Name: quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Эта работа была поддержана Польским национальным научным центром в рамках гранта No 2014/14/M/N'1/00437.

1. Подготовительные шаги
<ol><li>Сотовый посев для получения слияние монослой<ol>
<li>Перед посевом, пальто колодцы 4-колодцы камерной слайд с коллагеном I (или другой компонент ECM выбора). Для покрытия коллагена I, следуйте коммерческому протоколу: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-...

<ol>
	<li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion.">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006 (2016).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).</li><li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours.">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP,+a+bisphenol+A+analog,+as+a+novel+AR+down-regulator.">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAX1+impact+on+collective+cell+migration,+cell+adhesion,+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility.">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li><li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+analysis+of+cell,+nucleus+and+focal+adhesion+morphology.">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).</li><li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics,+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour.">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707 (2016).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration.">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images.">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients.">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li><li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces.">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li></ol>

Клеточная и клеточно-субстратная адгеция являются неотъемлемыми атрибутами эпителиальных клеток и играют решающую роль в морфогенезе ткани и эмбриогенезе. В взрослых тканях правильное регулирование механических свойств клеточного слоя имеет решающее значение для поддержания гомео...

Эпителиальные клеточные монослой действуют как коллектив, в котором ячейка-клетка и клеточный субстратный спайка, а также контрактные силы и напряжения представляют важные параметры, и их надлежащий баланс способствует общей целостности блока1,2,3. Таким образом, оценка этих параметров представляет собой способ установить текущее состояние слоя ячейки.
Два описанных здесь метода представляют собой двумерный анализ слияние монослой адептов, эпителиальных клеток (в данном случае линия клеток рака молочной железы MCF7). Анализ проводится с использованием конфокополиальных изображений (одиночных ломтиков) из разных регионов на оси з; базальной области вблизи субстрата для фокусных измерений сцепления (FA) и апкической области для измерения формы клеток. Представленные методы являются относительно простыми и требуют стандартных лабораторных методов и программного обеспечения с открытым исходным кодом. Конфокальной микроскопии достаточно для этого протокола, поэтому она может быть выполнена без использования более специализированной микроскопии TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Таким образом, протокол может быть реализован в относительно стандартных лабораторных условиях. Хотя точность методов ограничена, они могут различать основные различия в фокусной спайке и форме клеток.
Оба описанных здесь метода состоят из стандартных экспериментальных процедур, таких как культивирование клеток, иммуносументирование, конфокальная визуализация и анализ изображений, выполняемый с помощью ImageJ. Тем не менее, любое программное обеспечение для обработки изображений с соответствующими функциями может быть использовано. Представленные методы могут отслеживать и сравнивать изменения, вызванные фармакологическим лечением или минимальной генетической модификацией. Получение определенных значений не рекомендуется, из-за ограниченной точности этих методов. Два автоматизированных макроса были включены, чтобы облегчить измерения многих изображений.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>goat anti-rabbit, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junction plakoglobin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2309S</td>
			<td>rabbit, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow cabinet class 2</td>
			<td>Alpina</td>
			<td></td>
			<td>standard equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td>
			<td>Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019</td>
			<td></td>
			<td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 cell line (CONTROL)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td>epithelial, adherent breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CK2 light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paxillin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>rabbit, 1:250, Y113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers

Методы, представленные здесь количественно некоторые параметры слияния адептов клеток монослой из нескольких соответствующим образом окрашенных конфокальных изображений: прилипание к субстрату в качестве функции числа и размера фокусных спаек, и форма клеток, характеризующаяся индексом формы клетки и другими дескрипторами формы. Фокусные спайки были визуализированы при окрашивании паксилина, а клеточные границы были отмечены стыковым плакоглобином и актином. Методы клеточной культуры и окрашивания являются стандартными; изображения представляют собой единые фокусные плоскости; анализ изображений проводился с использованием общедоступного программного обеспечения для обработки изображений. Представленные протоколы используются для количественной оценки количества и размера фокусных спаек и различий в распределении формы клеток в монослоях, но они могут быть перепрофилированы для количественной оценки размера и формы любой другой клеточной структуры, которая может быть окрашена (например, митохондрии или ядра). Оценка этих параметров имеет важное значение в характеристике динамических сил в адептов клеточного слоя, в том числе клея клеток и актомиозин контрактистойности, которая влияет на форму клеток.

Анализ фокусной адгезии Нокдаун гена HAX1 ранее было показано, влияют на фокусные спайки6. Клетки были культивируются на поверхности коллагена I-покрытием для 48 h. Изображения клеток управления MCF7 и клеток MCF7 с нокдауном HAX1 (HAX1 KD) из трех независимых эк...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

В статье описывается количественная оценка 1) размера и количества фокусных спаек и 2) индекса формы клеток и его распределения от конфокальных изображений слияние моноселей клеток MCF7.

