Name: quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Detta arbete stöddes av polska National Science Center under bidrag nr 2014/14/M/NZ1/00437.

1. Förberedande åtgärder
<ol><li>Cellsådd för att erhålla konfluent monolager<ol>
<li>Innan sådd, belägga brunnarna i en 4-brunnar kammare bild med kollagen I (eller annan ECM komponent val). För kollagen I-beläggning, följ ett kommersiellt protokoll: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html vid en koncentration av 8 μg/cm2.</li>
		<li>Frö 400.000 celler till en brunn av en 4-brunnskammare bild.</li>
		<li>Odla cellerna i 24 timmar (eller...

<ol>
	<li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion.">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006 (2016).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).</li><li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours.">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP,+a+bisphenol+A+analog,+as+a+novel+AR+down-regulator.">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAX1+impact+on+collective+cell+migration,+cell+adhesion,+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility.">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li><li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+analysis+of+cell,+nucleus+and+focal+adhesion+morphology.">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).</li><li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics,+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour.">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707 (2016).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration.">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images.">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li><li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients.">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li><li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces.">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li></ol>

Cell-cell och cell-substrat vidhäftning utgör inneboende attribut av epitelceller och spela den avgörande rollen i vävnad morphogenesis och embriogenesis. I vuxna vävnader är korrekt reglering av mekaniska egenskaper hos celllagret avgörande för att upprätthålla homeostas och förhindra patologiska reaktioner som tumörprogression och metastasering. Storleken och antalet fokala sammanväxningar beror på styrkan hos cellsubstratvidhäftning, medan cellformen beror på kontraktila krafter och är relaterad till ...

Epitelial cell monolayers fungera som ett kollektiv där cell-cell och cell-substrat vidhäftning samt kontraktila krafter och spänningar representerar viktiga parametrar och deras rätt balans bidrar till den övergripande integriteten hos enheten1,2,3. Att bedöma dessa parametrar representerar således ett sätt att fastställa celllagrets aktuella status.
De två metoder som beskrivs här representerar en tvådimensionell analys av konfluenta monolayers av vidhäftande, epitelceller (i detta fall MCF7 bröstcancer cellinje). Analysen utförs med hjälp av konfokala bilder (enstaka Z-skivor) från olika regioner på Z-axeln. basala regionen nära ett substrat för fokalvidhäftning (FA) mätningar och apikal region för cellform mätningar. De presenterade metoderna är relativt enkla och kräver standard laboratorieteknik och programvara med öppen källkod. Konfokalmikroskopi är tillräcklig för detta protokoll, så det kan utföras utan att använda mer specialiserade TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopi. Således skulle protokollet kunna genomföras i en relativt standard laboratorium inställning. Även om metodernas noggrannhet är begränsad, kan de skilja på grundläggande skillnader i fokal vidhäftning och cellform.
Båda metoderna som beskrivs här består av standard experimentella procedurer såsom cellodling, immunstaining, konfial avbildning och bildanalys som utförs med ImageJ. Alla bildbehandlingsprogram med lämpliga funktioner kan dock användas. De presenterade metoderna kan spåra och jämföra förändringar som orsakas av farmakologisk behandling eller minimal genetisk modifiering. Att erhålla bestämda värden rekommenderas inte, på grund av den begränsade precisionen hos dessa metoder. Två automatiserade makron ingick, för att underlätta mätningar av många bilder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>goat anti-rabbit, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junction plakoglobin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2309S</td>
			<td>rabbit, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow cabinet class 2</td>
			<td>Alpina</td>
			<td></td>
			<td>standard equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td>
			<td>Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019</td>
			<td></td>
			<td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 cell line (CONTROL)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td>epithelial, adherent breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CK2 light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paxillin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32084</td>
			<td>rabbit, 1:250, Y113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC conjugate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST &#8211; Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cell-substrate adhesion area and cell shape distributions in mcf7 cell monolayers

