Name: analysis of human natural killer cell metabolism
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for støtte og diskusjon. Denne studien ble støttet av Intramural Research Programs av National Institutes of Health, National Cancer Institute og National Heart, Lung, and Blood Institute. JT støttes av Ramon y Cajal-programmet (stipend RYC2018-026050-I) av MICINN (Spania).

Alle forsøkene ble utført i samsvar med Helsingfors's etiske prinsipper for medisinsk forskning. Perifere blodprøver fra donorer ble hentet fra NIH Department of Transfusion Medicine under 99-CC-0168 IRB godkjentprotokoll, med pasientskrevet informert samtykke.
1. Klargjøring av reagens
<ol><li>
Reagenser for isolering av NK-celler MERKNADER: Forbered disse reagensene i en cellekulturhette.<ol>
<li>Klargjør NK-separasjonsbuffer: Supplement PBS (pH 7.4) med 1 mM EDTA ...

<ol>
	<li>Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+natural+killer+cell+responses:+integration+of+signals+for+activation+and+inhibition.">Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition.</a> Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).</li><li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells.">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li><li>Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Proliferation+Induced+by+IL-15+Transpresentation+Is+Negatively+Regulated+by+Inhibitory+Receptors.">NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors.</a> Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).</li><li>Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-2+augments+natural+killer+cell+activity.">Interleukin-2 augments natural killer cell activity.</a> Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).</li><li>Anton, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-endocytosis+of+intact+IL-15Ralpha-IL-15+complex+from+presenting+cells+into+NK+cells+favors+signaling+for+proliferation.">Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).</li><li>Marcais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+checkpoint+kinase+mTOR+is+essential+for+IL-15+signaling+during+the+development+and+activation+of+NK+cells.">The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells.</a> Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).</li><li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements.">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases.">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).</li><li>Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Metabolism+and+Tumor+Microenvironment.">NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).</li><li>Felices, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+treatment+with+IL-15+exhausts+human+NK+cells+via+a+metabolic+defect.">Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+First-in-Human+Phase+I+Study+of+Subcutaneous+Outpatient+Recombinant+Human+IL15+(rhIL15)+in+Adults+with+Advanced+Solid+Tumors.">A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).</li><li>Conlon, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+by+Continuous+Intravenous+Infusion+to+Adult+Patients+with+Solid+Tumors+in+a+Phase+I+Trial+Induced+Dramatic+NK-Cell+Subset+Expansion.">IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).</li><li>Dubois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+Infusion+of+Cancer+Patients+Expands+the+Subpopulation+of+Cytotoxic+CD56(bright)+NK+Cells+and+Increases+NK-Cell+Cytokine+Release+Capabilities.">IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities.</a> Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).</li><li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects.">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes.">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions.">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).</li><li>Theorell, J., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Intracellular+Ca(2+)+Mobilization+in+Human+NK+Cell+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).</li><li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements.">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li><li>O'Brien, K. L., Finlay, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunometabolism+and+natural+killer+cell+responses.">Immunometabolism and natural killer cell responses.</a> Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).</li><li>Ahn, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+mitochondrial+deacetylase+Sirt3+in+regulating+energy+homeostasis.">A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).</li><li>Stram, A. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+mitochondria:+protein+signaling+in+the+powerhouse.">Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).</li><li>Armstrong, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+alters+mitochondrial+bioenergetics+and+modifies+pancreatic+cell+death+independently+of+cyclophilin+D,+resulting+in+an+apoptosis-to-necrosis+shift.">Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate.">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).</li><li>Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+lipophilic+cation+for+determination+of+membrane+potential+in+neuroblastoma-glioma+hybrid+cell+suspensions.">Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).</li><li>Michelet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+natural+killer+cells+in+obesity+limits+antitumor+responses.">Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).</li></ol>

I dette papiret har vi etablert en protokoll for effektivt å isolere og kultivere rene og levedyktige primære menneskelige NK-celler fra perifert blod. Vi har også optimalisert betingelsene for måling av metabolsk aktivitet av disse NK-cellene vurdert av oksygenforbruk og ekstracellulær forsuring ved hjelp av en ekstracellulær fluksasanalysator. Sammenlignet med andre respirometriske metoder er den ekstracellulære fluksalysatoren rask, krever et lite antall celler og tillater screeninger med høy gjennomstrømming...

