule sono state coltivate sulla superficie rivestita di collagene I per 48 h. Le immagini delle cellule di controllo MCF7 e MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) da tre esperimenti indipendenti macchiati con la colossione della proteina aderente paxillin sono stati ottenuti utilizzando un microscopio confocale (immagi...

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Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

L'articolo descrive la quantificazione di 1) le dimensioni e il numero di adereni focali e 2) l'indice di forma cellulare e la sua distribuzione da immagini confocali dei monostrati confluenti delle cellule MCF7.

Quantificazione dell'area di adesione del substrato cellulare e della distribuzione delle forme cellulari nei monostrati cellulari MCF7

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Questo protocollo consente la quantificazione dell'area, del perimetro e della forma della struttura intracellulare dalla sua immagine bidimensionale. Questa tecnica è semplice e veloce, richiede solo impostazioni di laboratorio standard e un microscopio confocale e utilizza software opensource. A dimostrare la procedura sarà Anna Balcerak, dottoranda del mio laboratorio.Inizia seminando quattro volte 10 alla quinta cellule in 0,5 millilitri di mezzo di coltura per pozzo in uno scivolo a camera rivestita di collagene a quattro po po 'per una coltura di 24 ore in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e cinque gradi. La mattina seguente, utilizzare un microscopio ottico invertito per verificare la presenza di almeno il 90% di monostrato confluente e utilizzare un microscopio confocale per ottenere singole immagini a z-slice. Per l'analisi dell'adesione focale, aprite le immagini in ImageJ e selezionate analizza, impostate la scala, rimuovete la scala e globali per impostare la scala dell'immagine in pixel.Per includere il nome del file e l'area dell'area di interesse nelle opzioni di misurazione, fare clic su analizza e imposta misurazioni e controllare l'area e visualizzare le opzioni dell'etichetta. Per sottrarre lo sfondo, selezionare il processo e sottrarre lo sfondo. Impostare il raggio della palla rotolante su 50 pixel e controllare il paraboloide scorrevole.Per determinare l'area della regione di interesse più piccola, delineare la più piccola adesione focale singola e fare clic su analizza e misura per misurare l'area. Quando sono state selezionate e misurate almeno 20 regioni di interesse, calcolare e salvare la media dei risultati ottenuti. Impostare il limite superiore sul 25% di un'area di cella tipica.Per conferire l'immagine al binario, fare clic su immagine, regolare e soglia e controllare lo sfondo predefinito, bianco e nero e scuro. Per misurare il numero e le aree delle aree di interesse, selezionare analizza e analizzare le particelle e controllare le unità di pixel, visualizzare i risultati, cancellare i risultati e riepilogare. Trasferire i dati relativi alla dimensione media della sezione, del conteggio e dell'area totale dalla finestra di riepilogo al programma di gestione dei dati preferito.Per la quantificazione dell'adesione focale, aprire la macro ImageJ di adesione focale ed entrare nell'area della regione di interesse più piccola come area della più piccola regione di interesse. Impostare il valore del tipo di soglia su manuale o automatico e salvare le modifiche. Quindi chiama la macro da ImageJ e seleziona l'immagine da elaborare.Per l'analisi manuale della forma delle celle, aprire un'immagine in un programma software di elaborazione delle immagini appropriato e selezionare i parametri da misurare. Utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per delineare manualmente i bordi delle celle contrassegnati dalle proteine di giunzione scelte. I parametri scelti verranno calcolati automaticamente per ogni cella.Dopo aver delineato tutte le celle, selezionare Modifica, selezione e aggiunta a Manager. È necessario selezionare solo le celle completamente visibili complete con bordi ininterrotti. Per effettuare la misurazione, contrassegnare tutti i numeri visualizzati nella casella sinistra del gestore dell'area di interesse e fare clic su misura.I risultati verranno visualizzati nella casella dei risultati e possono essere importati nel foglio di calcolo preferito. L'analisi automatizzata delle cellule facilita la quantificazione del gran numero di cellule. Per ogni nuovo tipo di cella, eseguire innanzitutto la macro per stabilire i parametri.Al termine della macro, selezionare Imposta limiti dimensioni cella. Fare clic sull'etichetta delle celle più piccole e più grandi e fare clic su misura. Impostare il valore della cella più piccola e delle variabili di cella più grandi e salvare le modifiche.Chiudere tutte le finestre macro e selezionare l'immagine da elaborare in scala di grigi. Quindi eseguire di nuovo la macro. La macro fornirà una tabella dei risultati che include l'indice della forma della cella, le proporzioni e i dati dell'elenco delle selezioni delle aree di interesse.Qui, è possibile osservare immagini rappresentative delle aderenze focali contate con ImageJ, inclusi i contorni numerati finali e le sovrapposizioni dei contorni dell'adesione focale con l'immagine originale sia per le linee cellulari di controllo che knockdown. Come illustrato in questa analisi, le cellule knockdown hanno dimostrato un numero maggiore di aderenze per cella e aderenze di dimensioni maggiori rispetto alle celle di linea cellulare di controllo. In queste immagini vengono mostrate regioni rappresentative di monostrati cellulari non trattati e trattati chemioterapici.Le cellule contorno sono state caratterizzate in base ai loro valori di indice della forma cellulare, ad esempio in questa analisi che mostra un aumento dell'ultimo contenitore e un appiattimento dei picchi principali per le cellule trattate con farmaci rispetto ai controlli non trattati. Una distribuzione di frequenza e una distribuzione cumulativa potrebbero quindi essere generate per ogni coltura cellulare. L'imaging in scala di grigi dei monostrati come dimostrato ha permesso l'analisi e la quantificazione di 512 cellule da 12 campi visivo rivelando una distribuzione relativa della frequenza dell'indice della forma cellulare.Affinché questo protocollo funzioni, è importante utilizzare immagini della migliore qualità possibile. Una corretta semina cellulare, colorazione e imaging dovrebbero garantire immagini di qualità sperimentale sufficiente.

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