Name: quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av det polske nasjonale vitenskapssenteret under tilskudd nr.

1. Forberedende trinn
<ol><li>Cellesåing for å oppnå samløpet monolag<ol>
<li>Før seeding, belegge brønnene i en 4-brønns kammer lysbilde med kollagen I (eller annen ECM komponent av valget). For kollagen jeg belegg, følg en kommersiell protokoll: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html med en konsentrasjon på 8 μg/cm2.</li>
		<li>Seed 400.000 celler til en brønn av en 4-brønn kammer lysbilde.</li>
		<li>Kultur cellene i 24 timer (eller l...

<ol>
	<li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion.">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006 (2016).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).</li><li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours.">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP,+a+bisphenol+A+analog,+as+a+novel+AR+down-regulator.">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAX1+impact+on+collective+cell+migration,+cell+adhesion,+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility.">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li><li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+analysis+of+cell,+nucleus+and+focal+adhesion+morphology.">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).</li><li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics,+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour.">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707 (2016).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration.">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images.">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients.">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li><li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces.">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li></ol>

Cellecelle- og cellesubstratadhesjon utgjør iboende attributter av epitelcellene og spiller den kritiske rollen i vevmorfogenese og embriogenese. I voksent vev er riktig regulering av mekaniske egenskaper av cellelaget avgjørende for å opprettholde homeostase og forhindre patologiske reaksjoner som tumorprogresjon og metastase. Størrelsen og antall fokale adhesjoner avhenger av styrken av celle-substrat vedheft, mens celleform avhenger av kontraktile krefter og er relatert til statusen for celle-celle-kontakter.
...

Epitelcellemonolag fungerer som et kollektiv der cellecelle- og cellesubstratvedheft samt kontraktile krefter og spenninger representerer viktige parametere, og deres riktige balanse bidrar til enhetens samlede integritet1,,2,,3. Dermed representerer vurdering av disse parametrene en måte å etablere gjeldende status for cellelaget.
De to metodene som er beskrevet her representerer en todimensjonal analyse av de samfalter monolager av tilhenger, epitelceller (i dette tilfellet MCF7 brystkreftcellelinje). Analysen utføres ved hjelp av konfuserte bilder (enkelt Z-skiver) fra forskjellige regioner på Z-aksen; basalområdet nær et substrat for fokale vedheft (FA) målinger og apikal region for celleform målinger. De presenterte metodene er relativt enkle og krever standard laboratorieteknikker og åpen kildekode-programvare. Konfisk mikroskopi er tilstrekkelig for denne protokollen, slik at den kan utføres uten å bruke mer spesialisert TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopi. Dermed kan protokollen implementeres i en relativt standard laboratorieinnstilling. Selv om nøyaktigheten av metodene er begrenset, kan de skille grunnleggende forskjeller i fokal vedheft og celleform.
Begge metodene som er beskrevet her består av standard eksperimentelle prosedyrer som cellekultering, immunstoppnåelse, konfikal bildebehandling og bildeanalyse utført ved hjelp av ImageJ. Imidlertid kan enhver bildebehandlingsprogramvare med de riktige funksjonene brukes. De presenterte metodene kan spore og sammenligne endringer påført av farmakologisk behandling eller minimal genetisk modifikasjon. Å skaffe bestemte verdier anbefales ikke, på grunn av den begrensede presisjonen til disse metodene. To automatiserte makroer ble inkludert, for å lette målingene av mange bilder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>goat anti-rabbit, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junction plakoglobin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2309S</td>
			<td>rabbit, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow cabinet class 2</td>
			<td>Alpina</td>
			<td></td>
			<td>standard equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td>
			<td>Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019</td>
			<td></td>
			<td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 cell line (CONTROL)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td>epithelial, adherent breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CK2 light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paxillin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>rabbit, 1:250, Y113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers

Metodene som presenteres her kvantifisere noen parametere for samflytende tilhengercellemonolag fra flere passende fargede konsernbilder: vedheft til substratet som en funksjon av antall og størrelse på fokale adhesjoner, og celleform, preget av celleformindeksen og andre formbeskrivelser. Fokale adhesjoner ble visualisert av paxillin farging og cellecellegrenser var preget av kobling plakoglobin og actin. Metodene for cellekultur og farging var standard; bilder representerer enkelt fokale plan; bildeanalyse ble utført ved hjelp av offentlig tilgjengelig bildebehandlingsprogramvare. De presenterte protokollene brukes til å kvantifisere antall og størrelse på fokale adhesjoner og forskjellene i celleformfordeling i monolayers, men de kan brukes på nytt for kvantifisering av størrelsen og formen på enhver annen distinkt cellulær struktur som kan farges (f.eks mitokondrier eller kjerner). Å vurdere disse parametrene er viktig i karakteriseringen av de dynamiske kreftene i tilhengercellelag, inkludert celleadhesjon og actomyosin-kontraktilitet som påvirker celleformen.

Fokal vedheft analyse Knockdown av HAX1 genet ble tidligere vist å påvirke fokal adhesjoner6. Celler ble dyrket på kollagen I-belagt overflate for 48 h. Bilder av MCF7 kontrollceller og MCF7 celler med en HAX1 knockdown(HAX1 KD) fra tre uavhengige eksperimenter farget med fokal vedheft protein paxillin ble oppnådd ved hjelp av et konfusikalt mikroskop (bilde fra enkelt fokal plan / Z-skive fra basal region). FAs fra ca 2000-2500 celler fra hver ce...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

Artikkelen beskriver kvantifisering av 1) størrelsen og antall fokale adhesjoner og 2) celleformindeks og dens distribusjon fra konsantbilder av de sammenføyte monolagerne til MCF7-celler.