Natural Killer (NK) celler er medfødte lymfocytter som medierer anti-tumor og anti-virale responser. NK-celler utgjør 5-15% av alle lymfocytter i humant perifert blod, og finnes også i milt, lever, benmarg og lymfeknuter. NK-celler uttrykker ikke polymorfe klnotypiske reseptorer, for eksempel T-cellereseptorer (TCR) eller B-cellereseptorer (BCR). I motsetning blir aktiveringen av deres cytolytiske funksjoner tilskyndet av engasjement av reseptorer som gjenkjenner uforanderlige ligandes på overflaten av en målcelle1,2.
Hvile menneskelige NK celler isolert fra perifert blod kan overleve i flere dager i kultur medium supplert med menneskelig serum. Aktivering av NK-celler av cytokiner som IL-15 eller IL-2 driver cellene til spredning og til en økning av deres drapsevne, blant anneteffekter 3,4,5. Flere studier har vist en direkte sammenheng mellom NK celleaktivering og endringer i deres metabolskeaktivitet 6. Disse metabolske endringene er bestemt til å møte de spesielle kravene til cellene når det gjelder energi og biosyntese.
Aerobe celler og organismer får energi gjennom en rekke kjemiske reaksjoner som involverer katabolisme og oksidasjon av karbohydrater, fett og proteiner. Gjennom en kombinasjon av glykose, tricarboxylic acid (TCA) syklus og oksidativ fosforylering, eukaryotiske celler oppfyller flertallet av deres ATP etterspørsel og få mellomprodukter som kreves som byggeklosser for makromolekyler avgjørende for cellevekst og spredning. Prosessen med glykose (figur 1A) starter med inntreden av glukose i cellen. I cytosolen er glukose fosforylert og forvandlet til pyruvat (med en nettoproduksjon av 2 molekyler av ATP per glukosemolekyl), som kan reduseres til laktat eller transporteres inn i mitokondriene for å bli forvandlet til Acetyl-CoA og gå inn i TCA-syklusen. TCA-syklusen fortsetter å sykle drevet med flere molekyler av Acetyl-CoA og produserer CO2 (som til slutt vil spre seg utenfor cellen, og ved å reagere med H2O i mediet, vil generere karbonsyre som vil føre til forsuring av mediet) og NADH, molekylet som har ansvaret for å donere elektroner til elektrontransportkjeden (ETC). Elektronene reiser gjennom forskjellige proteinkomplekser og blir endelig akseptert av oksygen. Disse kompleksene (I, III og IV) pumper også H+ fra mitokondriematrisen inn i mellommembranerommet. Som en konsekvens av den elektrokjemiske gradienten som genereres, vil H+ gå inn igjen til matrisen gjennom den komplekse V (ATP-syntase), investere den potensielle energien akkumulert i generasjonen av ATP.
Både glykose og mitokondrie respirasjon kan blokkeres på forskjellige punkter ved hjelp av inhibitorer. Kunnskapen og bruken av disse hemmerne var grunnlaget for utviklingen av den ekstracellulære fluksanalysen. Ved å måle to enkle parametere i sanntid som pH og oksygen, utleder den ekstracellulære fluksaysatoren frekvensen av glykose og mitokondrieånding i en 96-brønns plate. Glykolysestresstesten utføres i et basalmedium uten glukose (figur 1B)7. De første målingene av den ekstracellulære forsuringsraten (ECAR) indikerer glykolyse-uavhengig forsuring. Det kalles ikke-glykolytisk forsuring og korrelerer med CO2 produsert av TCA som, som forklart tidligere, kombinerer med H2O i mediet for å generere H+ (TCA-koblet ECAR). Den første injeksjonen er glukose for å indusere glukoseutnyttelse og øke glykose. Den andre injeksjonen kombinerer både rotenon, en kompleks I-hemmer, og antimycin A, en kompleks III-hemmer sammen, for å blokkere ETC. Cellene reagerer på denne dramatiske reduksjonen i mitokondrie-ATP-produksjon ved å aktivere glykose for å opprettholde cellulære ATP-nivåer, og dette representerer mengden glykose som ikke brukes av cellen i basaltilstanden, men kan potensielt rekrutteres som svar på økninger i ATP-etterspørsel (kompenserende glykose). Den tredje injeksjonen er glukoseanalogen 2-Deoksygllukose (DG), som konkurrerer med glukose som substrat for enzymet hexokinase. Produktet av denne fosforyleringen, 2-deoksygllukose-6-fosfat kan ikke forvandles til pyruvat, og derfor er glykose blokkert, noe som senker ECAR til et minimum. ECAR målt på dette punktet inkluderer andre kilder til ekstracellulær forsuring som ikke tilskrives glykose eller respiratorisk aktivitet, samt eventuell gjenværende glykolyse som ikke er fullt hemmet av 2-DG (post 2-DG-forsuring).
Mitokondriestresstesten utføres i et medium med glukose (figur 1C)8. De første målingene av oksygenforbruket (OCR) tilsvarer basislinjen for mitokondrierespirasjon (basal respirasjon). Den første injeksjonen er oligomycin, som hemmer retur av protoner gjennom ATP-syntase (kompleks V), blokkerer ATP-syntese og dermed raskt hyperpolariserer mitokondriemembranen, noe som forhindrer ytterligere protonpumping gjennom respiratoriske komplekser, og fører til en reduksjon i OCR. Sammenligningen mellom baseline respirasjon og verdien gitt ved tilsetning av oligomycin representerer ATP-koblet åndedrett. Den gjenværende oligomycin-ufølsomme frekvensen av oksygenforbruk kalles protonlekkasje, som representerer strømmen av protoner gjennom lipid bilayer eller proteiner i den indre mitokondriemembranen som adeninkjernerotidtranslocase9. Den andre injeksjonen