Количественная оценка зоны сцепления cell-substrate и распределения формы клеток в монолиях клеток MCF7

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Этот протокол позволяет количественно оценить площадь, периметр и форму внутриклеточной структуры по двумерным изображениям. Этот метод быстр и прост, требует только стандартных лабораторных настроек и конфокального микроскопа и использует программное обеспечение с открытым исходным кодом. Демонстрацией процедуры будет Анна Бальцерак, аспирантка из моей лаборатории.Начните с посева четыре раза от 10 до пятой клетки в 0,5 миллилитров культуры среды на колодец в четыре хорошо коллагена одной покрытием камеры слайд для 24-часовой культуры в 37 градусов по Цельсию и пять градусов углекислого газа инкубатора. На следующее утро используйте оптический перевернутый микроскоп, чтобы проверить наличие по крайней мере 90%-ного слияния монослой и использовать конфокальный микроскоп для получения одного изображения с ломтиками. Для анализа фокусного адгезии откройте изображения в ImageJ и выберите анализ, установите масштаб, удалите масштаб и глобальную, чтобы установить шкалу изображения в пикселях.Чтобы включить имя файла и область области, представляющие интерес в вариантах измерения, нажмите проанализировать и установить измерения и проверить область и параметры отображения этикетки. Чтобы вычесть фон, выберите процесс и вычесть фон. Установите радиус подвижного шара до 50 пикселей и проверьте раздвижной параболоид.Чтобы определить область самой маленькой области интереса, наметьте малейшее фокусное деление и нажмите на анализ и меру для измерения области. Когда было отобрано и измерено по крайней мере 20 областей, представляющих интерес, рассчитать и сохранить среднее количество полученных результатов. Установите верхнюю границу до 25% типичной области ячейки.Чтобы присвоить изображение двоичному, нажмите на изображение, отрегулируйте и порог, и проверьте по умолчанию, черно-белый и темный фон. Для измерения количества и областей областей, представляющих интерес, выберите анализ и анализ частиц и проверьте пиксельные единицы, отобразить результаты, четкие результаты и обобщить. Перенесите данные о срезе, подсчете и общей площади среднего размера из сводного окна в программу управления данными по выбору.Для количественной оценки фокусного адгезии откройте макрос фокусного адгезии ImageJ и введите область самой маленькой области интереса в качестве области малейшего параметра, представляющих интерес. Установите значение порогового типа для ручного или автоматического и сохраните изменения. Затем позвоните макросу из ImageJ и выберите изображение для обработки.Для ручного анализа формы ячейки откройте изображение в соответствующей программе обработки изображений и выберите параметры, которые будут измерены. Используйте инструмент выбора от руки, чтобы вручную разграничить границы клеток, отмеченные белками соединения выбора. Выбранные параметры будут автоматически рассчитаны для каждой ячейки.Когда все ячейки будут изложены, выберите редактировать, выбирать и добавлять в менеджер. Следует выбрать только полностью видимые ячейки с непрерывными границами. Чтобы сделать измерение, отметьте все числа, появляющиеся в левой коробке области менеджера интересов, и нажмите меру.Результаты будут отображаться в поле результатов и могут быть импортированы в электронную таблицу по выбору. Автоматизированный анализ клеток облегчает количественную оценку большого количества клеток. Для каждого нового типа ячейки сначала запустите макрос для установления параметров.Когда макрос закончится, выберите границы размера ячейки. Нажмите на этикетку самых маленьких и крупнейших ячеек и нажмите меру. Установите значение самой маленькой ячейки и крупнейших переменных ячееок и сохраните изменения.Закройте все макро окна и выберите изображение, которое будет обработано в серой шкале. Затем запустите макрос снова. Макрос предоставит таблицу результатов, которая включает индекс формы ячейки, соотношение аспектов и данные списка выбора интересов.Здесь можно наблюдать репрезентативные изображения фокусных спайков, подсчитанных с Помощью ImageJ, включая окончательные проумерено очертания и наложения контуров фокусной адгезии с исходным изображением как для линий управления, так и для нокдауна. Как показано в этом анализе, нокдаун клетки продемонстрировали большее количество спаек на клетку, а также спайки, которые больше по размеру по сравнению с клетками линии управления. На этих снимках показаны репрезентативные области необработанных и химиотерапевтически обработанных клеточных монослой.Клетки контура были охарактеризованы в соответствии с их значениями индекса формы клеток, например, в этом анализе, показывающем увеличение последнего ящика и выравнивание основных пиков для обработанных наркотиками клеток по сравнению с необработанными контролями. Затем для каждой клеточной культуры можно было бы сгенерировано распределение частот и кумулятивное распределение. Серомасштабная визуализация монослоев, как было продемонстрировано, позволила провести анализ и количественную оценку 512 ячеек из 12 областей зрения, показывая относительное распределение частоты индекса формы клетки.Для работы этого протокола важно использовать изображения наилучшего качества. Правильное посев клеток, окрашивание и визуализация должны обеспечивать достаточное экспериментальное качество изображений.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Препарирование Организатор и эксплантов животных Полюс от Xenopus laevis Эмбрионы и Ассамблеи Пробирной клеточной адгезии

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Видео биоинформатики Анализ человеческих эмбриональных роста клеток колонии стволовых

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

В месте Количественная поджелудочной железы бета-клеток у мышей массовой

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Механическое раздражение индуцированных кальция Распространение волн в монослоев клеток: Пример бычьего эндотелиальных клеток роговицы

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Высокое разрешение Количественное кристаллической целлюлозы Накопление в<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Корни для мониторинга Тканеспецифическая клеточной стенки Модификации

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Анализ клеточной поверхности адгезии Ремоделирование в ответ на механическое напряжение с помощью магнитных шариков

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Количественная оценка межбактериальной конкуренции с использованием одноклеточной флуоресцентной визуализации

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Автоматизация количественной оценки агрегатов в Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...