Name: quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00
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この研究は、ポーランド国立科学センターによって助成金第2014/14/M/NZ1/00437の下で支援されました。

1. 準備手順
<ol><li>コンフルエント単層を得るための細胞播種<ol>
<li>播種する前に、4ウェルのチャンバースライドのウェルにコラーゲンI(または選択した他のECM成分)をコーティングします。コラーゲンIコーティングの場合は、市販のプロトコルに従ってください:https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html濃度8 μg/cm2.</li>
		<li>4ウェルチャンバースライ?...

<ol>
	<li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion.">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006 (2016).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).</li><li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours.">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP,+a+bisphenol+A+analog,+as+a+novel+AR+down-regulator.">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAX1+impact+on+collective+cell+migration,+cell+adhesion,+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility.">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li><li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+analysis+of+cell,+nucleus+and+focal+adhesion+morphology.">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).</li><li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics,+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour.">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707 (2016).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration.">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images.">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients.">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li><li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces.">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li></ol>

細胞細胞および細胞基質接着は、上皮細胞の固有の属性を構成し、組織形態形成および遺伝子形成において重要な役割を果たす。成人組織では、細胞層の機械的特性の適切な調節は、恒常性を維持し、腫瘍の進行および転移のような病理学的応答を予防する上で極めて重要である。焦点接着の大きさと数は細胞-基体接着の強さに依存し、細胞形状は収縮力に依存し、細胞-細胞接触の状態に?...

上皮細胞単層は、細胞細胞および細胞基質接着ならびに収縮力および緊張が重要なパラメータを表,し、それらの適切なバランスがユニット1、2、32の全体的な完全性に寄与する集団として作用する1。3したがって、これらのパラメータを評価することは、セル層の現在の状態を確立する方法を表す。
ここで説明する2つの方法は、接着性、上皮細胞(この場合はMCF7乳癌細胞株)のコンフルエント単層の2次元分析を表す。解析は、Z 軸上の異なる領域の共焦点画像 (単一の Z スライス) を使用して実行されます。基底領域は、細胞形状測定のための焦点接着(FA)測定のための基質および尖体領域の近く。提示された方法は比較的簡単で、標準的な実験室の技術とオープンソースソフトウェアを必要とします。このプロトコルでは共焦点顕微鏡で十分であるため、より専門的なTIRF(全内部反射蛍光)顕微鏡を採用することなく実行できます。したがって、プロトコルは比較的標準的な実験室の設定で実装することができる。方法の精度は限られているが、焦点接着と細胞形状の基本的な違いを区別することができる。
ここで説明する両方の方法は、ImageJを使用して行われる細胞培養、免疫染色、共焦点イメージング、画像解析などの標準的な実験手順で構成されています。ただし、適切な機能を持つ任意の画像処理ソフトウェアを使用することができます。提示された方法は、薬理学的治療または最小限の遺伝子組み換えによって引き起こされた変化を追跡し、比較することができます。これらのメソッドの精度が限られているため、明確な値を取得することはお勧めしません。2つの自動化されたマクロが含まれ、多くの画像の測定を容易にしました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>goat anti-rabbit, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junction plakoglobin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2309S</td>
			<td>rabbit, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow cabinet class 2</td>
			<td>Alpina</td>
			<td></td>
			<td>standard equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td>
			<td>Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019</td>
			<td></td>
			<td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 cell line (CONTROL)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td>epithelial, adherent breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CK2 light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paxillin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>rabbit, 1:250, Y113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers

ここで提示される方法は、複数の適切に染色された共焦点画像からコンフルエント付着細胞単層のいくつかのパラメータを定量化する:焦点接着の数と大きさの関数としての基質への接着、および細胞形状、細胞形状指数および他の形状記述子によって特徴付けられる。パクシリン染色によって焦点付着を可視化し、細胞-細胞の境界を接合プラコグロビンとアクチンによって特徴づけた。細胞培養と染色の方法は標準的であった。画像は単一の焦点面を表します。画像解析は、一般に公開されている画像処理ソフトウェアを使用して行った。提示されたプロトコルは、単層の焦点接着の数と大きさおよび細胞形状分布の違いを定量化するために使用されるが、染色することができる他の細胞構造(例えば、ミトコンドリアまたは核)のサイズおよび形状の定量化のために再利用することができる。これらのパラメータを評価することは、細胞の形状に影響を与える細胞接着およびアトミオシン収縮性を含む、接着細胞層における動的力の特性評価において重要である。

焦点接着解析 HAX1遺伝子のノックダウンは、以前に焦点接着に影響を与えることを示した6.細胞を48時間のコラーゲンIコーティング表面上で培養した。焦点接着性タンパク質パキシリンで染色した3つの独立実験からHAX1ノックダウン(HAX1 KD)を有するMCF7対照細胞とMCF7細胞の画像を、共焦点顕微鏡を用いて得た(基底領域からの単焦点面/Zスライ...