De metoder som presenteras här kvantifiera vissa parametrar för konfluenta vidhäftande cell monolayers från flera lämpligt färgade confocal bilder: vidhäftning till substratet som en funktion av antalet och storleken på fokala sammanväxningar, och cell form, som kännetecknas av cellen form index och andra form deskriptorer. Focal sammanväxningar visualiserades av paxillin färgning och cell-cell gränser präglades av korsningen plakoglobin och aktin. Metoderna för cellodling och färgning var standard; Bilder representerar enstaka fokalplan. bildanalys utfördes med hjälp av offentligt tillgängliga bildbehandlingsprogram. De presenterade protokollen används för att kvantifiera antalet och storleken på fokala sammanväxningar och skillnaderna i cellformfördelning i monolayers, men de kan återanvändas för kvantifiering av storlek och form av någon annan distinkt cellulär struktur som kan färgas (t.ex. mitokondrierna eller atomkärnor). Att bedöma dessa parametrar är viktigt i karakteriseringen av de dynamiska krafterna i vidhäftande cellskikt, inklusive cellvidhäftning och aktomyosinkontraktilitet som påverkar cellformen.

Analys av fokal vidhäftning Knockdown av HAX1 genen har tidigare visat sig påverka fokal sammanväxningar6. Celler odlades på kollagen I-belagda ytan för 48 h. Bilder av MCF7 kontrollceller och MCF7 celler med en HAX1 knockdown(HAX1 KD) från tre oberoende experiment färgas med fokal vidhäftning protein paxillin erhölls med hjälp av ett konfokalt mikroskop (bild från enda fokalplan / Z-skiva från basala regionen). FAs från cirka 2.000-2.500...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers at JoVE.com

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

Artikeln beskriver kvantifiering av 1) storlek och antal fokala sammanväxningar och 2) cell form index och dess fördelning från konfa bilder av konfluenta monolayers av MCF7 celler.

Kvantifiering av cellsubstratvidhäftningsområde och cellformfördelningar i MCF7 Cell Monolayers