er den ukoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), en iionophore som induserer en massiv oppføring av H+ inn i mitokondriematrisen, noe som fører til depolarisering av mitokondriemembranen og forstyrrelse av mitokondrie-ATP-syntese. Celler reagerer på spredning av protonmotivkraften ved å øke frekvensen av elektrontransport og oksygenforbruk til maksimale nivåer i et nytteløst forsøk på å gjenopprette membranpotensialet (maksimal respiratorisk kapasitet). Forskjellen mellom maksimal respiratorisk kapasitet og basal respirasjon er cellens ekstra respiratoriske kapasitet, som representerer mengden åndedrett som ikke brukes av cellen til å generere ATP i basaltilstand, men kan potensielt rekrutteres som svar på økninger i ATP-etterspørsel eller under forhold med stress8. Den tredje injeksjonen er en kombinasjon av rotenon og antimycin A. Denne injeksjonen stopper fullstendig ETC og OCR reduseres til sitt laveste nivå, med det gjenværende oksygenforbruket som ikke-mitokondrie (forårsaket av NADPH-oksidaser, etc.).
Endringer i metabolske veier kan liksom forutsi funksjonen av NK-celler, som det har blitt foreslått at kontinuerlig aktivering av NK-celler med cytokiner in vitro kan føre til NK celleutmattelse ved studiet av forskjellige metabolske veier10,11. Sammenhengen mellom NK celle metabolsk status og funksjon er svært viktig fra synspunkt av kreft immunterapi. I dette feltet har aktivering av NK-celler med infusjon av IL-15, alene eller i kombinasjon med monoklonale terapeutiske antistoffer blitt testet for å forbedre tumorcelledrap12,,13,,14. Kunnskapen om metabolsk status for NK-cellene som svar på disse behandlingsstrategiene ville gi en verdifull prediktor for NK celleaktiveringsstatus og drapsfunksjon.
Studien av metabolske veier i andre myeloide og lymfoide celler som monocytter, T og B celler har blitt beskrevet15 og optimaliserte metoder har blitt publisert16. I denne protokollen gir vi en metode som kombinerer både en NK-isolasjonsprotokoll som gir høyt antall rene og levedyktige NK-celler og en optimalisert protokoll for å måle metabolsk aktivitet ved hjelp av en ekstracellulær fluksaysator. Her viser vi at dette er en gyldig metode for studiet av metabolske endringer i hvile og IL-15 aktiverte menneskelige NK-celler. For den ekstracellulære fluksanalysen har parametere som cellenummer og legemiddelkonsentrasjoner blitt testet og optimalisert. Sammenlignet med andre respirometriske metoder, er den ekstracellulære fluksalysatoren helautomatisk og i stand til å teste i sanntid, med svært lave mengder celler, opptil 92 prøver samtidig, og tillater dermed høy gjennomstrømning screenings (med flere prøver og replikerer) på en relativt raskmåte 17.
Denne metoden kan brukes av forskere som er interessert i å vurdere NK cellefunksjon ved å studere NK cellemetabolisme. Det kan brukes også på celler aktivert av andre cytokiner, antistoffer eller løselige stimuli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D8375-5G</td>
			<td>Glycolyisis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D198501</td>
			<td>ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>NK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDIVA Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT cell proliferation assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C7026</td>
			<td>Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>17851</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human NK cell Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>19055</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>10128-446</td>
			<td>NK sell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>NK cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td>Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15-50ug</td>
			<td>NK cell stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum (HS)</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>9C0539</td>
			<td>NK cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td>NK cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of stress test media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34965</td>
			<td>Viability dye for flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>50494X</td>
			<td>PBMCs separation from human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD3 BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563725</td>
			<td>T cell flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD56 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555516</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human NKp46 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557991</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>75351</td>
			<td>Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BP-115</td>
			<td>Cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Controller Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>Extracellular Flux assay base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Flux Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>To prepare the Cell-Tak solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of human natural killer cell metabolism

