Name: analysis of human natural killer cell metabolism
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism at JoVE.com

Os autores agradecem ao Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) pelo apoio e discussão. Este estudo foi apoiado pelos Programas de Pesquisa Intramuros dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Câncer e Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue. JT é apoiado pelo programa Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) da MICINN (Espanha).

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a Declaração dos princípios éticos da pesquisa médica de Helsinque. Amostras de sangue periféricas de doadores foram obtidas do Departamento de Medicina transfusional do NIH sob o protocolo aprovado pelo IRB 99-CC-0168, com consentimento informado por escrito do paciente.
1. Preparação do reagente
<ol><li>
Reagentes para o isolamento de células NK NOTAs: Prepare esses reagentes em um capuz de cultura celular.<o...

<ol>
	<li>Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+natural+killer+cell+responses:+integration+of+signals+for+activation+and+inhibition.">Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition.</a> Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).</li><li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells.">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li><li>Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Proliferation+Induced+by+IL-15+Transpresentation+Is+Negatively+Regulated+by+Inhibitory+Receptors.">NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors.</a> Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).</li><li>Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-2+augments+natural+killer+cell+activity.">Interleukin-2 augments natural killer cell activity.</a> Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).</li><li>Anton, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-endocytosis+of+intact+IL-15Ralpha-IL-15+complex+from+presenting+cells+into+NK+cells+favors+signaling+for+proliferation.">Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).</li><li>Marcais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+checkpoint+kinase+mTOR+is+essential+for+IL-15+signaling+during+the+development+and+activation+of+NK+cells.">The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells.</a> Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).</li><li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements.">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases.">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).</li><li>Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Metabolism+and+Tumor+Microenvironment.">NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).</li><li>Felices, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+treatment+with+IL-15+exhausts+human+NK+cells+via+a+metabolic+defect.">Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+First-in-Human+Phase+I+Study+of+Subcutaneous+Outpatient+Recombinant+Human+IL15+(rhIL15)+in+Adults+with+Advanced+Solid+Tumors.">A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).</li><li>Conlon, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+by+Continuous+Intravenous+Infusion+to+Adult+Patients+with+Solid+Tumors+in+a+Phase+I+Trial+Induced+Dramatic+NK-Cell+Subset+Expansion.">IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).</li><li>Dubois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+Infusion+of+Cancer+Patients+Expands+the+Subpopulation+of+Cytotoxic+CD56(bright)+NK+Cells+and+Increases+NK-Cell+Cytokine+Release+Capabilities.">IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities.</a> Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).</li><li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects.">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes.">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions.">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).</li><li>Theorell, J., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Intracellular+Ca(2+)+Mobilization+in+Human+NK+Cell+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).</li><li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements.">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li><li>O'Brien, K. L., Finlay, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunometabolism+and+natural+killer+cell+responses.">Immunometabolism and natural killer cell responses.</a> Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).</li><li>Ahn, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+mitochondrial+deacetylase+Sirt3+in+regulating+energy+homeostasis.">A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).</li><li>Stram, A. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+mitochondria:+protein+signaling+in+the+powerhouse.">Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).</li><li>Armstrong, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+alters+mitochondrial+bioenergetics+and+modifies+pancreatic+cell+death+independently+of+cyclophilin+D,+resulting+in+an+apoptosis-to-necrosis+shift.">Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate.">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).</li><li>Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+lipophilic+cation+for+determination+of+membrane+potential+in+neuroblastoma-glioma+hybrid+cell+suspensions.">Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).</li><li>Michelet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+natural+killer+cells+in+obesity+limits+antitumor+responses.">Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).</li></ol>

Neste artigo, estabelecemos um protocolo para isolar e culminar eficientemente células NK humanas primárias puras e viáveis a partir de sangue periférico. Também otimizamos as condições para a medição da atividade metabólica dessas células NK avaliadas pela taxa de consumo de oxigênio e taxa de acidificação extracelular usando um analisador de fluxo extracelular. Comparado com outros métodos respirométricos, o analisador de fluxo extracelular é rápido, requer um pequeno número de células e permite tri...