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Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

本稿では、1)焦点接着のサイズと数および2)細胞形状指標およびMCF7細胞のコンラエント単層の共焦点画像からの分布の定量化について説明する。

MCF7細胞単層における細胞基質接着面積と細胞形状分布の定量化

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

このプロトコルは、その2次元画像から細胞内構造の面積、周長、形状の定量化を可能にする。この技術は、迅速かつ簡単で、唯一の標準的な実験室の設定と共焦点顕微鏡を必要とし、オープンソースソフトウェアを使用しています。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、アンナ・バルセラクです。摂氏37度と5度の二酸化炭素インキュベーターで24時間培養するために、4ウェルコラーゲン1コーティングチャンバースライドで、ウェルあたり0.5ミリリットルの培養培地に10〜5番目の細胞を4回播種することから始めます。翌朝、光学反転顕微鏡を使用して、少なくとも90%コンフルエント単層の存在を確認し、共焦点顕微鏡を使用して単一のZスライス画像を得る。焦点接着解析では、ImageJ で画像を開き、解析、尺度の設定、尺度の削除、およびグローバルを選択して、イメージのスケールをピクセル単位で設定します。計測オプションに対象領域のファイル名と領域を含めるには、[解析]をクリックして測定値を設定し、面積と表示ラベルオプションを確認します。背景を減算するには、プロセスを選択し、背景を減算します。ローリングボールの半径を50ピクセルに設定し、スライド式放物線をチェックします。関心の最小領域の面積を決定するには、最小の単一焦点接着を概説し、分析をクリックして面積を測定します。対象となる領域が少なくとも 20 個選択され、測定された場合は、得られた結果の平均値を計算して保存します。上部境界を一般的なセル領域の 25% に設定します。画像をバイナリに付与するには、画像、調整、およびしきい値をクリックし、デフォルト、白黒、および暗い背景を確認します。対象領域の数と領域を測定するには、粒子の解析と分析を選択してピクセル単位を確認し、結果を表示し、結果をクリアし、集計します。スライス、カウント、および合計エリア平均サイズデータを要約ウィンドウから選択したデータ管理プログラムに転送します。焦点接着定量のために、焦点接着ImageJマクロを開き、関心の最小領域パラメータの面積として関心の最小領域の領域を入力します。しきい値の種類の値を手動または自動に設定し、変更を保存します。次に、ImageJ からマクロを呼び出し、処理するイメージを選択します。手動のセル形状解析では、適切な画像処理ソフトウェアプログラムで画像を開き、測定するパラメータを選択します。フリーハンド選択ツールを使用して、選択した結合タンパク質によってマークされたセル境界を手動で線分します。選択したパラメータは、セルごとに自動的に計算されます。すべてのセルのアウトラインが作成されたら、[編集]、[選択]、および [マネージャに追加] を選択します。罫線が途切れない完全な可視セルのみを選択する必要があります。測定を行う場合は、関心領域マネージャーの左側のボックスに表示されるすべての数値をマークし、[メジャー] をクリックします。結果は結果ボックスに表示され、選択したスプレッドシートにインポートできます。自動化された細胞分析は多数の細胞の定量化を促進する。新しいセルの種類ごとに、まずマクロを実行してパラメータを設定します。マクロが終了したら、[セル サイズの境界を設定する] を選択します。最小セルと最大セルのラベルをクリックし、[メジャー] をクリックします。最小セルと最大セル変数の値を設定し、変更を保存します。すべてのマクロ ウィンドウを閉じ、グレースケールで処理するイメージを選択します。その後、マクロを再実行します。このマクロは、セル図形のインデックス、縦横比、および対象となる選択リスト データの領域を含む結果のテーブルを提供します。ここで、最終的な番号のアウトラインと、コントロールとノックダウンの両方の細胞線の元の画像を持つ焦点接着の輪郭のオーバーレイを含むImageJでカウントされた焦点接着の代表的な画像が観察できる。この分析で示されるように、ノックダウン細胞は、コントロールセルライン細胞と比較して、より大きなサイズの接着と同様に、細胞あたりの接着の数が多いことを実証しました。これらの画像では、未治療および化学療法的に処置された細胞単層の代表的領域が示されている。この分析では、この分析では、最後のビンの増加と、薬物処理された細胞の主ピークの平坦化を未治療の対照と比較して、それらの細胞形状の指標値に従って特徴付けた。その後、各細胞培養に対して周波数分布と累積分布を生成できます。実演したように単層のグレースケールイメージングは、12の視野から512個の細胞の分析と定量を可能にし、細胞形状指数の相対的な周波数分布を明らかにした。このプロトコルを動作させるためには、可能な限り最高の品質のイメージを使用することが重要です。適切な細胞の播種、染色、およびイメージングは、十分な実験品質の画像を確保する必要があります。

Research

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Biology

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