Natural Killer (NK) celler medierer hovedsakelig medfødte anti-tumor og anti-viral immunrespons og reagerer på en rekke cytokiner og andre stimuli for å fremme overlevelse, cellulær spredning, produksjon av cytokiner som interferon gamma (IFNγ) og / eller cytotoksisitetsprogrammer. NK celle aktivering av cytokin stimulering krever en betydelig ombygging av metabolske veier for å støtte deres bioenergetiske og biosyntetiske krav. Det er en stor mengde bevis som tyder på at nedsatt NK celle metabolisme er forbundet med en rekke kroniske sykdommer, inkludert fedme og kreft, som fremhever den kliniske betydningen av tilgjengeligheten av en metode for å bestemme NK celle metabolisme. Her beskriver vi bruken av en ekstracellulær fluksaysator, en plattform som tillater sanntidsmålinger av glykose og mitokondrieoksygenforbruk, som et verktøy for å overvåke endringer i energimetabolismen til menneskelige NK-celler. Metoden som er beskrevet her, gjør det også mulig å overvåke metabolske endringer etter stimulering av NK-celler med cytokiner som IL-15, et system som for tiden undersøkes i et bredt spekter av kliniske studier.

Isolering av NK-celler fra perifert blod gir en ren og levedyktig befolkning
Den ekstracellulære fluksanalysen er basert på måling av H+ og O 2 konsentrasjon ibrønnen og vil ikke skille mellom ulike populasjoner av celler eller deres levedyktighet. Av denne grunn var det å få en svært ren og levedyktig befolkning av interessecellen det viktigste skrittet for å lykkes i disse eksperimentene.
Isolering av NK-celler fra pe...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism at JoVE.com

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

I dette papiret beskriver vi en metode for å måle glykose og mitokondriegånding i primære humane Natural Killer (NK) celler isolert fra perifert blod, i ro eller etter IL15-indusert aktivering. Protokollen som beskrives kan lett utvides til primære menneskelige NK-celler aktivert av andre cytokiner eller løselige stimuli.

