Name: quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência polonês sob a concessão nº 2014/14/M/NZ1/00437.

1. Etapas preparatórias
<ol><li>Semeadura celular para obter monocamadas confluentes<ol>
<li>Antes de semear, cubra os poços de um escorregador de câmara de 4 poços com colágeno I (ou outro componente ECM de escolha). Para revestimento de colágeno I, siga um protocolo comercial: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html a uma concentração de 8 μg/cm2.</li>
		<li>Semente 400.000 células para um poço de um deslizamento de câmara de 4 poços.<...

<ol>
	<li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion.">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006 (2016).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).</li><li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours.">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP,+a+bisphenol+A+analog,+as+a+novel+AR+down-regulator.">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAX1+impact+on+collective+cell+migration,+cell+adhesion,+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility.">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li><li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+analysis+of+cell,+nucleus+and+focal+adhesion+morphology.">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).</li><li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics,+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour.">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707 (2016).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration.">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images.">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients.">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li><li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces.">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li></ol>

A adesão célula-célula e substrato celular constituem atributos inerentes às células epiteliais e desempenham o papel crítico na morfogênese tecidual e embriogênese. Nos tecidos adultos, a regulação adequada das propriedades mecânicas da camada celular é crucial na manutenção da homeostase e na prevenção de respostas patológicas como progressão do tumor e metástase. O tamanho e o número de aderências focais dependem da força da adesão do substrato celular, enquanto a forma celular depende das forç...

As monocamadas de células epiteliais atuam como um coletivo no qual a adesão célula-célula e substrato de células, bem como forças e tensões contratuais representam parâmetros importantes e seu equilíbrio adequado contribui para a integridade geral da unidade1,,2,,3. Assim, avaliar esses parâmetros representa uma forma de estabelecer o estado atual da camada celular.
Os dois métodos descritos aqui representam uma análise bidimensional das monocamadas confluentes de células epiteliais aderentes (neste caso, linha de células cancerígenas de mama MCF7). A análise é realizada utilizando-se imagens confocal (fatias Z únicas) de diferentes regiões do eixo Z; região basal perto de um substrato para medições de adesão focal (FA) e região apical para medições de forma celular. Os métodos apresentados são relativamente simples e requerem técnicas de laboratório padrão e software de código aberto. A microscopia confocal é suficiente para este protocolo, por isso pode ser realizada sem empregar microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (Fluorescência Interna Total). Assim, o protocolo poderia ser implementado em um ambiente de laboratório relativamente padrão. Embora a precisão dos métodos seja limitada, eles podem distinguir diferenças básicas na adesão focal e na forma celular.
Ambos os métodos descritos aqui consistem nos procedimentos experimentais padrão, como cultivo de células, imunostaining, imagem confocal e análise de imagem realizadas por meio do ImageJ. No entanto, qualquer software de processamento de imagem com as funções apropriadas pode ser usado. Os métodos apresentados podem rastrear e comparar alterações infligidas pelo tratamento farmacológico ou modificação genética mínima. A obtenção de valores definidos não é recomendada, devido à precisão limitada desses métodos. Duas macros automatizadas foram incluídas, para facilitar as medições de muitas imagens.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>goat anti-rabbit, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junction plakoglobin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2309S</td>
			<td>rabbit, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow cabinet class 2</td>
			<td>Alpina</td>
			<td></td>
			<td>standard equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td>
			<td>Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019</td>
			<td></td>
			<td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 cell line (CONTROL)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td>epithelial, adherent breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CK2 light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paxillin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>rabbit, 1:250, Y113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers

Os métodos aqui apresentados quantificam alguns parâmetros de monocamadas de células aderirentes confluentes de múltiplas imagens confocais adequadamente manchadas: adesão ao substrato em função do número e tamanho das aderências focais, e forma celular, caracterizada pelo índice de forma celular e outros descritores de forma. As aderências focais foram visualizadas pela coloração de paxillin e as bordas das células celulares foram marcadas pela plakoglobina de junção e actina. Os métodos de cultura celular e coloração eram padrão; as imagens representam planos focais únicos; a análise de imagens foi realizada utilizando-se software de processamento de imagens disponível publicamente. Os protocolos apresentados são usados para quantificar o número e o tamanho das aderências focais e as diferenças na distribuição de formas celulares nas monocamadas, mas podem ser reaproveitados para a quantificação do tamanho e forma de qualquer outra estrutura celular distinta que possa ser manchada (por exemplo, mitocôndrias ou núcleos). Avaliar esses parâmetros é importante na caracterização das forças dinâmicas na camada celular aderente, incluindo adesão celular e contratilidade de actomyosina que afeta a forma celular.

Análise de adesão focal O knockdown do gene HAX1 foi anteriormente mostrado para afetar as aderências focais6. As células foram cultivadas na superfície revestida de colágeno por 48 h. Imagens das células de controle MCF7 e células MCF7 com um knockdown HAX1 (HAX1 KD) de três experimentos independentes manchados com proteína de adesão focal paxillin foram obtidos usando um microscópio confocal (imagem de plano focal único/fatia Z da regi?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

O artigo descreve a quantificação de 1) o tamanho e o número de aderências focais e 2) índice de forma celular e sua distribuição a partir de imagens confocal das monocamadas confluentes das células MCF7.

