Name: quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia bajo la subvención No. 2014/14/M/NZ1/00437.

1. Pasos preparatorios
<ol><li>Siembra celular para obtener monocapas confluentes<ol>
<li>Antes de la siembra, recubrir los pozos de un portaobjetos de 4 pozos con colágeno I (u otro componente ECM de elección). Para el recubrimiento de colágeno I, siga un protocolo comercial: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html a una concentración de 8 g/cm2.</li>
		<li>Semilla 400.000 células a un pozo de un portaobjetos de 4 pozos.</li>
		<li>Cultivo de l...

<ol>
	<li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion.">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006 (2016).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).</li><li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours.">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP,+a+bisphenol+A+analog,+as+a+novel+AR+down-regulator.">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAX1+impact+on+collective+cell+migration,+cell+adhesion,+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility.">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li><li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+analysis+of+cell,+nucleus+and+focal+adhesion+morphology.">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).</li><li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics,+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour.">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707 (2016).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration.">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images.">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients.">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li><li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces.">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li></ol>

La adhesión de células celulares y sustratos celulares constituyen atributos inherentes de las células epiteliales y desempeñan el papel crítico en la morfogénesis tisular y la embriogénesis. En los tejidos adultos, la regulación adecuada de las propiedades mecánicas de la capa celular es crucial para mantener la homeostasis y prevenir respuestas patológicas como la progresión tumoral y la metástasis. El tamaño y el número de adherencias focales dependen de la fuerza de la adhesión del sustrato celular, mi...

Las monocapas celulares epiteliales actúan como un colectivo en el que la adhesión de células celulares y sustratos celulares, así como fuerzas y tensiones contráctiles representan parámetros importantes y su equilibrio adecuado contribuye a la integridad general de la unidad1,,2,,3. Por lo tanto, la evaluación de estos parámetros representa una manera de establecer el estado actual de la capa de celda.
Los dos métodos descritos aquí representan un análisis bidimensional de las monocapas confluentes de las células epiteliales adherentes (en este caso la línea celular del cáncer de mama MCF7). El análisis se realiza utilizando imágenes confocales (cortes Z únicos) de diferentes regiones en el eje Z; región basal cerca de un sustrato para mediciones de adhesión focal (FA) y región apical para mediciones de forma celular. Los métodos presentados son relativamente simples y requieren técnicas de laboratorio estándar y software de código abierto. La microscopía confocal es suficiente para este protocolo, por lo que se puede realizar sin emplear una microscopía TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) más especializada. Por lo tanto, el protocolo podría aplicarse en un entorno de laboratorio relativamente estándar. Aunque la precisión de los métodos es limitada, pueden distinguir las diferencias básicas en la adhesión focal y la forma de la célula.
Ambos métodos descritos aquí consisten en los procedimientos experimentales estándar tales como el cultivo celular, inmunosuculción, imágenes confocales y análisis de imágenes realizados con ImageJ. Sin embargo, se puede utilizar cualquier software de procesamiento de imágenes con las funciones adecuadas. Los métodos presentados pueden rastrear y comparar los cambios infligidos por el tratamiento farmacológico o la modificación genética mínima. No se recomienda obtener valores definidos, debido a la precisión limitada de estos métodos. Se incluyeron dos macros automatizadas, para facilitar las mediciones de muchas imágenes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>goat anti-rabbit, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junction plakoglobin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2309S</td>
			<td>rabbit, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow cabinet class 2</td>
			<td>Alpina</td>
			<td></td>
			<td>standard equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td>
			<td>Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019</td>
			<td></td>
			<td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 cell line (CONTROL)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td>epithelial, adherent breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CK2 light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paxillin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>rabbit, 1:250, Y113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers

Los métodos presentados aquí cuantifican algunos parámetros de monocapas de células adherentes confluentes a partir de múltiples imágenes confocales debidamente manchadas: adhesión al sustrato en función del número y tamaño de adhesiones focales, y forma de celda, caracterizada por el índice de forma de celda y otros descriptores de forma. Las adherencias focales fueron visualizadas por la tinción de paxillin y los bordes de las células celulares se marcaron con plakoglobina de unión y actina. Los métodos para el cultivo celular y la tinción eran estándar; imágenes representan planos focales individuales; el análisis de imágenes se realizó utilizando software de procesamiento de imágenes disponible públicamente. Los protocolos presentados se utilizan para cuantificar el número y el tamaño de las adherencias focales y las diferencias en la distribución de la forma celular en las monocapas, pero se pueden reutilizar para la cuantificación del tamaño y la forma de cualquier otra estructura celular distinta que se pueda teñir (por ejemplo, mitocondrias o núcleos). La evaluación de estos parámetros es importante en la caracterización de las fuerzas dinámicas en la capa celular adherente, incluida la adhesión celular y la contractilidad de actomiosina que afecta a la forma celular.

Análisis de adherencia focal Anteriormente se demostró que el derribo del gen HAX1 afectaba a las adherencias focales6. Las células se cultivaron en la superficie recubierta de colágeno I durante 48 h. Las imágenes de las células de control MCF7 y las células MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) de tres experimentos independientes manchados con paxillin de proteína de adhesión focal se obtuvieron utilizando un microscopio confocal (imagen de ...

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Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

El artículo describe la cuantificación de 1) el tamaño y el número de adherencias focales y 2) índice de forma celular y su distribución de imágenes confocales de las monocapas confluentes de las células MCF7.