Kvantifisering av celle-substrat vedheft område og celle form distribusjoner i MCF7 celle monolayers

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Denne protokollen muliggjør kvantifisering av området, omkretsen og formen på intracellulær struktur fra det todimensjonale bildet. Denne teknikken er rask og enkel, krever bare standard laboratorieinnstillinger og et konfokalt mikroskop og bruker opensource programvare. Å demonstrere prosedyren vil være Anna Balcerak, en ph.d.-student fra laboratoriet mitt.Begynn med å så fire ganger 10 til de femte cellene i 0,5 milliliter kulturmedium per brønn i en fire-brønn kollagen ett belagt kammer lysbilde for en 24-timers kultur i en 37 grader Celsius og fem graders karbondioksid inkubator. Neste morgen bruker du et optisk invertert mikroskop for å bekrefte tilstedeværelsen av minst 90 % sammenføyd monolag og bruke et konfokalt mikroskop for å få enkle Z-skiver. For fokal vedheftsanalyse åpner du bildene i ImageJ og velger analyser, angir skala, fjerner skala og global for å angi bildeskalaen i piksler.Hvis du vil inkludere filnavnet og området for interesseområdet i målealternativene, klikker du analyser og angir målinger og kontrollerer alternativene for området og visningsetiketten. Hvis du vil trekke fra bakgrunnen, velger du prosess og trekker fra bakgrunn. Sett rullende kuleradius til 50 piksler og sjekk glidende paraboloid.Hvis du vil bestemme området i det minste interesseområdet, skisserer du den minste enkeltfokus vedheft og klikker analyser og mål for å måle området. Når minst 20 interesseregioner er valgt og målt, beregner og lagrer du gjennomsnittet for de oppnådde resultatene. Angi den øvre grensen til 25 % av et vanlig celleområde.Hvis du vil overdra bildet til binært, klikker du bilde, justering og terskel, og kontrollerer standard, svart-hvitt og mørk bakgrunn. Hvis du vil måle antall og områder av interesseområdene, velger du analyser og analyserer partikkel- og kontrollpikselenheter, viser resultater, tydelige resultater og oppsummerer. Overfør de gjennomsnittlige størrelsesdataene for sektor, antall og totalareal i gjennomsnittsstørrelse fra sammendragsvinduet til det du velger som dataadministrerende program.For brennvidde for fokal vedheft åpner du den fokale adhesjonsbildeJ-makroen og angir området i det minste interesseområdet som område for den minste område av interesseparameter. Angi terskeltypeverdien til manuell eller automatisk, og lagre endringene. Ring deretter makroen fra ImageJ og velg bildet som skal behandles.For manuell celleformanalyse åpner du et bilde i et passende bildebehandlingsprogram og velger parameterne som skal måles. Bruk frihåndsvalgverktøyet til å manuelt avgrense cellekantlinjene som merket av de knutepunktsproteinene du ønsker. De valgte parameterne beregnes automatisk for hver celle.Når alle cellene er skissert, velger du Rediger, valg og legg til i leder. Bare fullstendige helt synlige celler med uavbrutte kantlinjer bør velges. Hvis du vil gjøre målingen, merker du alle tallene som vises i venstre boks i interesseområdet og klikker mål.Resultatene vises i resultatboksen og kan importeres til det du velger. Automatisert celleanalyse forenkler kvantifisering av det store antallet celler. Kjør først makroen for hver ny celletype for å opprette parametere.Når makroen er ferdig, velger du angi grenser for cellestørrelse. Klikk etiketten på de minste og største cellene, og klikk mål. Angi verdien for den minste cellen og de største cellevariablene, og lagre endringene.Lukk alle makrovinduene, og velg bildet som skal behandles i gråtoner. Kjør deretter makroen på nytt. Makroen vil gi en tabell over resultatene som inkluderer cellefigurindeksen, størrelsesforholdet og områdene med interessevalglistedata.Her kan representative bilder av fokale adhesjoner telles med ImageJ, inkludert de endelige nummererte konturene og overleggene av fokale vedheftsdisposisjoner med det opprinnelige bildet for både kontroll- og knockdown-cellelinjene, observeres. Som illustrert i denne analysen viste knockdown-cellene et høyere antall adhesjoner per celle, samt adhesjoner som er større i størrelse sammenlignet med kontrollcellelinjeceller. På disse bildene vises representative regioner av ubehandlede og kjemoterapeutisk behandlede cellemonolag.Disposisjonscellene ble karakterisert i henhold til deres celleformindeksverdier, for eksempel i denne analysen som viser en økning i den siste beholderen og en utflating av hovedtoppene for de legemiddelbehandlede cellene sammenlignet med ubehandlede kontroller. En frekvensfordeling og kumulativ distribusjon kan deretter genereres for hver cellekultur. Gråtoneavbildning av monolagene som demonstrert tillot analyse og kvantifisering av 512 celler fra 12 synsfelt som avslører en relativ frekvensfordeling av celleformindeksen.For at denne protokollen skal fungere, er det viktig å bruke bilder av best mulig kvalitet. Riktig cellesåing, farging og bildebehandling bør sikre bilder av tilstrekkelig eksperimentell kvalitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-indusert Kalsium wave forplantning i cellemonolagene: The Eksempel på storfe Hornhinnen endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantifisering av krystallinsk cellulose akkumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots å overvåke Tissue-spesifikke Cell Wall Modifikasjoner

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analysere Cell Surface Adhesjon Ombygging i Response til Mekanisk Tension Bruke magnetiske kuler

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Kvantifisering av interbakteriell konkurranse ved bruk av encellet fluorescensavbildning

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisere aggregert kvantifisering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...