Quantificação da área de adesão de substrato celular e distribuições de formas celulares em monocamadas de células MCF7

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Este protocolo permite quantificação da área, perímetro e forma de estrutura intracelular a partir de sua imagem bidimensional. Esta técnica é rápida e fácil, requer apenas configurações de laboratório padrão e um microscópio confocal e usa software de código aberto. Demonstrando o procedimento será Anna Balcerak, uma estudante de doutorado do meu laboratório.Comece semeando quatro vezes 10 a cinco células em 0,5 mililitros de cultura média por poço em um deslizamento de câmara revestido de colágeno de quatro poços para uma cultura de 24 horas em uma incubadora de 37 graus Celsius e cinco graus de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, use um microscópio óptico invertido para verificar a presença de pelo menos 90% de monocamada confluente e use um microscópio confocal para obter imagens únicas de fatia Z. Para análise de adesão focal, abra as imagens no ImageJ e selecione analisar, definir escala, remover escala e global para definir a escala de imagem em pixels.Para incluir o nome do arquivo e a área da região de interesse nas opções de medição, clique em analisar e definir medições e verificar as opções de área e etiqueta de exibição. Para subtrair o plano de fundo, selecione o processo e subtraia o plano de fundo. Defina o raio da bola rolando para 50 pixels e verifique o paraboloide deslizante.Para determinar a área da menor região de interesse, delineie a menor adesão focal única e clique em analisar e medir a área. Quando pelo menos 20 regiões de interesse forem selecionadas e medidas, calcule e salve a média dos resultados obtidos. Defina o limite superior para 25% de uma área celular típica.Para conferir a imagem ao binário, clique em imagem, ajuste e limiar e verifique o plano padrão, preto e branco e fundo escuro. Para medir o número e as áreas das regiões de interesse, selecione analisar e analisar partículas e verificar unidades de pixels, exibir resultados, resultados claros e resumir. Transfira os dados de tamanho médio da fatia, contagem e área total da janela de resumo para o programa de gerenciamento de dados de escolha.Para quantificação de adesão focal, abra a adesão focal ImageJ macro e entre na área da menor região de interesse como área da menor região de parâmetro de interesse. Defina o valor do tipo de limiar para manual ou automático e salve as alterações. Em seguida, ligue para a macro do ImageJ e selecione a imagem a ser processada.Para análise manual da forma de célula, abra uma imagem em um programa de software de processamento de imagem apropriado e selecione os parâmetros a serem medidos. Use a ferramenta de seleção à mão livre para delinear manualmente as bordas celulares como marcada pelas proteínas de junção de escolha. Os parâmetros escolhidos serão calculados automaticamente para cada célula.Quando todas as células tiverem sido delineadas, selecione editar, selecionar e adicionar ao gerenciador. Apenas células completamente visíveis com bordas ininterruptas devem ser selecionadas. Para fazer a medição, marque todos os números que aparecem na caixa esquerda da região de gerente de interesse e clique na medida.Os resultados aparecerão na caixa de resultados e podem ser importados para a planilha de escolha. A análise automatizada de células facilita a quantificação do grande número de células. Para cada novo tipo de célula, primeiro execute a macro para estabelecer parâmetros.Quando a macro estiver concluída, selecione definir limites de tamanho de célula. Clique no rótulo das menores e maiores células e clique na medida. Defina o valor da menor célula e das maiores variáveis celulares e salve as alterações.Feche todas as janelas macro e selecione a imagem a ser processada em escala de cinza. Em seguida, executar a macro novamente. A macro fornecerá uma tabela dos resultados que inclui o índice de forma celular, proporção e regiões de seleções de interesse listam dados.Aqui, podem ser observadas imagens representativas de aderências focais contadas com ImageJ, incluindo os contornos numerados finais e as sobreposições dos contornos de adesão focal com a imagem original para as linhas de células de controle e knockdown. Como ilustrado nesta análise, as células de knockdown demonstraram um maior número de aderências por célula, bem como aderências maiores em tamanho em comparação com células de linha celular de controle. Nessas imagens, são mostradas regiões representativas de monocamadas celulares não tratadas e quimiofapeuticamente tratadas.As células de contorno foram caracterizadas de acordo com seus valores de índice de forma celular, por exemplo, nesta análise, mostrando um aumento na última lixeira e um achatamento dos principais picos para as células tratadas com drogas em comparação com controles não tratados. Uma distribuição de frequência e distribuição cumulativa poderia então ser gerada para cada cultura celular. A imagem em escala de cinza das monocamadas como demonstrado permitiu a análise e quantificação de 512 células de 12 campos de visão revelando uma distribuição relativa da frequência do índice de forma celular.Para que este protocolo funcione, é importante usar imagens da melhor qualidade possível. A semeadura, a coloração e a imagem adequadas devem garantir imagens de qualidade experimental suficiente.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Biologia

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Quantificação em situ da Missa das células beta pancreáticas em camundongos

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analisando celular superfície de adesão remodelação em resposta à tensão mecânica usando pérolas magnéticas

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Quantificação da Competição Interbacteriana usando imagens de fluorescência unicelular

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatizando quantificação agregada em caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...