Analyse av human naturlig killer celle metabolisme

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Denne metoden gjør det mulig å bestemme naturlig killer celle metabolisme. En nøkkelparameter i aktiveringen ved å måle oksygenforbruk og pH-endringer i det ekstracellulære mediet. Fordelen med den ekstracellulære fluksalysatoren er at den er helautomatisk og i stand til å teste opptil 92 prøver i sanntid med lave mengder celler.Dermed tillater høy gjennomstrømning skjermer. En gyldig metode for å bestemme glykose og respirasjon i inky celler er svært viktig i klinikken. Siden det er mange sykdommer, inkludert fedme og kreft der inky celle metabolisme er svekket.Begynn med å pipettere 20 milliliter lymfocyttseparasjonsmedium i et 50 milliliter konisk rør. Mens du holder røret i 30 graders vinkel, forsiktig pipette 20 milliliter blod over mediet. Opprette et synlig og veldefinert grensesnitt mellom de to væskene.Sentrifuger rørene i 25 minutter ved 1000 ganger G.Ta deretter forsiktig rørene ut av sentrifugen og legg dem i et stativ. Se etter tilstedeværelsen av et iøynefallende lag av celler i grensesnittet mellom LSM og plasma. Aspirer forsiktig det mononukleære cellelaget med en 10 milliliter plastpipette og legg den i et nytt konisk rør på 50 milliliter.Vask de mononukleære cellene to ganger med 45 milliliter PBS. Og sentrifuge dem på 800 ganger G i fem minutter. For å isolere de naturlige mordercellene eller engavene, telle PVM-havet og gjenbruke dem i NK-separasjonsbuffer på en gang 10 til åttende celler per milliliter.Deretter overfører du 10 milliliter av cellesuspensjonen til et nytt 50 milliliter rør. Tilsett 500 mikroliter NK celleisolering antistoffblanding. Og 10 mikroliter anti CD tre positiv isolasjon antistoff blanding til PBMCs.Og inkuber dem ved romtemperatur i 10 minutter. Vortex magnetiske perler og tilsett en milliliter til PBMCs og antistoffer. Deretter inkubere MIGS i 10 minutter ved romtemperatur med sporadisk omrøring.Tilsett 35 milliliter NK isolasjonsbuffer og plasser røret på magneten i 15 minutter. Samle forsiktig supernatanten med en 50 milliliter plastpipette uten å berøre sidene eller bunnen av røret. Tell cellene og sentrifuger dem ved 800 ganger G i fem minutter.For å stimulere NK-cellene med løselig midtgang 15, gjenbruker du 750 000 celler i 100 mikroliter imdm som inneholder 10% HS i en brønn av en 96 brønnplate. Fortynn menneskelig midtgang 15 til ett mikrogram per milliliter i IMDM og 10% HS. Og tilsett 100 mikroliter av den fortynnede menneskelige midtgangen 15 til cellene.Reparer en kontrollprøve med ustimulerte celler og plasser begge prøvene i inkubatoren ved 37 grader Celsius. Stimuler cellene i 48 timer og utfør deretter den ekstracellulære fluksanalysen. Dagen før eksperimentet, slå på analysatoren og la den varme opp til 37 grader Celsius.Åpne sensurkassettpakken og skill patronen fra verktøyplaten. Tilsett deretter 200 mikroliter av kalibrantløsningen til hver brønn av nytteplaten. Og sett den sentrale patronen tilbake for å sikre at sensorene er helt nedsenket.For optimale resultater inkuber patronen over natten ved 37 grader Celsius i en karbondioksidfri inkubator. Som riktig fuktet. For å forberede et klebende belagt blad, pipette 25 mikroliter av cellelimløsningen til hver brønn av platen.Og ruges ved romtemperatur i 20 minutter. Fjern deretter oppløsningen og vask platen to ganger med 200 mikroliter sterilt vann per brønn. Hold platen åpen i 15 minutter inne i cellekulturhetten slik at brønnene tørker.Sentrifuge de tidligere isolerte NK-cellene legger til 200 ganger G i fem minutter. Fjern deretter supernativa og vask cellene i oppvarmet mitokondriestresstestmedium eller glykosestresstestmedium. Pellet cellene igjen og resuspend dem til foretrukket cellekonsentrasjon i samme medium.Legg 180 mikroliter