Cuantificación del área de adhesión de sustrato celular y distribuciones de formas celulares en monocapas de células MCF7

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Este protocolo permite cuantificar el área, el perímetro y la forma de la estructura intracelular a partir de su imagen bidimensional. Esta técnica es rápida y fácil, solo requiere ajustes de laboratorio estándar y un microscopio confocal y utiliza software de código abierto. Demostrando el procedimiento estará Anna Balcerak, una estudiante de doctorado de mi laboratorio.Comience por sembrar cuatro veces 10 a las quintas celdas en 0,5 mililitros de medio de cultivo por pozo en un tobogán de cámara recubierto de colágeno de cuatro pozos para un cultivo de 24 horas en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y cinco grados. A la mañana siguiente, utilice un microscopio invertido óptico para verificar la presencia de al menos un 90% de monocapa confluente y utilice un microscopio confocal para obtener imágenes de corte Z individuales. Para el análisis de adhesión focal, abra las imágenes en ImageJ y seleccione analizar, establecer escala, eliminar escala y global para establecer la escala de la imagen en píxeles.Para incluir el nombre de archivo y el área de la región de interés en las opciones de medición, haga clic en analizar y establecer medidas y compruebe el área y las opciones de etiqueta de visualización. Para restar el fondo, seleccione el proceso y reste el fondo. Establezca el radio de la bola rodante en 50 píxeles y compruebe el paraboloides deslizantes.Para determinar el área de la región de interés más pequeña, esboce la adhesión focal individual más pequeña y haga clic en analizar y medir para medir el área. Cuando se hayan seleccionado y medido al menos 20 regiones de interés, calcule y guarde la media de los resultados obtenidos. Establezca el límite superior en el 25% de un área de celda típica.Para conferir la imagen a binario, haga clic en imagen, ajuste y umbral, y compruebe el valor predeterminado, blanco y negro y fondo oscuro. Para medir el número y las áreas de las regiones de interés, seleccione analizar y analizar las unidades de partículas y comprobar las unidades de píxeles, mostrar los resultados, borrar resultados y resumir. Transfiera los datos de tamaño medio de sector, recuento y área total de la ventana de resumen al programa de administración de datos de su elección.Para la cuantificación de la adhesión focal, abra la macro ImageJ de adhesión focal y entre en el área de la región de interés más pequeña como el área del parámetro de región de interés más pequeña. Establezca el valor de tipo de umbral en manual o automático y guarde los cambios. A continuación, llame a la macro desde ImageJ y seleccione la imagen que desea procesar.Para el análisis manual de formas de celda, abra una imagen en un programa de software de procesamiento de imágenes adecuado y seleccione los parámetros que se van a medir. Utilice la herramienta de selección a mano alzada para delinear manualmente los bordes celulares como se marca en las proteínas de unión de su elección. Los parámetros elegidos se calcularán automáticamente para cada celda.Cuando se hayan descrito todas las celdas, seleccione editar, seleccionar y agregar al administrador. Solo se deben seleccionar celdas completamente visibles completas con bordes ininterrumpidos. Para realizar la medición, marque todos los números que aparecen en el cuadro izquierdo de la región del administrador de intereses y haga clic en medir.Los resultados aparecerán en el cuadro de resultados y se pueden importar a la hoja de cálculo de su elección. El análisis automatizado de células facilita la cuantificación del gran número de células. Para cada nuevo tipo de celda, ejecute primero la macro para establecer parámetros.Cuando la macro haya terminado, seleccione establecer límites de tamaño de celda. Haga clic en la etiqueta de las celdas más pequeñas y grandes y haga clic en medir. Establezca el valor de la celda más pequeña y las variables de celda más grandes y guarde los cambios.Cierre todas las ventanas de macro y seleccione la imagen que desea procesar en escala de grises. A continuación, vuelva a ejecutar la macro. La macro proporcionará una tabla de los resultados que incluye el índice de forma de celda, la relación de aspecto y los datos de lista de regiones de interés.Aquí, se pueden observar imágenes representativas de adhesiones focales con ImageJ, incluidos los contornos numerados finales y las superposiciones de los contornos de adhesión focal con la imagen original para las líneas celulares de control y derribo. Como se ilustra en este análisis, las células de knockdown demostraron un mayor número de adherencias por célula, así como adherencias que son de mayor tamaño en comparación con las celdas de línea celular de control. En estas imágenes, se muestran regiones representativas de monocapas celulares tratadas sin tratar y tratadas quimioteráficas.Las células de esquema se caracterizaron de acuerdo con sus valores de índice de forma celular, por ejemplo en este análisis que muestra un aumento en el último contenedor y un aplanamiento de los picos principales para las células tratadas con fármacos en comparación con los controles no tratados. A continuación, se podría generar una distribución de frecuencia y una distribución acumulativa para cada cultivo celular. Las imágenes en escala de grises de las monocapas, como se ha demostrado, permitieron el análisis y cuantificación de 512 celdas a partir de 12 campos de visión que revelan una distribución de frecuencia relativa del índice de forma de celda.Para que este protocolo funcione, es importante utilizar imágenes de la mejor calidad posible. La siembra celular, la tinción y las imágenes adecuadas deben garantizar imágenes de una calidad experimental suficiente.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Investigación

Biología

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