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Detta protokoll möjliggör kvantifiering av området, omkretsen och formen av intracellulär struktur från dess tvådimensionella bild. Denna teknik är snabb och enkel, kräver endast standard laboratorieinställningar och ett konfokalmikroskop och använder opensource programvara. Demonstrerar proceduren blir Anna Balcerak, en doktorand från mitt laboratorium.Börja med att så fyra gånger 10 till de femte cellerna i 0,5 milliliter odlingsmedium per brunn i en fyra-väl kollagen en belagd kammare bild för en 24-timmars kultur i en 37 grader Celsius och fem graders koldioxid inkubator. Nästa morgon, använd ett optiskt inverterat mikroskop för att verifiera förekomsten av minst 90%konfluent monolayer och använda ett konfokalmikroskop för att få enstaka Z-slice-bilder. För fokal vidhäftningsanalys öppnar du bilderna i ImageJ och väljer analysera, ange skala, ta bort skala och global för att ställa in bildskalan i pixlar.Om du vill ta med filnamnet och området för området av intresse i mätningsalternativen klickar du på Analysera och ställer in mått och kontrollerar alternativen för området och visningsetiketten. Om du vill subtrahera bakgrunden väljer du process och subtrahera bakgrund. Ställ in den rullande bollen radie till 50 pixlar och kontrollera glidande paraboloid.För att bestämma området för den minsta regionen av intresse, skissera den minsta enda fokal vidhäftning och klicka analysera och mäta för att mäta området. När minst 20 regioner av intresse har valts ut och mätts, beräkna och spara medelvärdet av de erhållna resultaten. Ange den övre gränsen till 25%av ett typiskt cellområde.Om du vill ge bilden till binär klickar du på bild, justera och tröskelvärde och kontrollerar standard, svartvit och mörk bakgrund. Om du vill mäta antalet och områdena i de regioner som är av intresse väljer du analysera och analyserar partikel- och kontrollpunktenheter, visar resultat, rensar resultat och summerar. Överför segmentet, antalet och den totala ytans medelstorleksdata från samlingsfönstret till det data som hanterar det val som du väljer.För fokal vidhäftningskvantifiering, öppna fokal vidhäftningsbilden ImageJ makro och ange området för den minsta regionen av intresse som område för den minsta regionen av intresse parameter. Ange tröskelvärdets typvärde till manuell eller auto och spara ändringarna. Ring sedan makrot från ImageJ och välj den bild som ska bearbetas.För manuell analys av cellform, öppna en bild i ett lämpligt program för bildbehandlingsprogram och välj de parametrar som ska mätas. Använd markeringsverktyget för frihand för att manuellt avgränsa cellens gränser som de markeras av de val av knutpunkter som vägbindningsproteiner. De valda parametrarna kommer att beräknas automatiskt för varje cell.När alla cellerna har skisserats väljer du redigera, markering och lägg till i Manager. Endast fullständiga helt synliga celler med oavbrutna kantlinjer ska markeras. För att göra mätningen, markera alla de siffror som visas i den vänstra rutan i regionen av intressehanteraren och klicka på mått.Resultaten kommer att visas i resultatrutan och kan importeras till det kalkylblad som valet gäller. Automatiserad cellanalys underlättar kvantifiering av det stora antalet celler. För varje ny celltyp kör du först makrot för att upprätta parametrar.När makrot är klart väljer du ange gränser för cellstorlek. Klicka på etiketten för de minsta och största cellerna och klicka på måttet. Ange värdet för den minsta cellen och de största cellvariablerna och spara ändringarna.Stäng alla makrofönster och välj den bild som ska bearbetas i gråskala. Kör sedan makrot igen. Makrot kommer att ge en tabell över resultaten som innehåller cellformsindex, bildförhållande och regioner med intresseval listdata.Här kan representativa bilder av fokala sammanväxningar som räknas med ImageJ inklusive de slutliga numrerade konturerna och överläggen av fokaladhesion konturerna med den ursprungliga bilden för både kontroll och knockdown cellinjer observeras. Som illustreras i denna analys, knockdown cellerna visat ett högre antal sammanväxningar per cell samt sammanväxningar som är större i storlek jämfört med kontroll celllinje celler. I dessa bilder visas representativa regioner av obehandlade och kemoterapeutiskt behandlade cellmonolager.Konturcellerna karakteriserades efter deras cellformsindexvärden, till exempel i denna analys som visar en ökning av den sista papperskorgen och en uts flattening av de viktigaste topparna för de läkemedelsbehandlade cellerna jämfört med obehandlade kontroller. En frekvensfördelning och kumulativ fördelning kunde sedan genereras för varje cellodling. Gråskala bildframställning av monolayers som visat tillåts analys och kvantifiering av 512 celler från 12 synfält avslöjar en relativ frekvens fördelning av cellen form index.För att detta protokoll ska fungera är det viktigt att använda bilder av bästa möjliga kvalitet. Korrekt cell seeding, färgning, och bildbehandling bör säkerställa bilder av en tillräcklig experimentell kvalitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Dissekering av Organizer och Animal explants Pole från Xenopus laevis Embryon och församlingen i en cell Adhesion analys

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatik Analys av mänskliga embryonala stamceller Colony Tillväxt

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

In situ Kvantifiering av bukspottkörteln-cellmassan hos möss

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-inducerad Kalcium vågutbredning i cellmonoskikt: exemplet Nötkreatur hornhinnan endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Högupplöst Kvantifiering av kristallin cellulosa Ackumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots att övervaka Vävnadsspecifik cellvägg Ändringar

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analysera cellytan Adhesion Remodeling som svar på mekaniska spänningar med användning av magnetiska pärlor

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Kvantifiering av interbacterial konkurrens med hjälp av fluorescensavbildning med en cell

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisera aggregatkvantifiering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...