cellefjæring per brønn inn i analyseplaten. Bruk brønner A, A 12 H en og H 12 som kontrollbrønner for bakgrunnskorreksjon. Tilsett 180 mikroliter av analysemediet til disse brønnene inkubere platen i 30 minutter ved 37 grader Celsius i en karbondioksidfri inkubator.Sentrifuger platen ved 200 ganger G i fem minutter. Observer deretter cellene under mikroskopet for å kontrollere at de danner et manolag nederst i brønnen. Inkuber cellene i ytterligere 25 minutter.Varme arbeidsløsninger til 37 grader Celsius. Og juster pH-en på nytt til 7,4 om nødvendig. Last de tidligere forberedte forbindelsene for en mitokondriestresstest eller for en glykolysestresstest i styrene A, B og C i den hydrerte sensurkassetten Sett den lastede sensurkassetten tilbake i inkubatoren mens du setter opp programmet.Hvis du vil konfigurere den ekstracellulære fluksanalyseprotokollen, åpner du programvaren og bruker gruppedefinisjoner til å definere forbehandlingsbetingelsene. Bruk platekartfanen til å angi grupper av brønner som har lignende forhold Også indikere bakgrunnskorrigering og tomme brønner. Deretter angir du programmet i kategorien protokoller.Start programmet og plasser sensorkassetten og nytteplaten på skuffen. Etter kalibreringstrinnet erstatter du kalibrantplaten for analyseplaten med de vedlagte cellene. Når kjøringen er fullført, henter du dataene og analyserer dem.For å vurdere renheten og levedyktigheten til NK-cellene. Små Alec Watts fra PVM hav og den isolerte NK cellepopulasjonen ble farget og analysert av strømningscytometri. Renheten av NK cellepopulasjonen ble etablert ved dobbelt opphold mot CD tre og CD 56 eller NKP 46.Mye mitokondrie oksygenforbruk for de menneskelige NK-cellene er vist her. Som forventet viste jeg cellenumre høyere OCR-verdier. Celletall korrelerte også lineært med mengden DNA eller protein i brønnen.På den annen side høyere celletall var ikke optimal. Fordi ved tilsetning av DNP, oksygenkonsentrasjonen i brønnen ble helt utarmet i hver syklus. Som forhindret nøyaktig beregning av OCR.I humane NK-celler ble 100 mikromolar DNP funnet å være den optimale dosen. Et typisk mitokondriestresstesteksperiment med 750 000 NK-celler per brønn er vist her. I denne testen fører Oligomycin til en dramatisk reduksjon i oksygenforbruket.Og en økning i ECAR. Som representerer en bryter til glykose og et forsøk på å opprettholde cellulære ATP nivåer. Aktivering av NK-cellene ved midtgangen 15 forårsaket en økning i både mitokondriegensyreforbruk og ekstracellulær forsuring.Basal Maximal og ATP koblet respirasjon økt, men ikke protonlekkasje eller ikke mitokondrie respirasjon. Videre reduserte OCR/ECA-frekvensen Indikerer et skifte til en glykolytisk metabolisme etter IL 15-stimulering. Når du utfører denne protokollen, er det svært viktig å oppnå en ren og sunn cellepopulasjon for å bestemme det optimale cellenummeret og titrere konsentrasjonen av uncablers.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening mot intracellulære<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Menneskelig Akutt monocyttisk leukemi cellelinje

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Kunstig antigenpresenterende Cell (AAPC) mediert aktivering og utvidelse av Natural Killer T celler

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-oppløsning Imaging of Natural Killer Cell Immunologiske Synapse på en Glass-støttet Planar lipidbilag

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyttisolasjonsmetoder fra menneskelig hud for fenotypeanalyser og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Kvantifisere menneskelige Monocyte Chemotaxis In Vitro og Murine lymfocytt menneskehandel Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm formasjon i Candida albicans bruker en automatisert Microfluidic enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...