As células do Natural Killer (NK) são linfócitos inatos que mediam respostas anti-tumor e antivirais. As células NK compreendem 5-15% de todos os linfócitos no sangue periférico humano, e também podem ser encontradas em baço, fígado, medula óssea e linfonodos. As células NK não expressam receptores clonotípicos polimórficos, como receptores de células T (TCR) ou receptores de células B (BCR). Em contraste, a ativação de suas funções citíticas é motivada pelo engajamento de receptores que reconhecem ligantes invariáveis na superfície de uma célula alvo1,2.
Células NK humanas descansando isoladas do sangue periférico podem sobreviver por vários dias em meio de cultura suplementada com soro humano. A ativação de células NK por citocinas como IL-15 ou IL-2 leva as células à proliferação e ao aumento de sua capacidade de matar, entre outros efeitos3,,4,,5. Vários estudos têm mostrado uma correlação direta entre a ativação celular NK e mudanças em sua atividade metabólica6. Essas alterações metabólicas são destinadas a atender aos requisitos particulares das células em termos de energia e biossíntese.
Células aeróbicas e organismos obtêm energia através de uma série de reações químicas que envolvem o catabolismo e oxidação de carboidratos, gorduras e proteínas. Através de uma combinação de glicólise, o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e a fosforilação oxidativa, as células eucarióticas atendem a maioria de sua demanda ATP e obtêm intermediários necessários como blocos de construção para macromoléculas essenciais para o crescimento e proliferação celular. O processo de glicólise (Figura 1A) começa com a entrada de glicose na célula. No citosol, a glicose é fosforilada e transformada em piruvato (com uma produção líquida de 2 moléculas de ATP por molécula de glicose), que pode ser reduzida a lactato ou transportada para as mitocôndrias para ser transformada em Acetil-CoA e entrar no ciclo TCA. O ciclo TCA continua pedalando abastecido com mais moléculas de Acetil-CoA e produz CO2 (que eventualmente se difundirá fora da célula e, reagindo com H2O no meio, gerará ácido carbônico que levará à acidificação do meio) e NADH, a molécula encarregada de doar elétrons para a cadeia de transporte de elétrons (ETC). Os elétrons viajam através de diferentes complexos proteicos e são finalmente aceitos pelo oxigênio. Esses complexos (I, III e IV) também bombeiam H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrano. Como consequência do gradiente eletroquímico gerado, o H+ entrará novamente na matriz através do complexo V (ATP-synthase), investindo a energia potencial acumulada na geração de ATP.
Tanto a glicolise quanto a respiração mitocondrial podem ser bloqueadas em diferentes pontos usando inibidores. O conhecimento e o uso desses inibidores foram a base para o desenvolvimento do ensaio de fluxo extracelular. Medindo dois parâmetros simples em tempo real, como pH e oxigênio, o analisador de fluxo extracelular infere a taxa de glicolise e respiração mitocondrial em uma placa de 96 poços. O teste de estresse da glicólise é realizado em um meio basal sem glicose (Figura 1B)7. As primeiras medidas da taxa de acidificação extracelular (ECAR) são indicativas de acidificação independente da glicólise. É referido como acidificação não glicolítico e se correlaciona com o CO2 produzido pelo TCA que, como explicado anteriormente, combina com H2O no meio para gerar H+ (ECAR ligado ao TCA). A primeira injeção é a glicose para induzir a utilização da glicose e aumentar a glicólise. A segunda injeção combina ambos rotenone, um inibidor complexo I, e antimicina A, um inibidor complexo III em conjunto, para bloquear o ETC. As células respondem a essa dramática diminuição na produção de ATP mitocondrial ativando a glicolise para manter os níveis de ATP celular, e isso representa a quantidade de glicólise que não é usada pela célula no estado basal, mas poderia ser potencialmente recrutada em resposta ao aumento da demanda da ATP (glicolycolysis compensatória). A terceira injeção é a glicose analógica 2-Desoxicose (DG), que compete com a glicose como substrato para a enzima hexokinase. O produto desta fosforilação, 2-desoxicosglucose-6-fosfato não pode ser transformado em piruvato, e, portanto, a glicólise é bloqueada, o que reduz o ECAR ao seu mínimo. O ECAR medido neste ponto inclui outras fontes de acidificação extracelular que não são atribuídas à glicólise ou atividade respiratória, bem como qualquer glicolise residual não totalmente inibida pelo 2-DG (pós 2-DG-acidificação).
O teste de estresse mitocondrial é realizado em um meio com glicose (Figura 1C)8. As primeiras medições da taxa de consumo de oxigênio (OCR) correspondem à linha base da respiração mitocondrial (respiração basal). A primeira injeção é a oligomicina, que inibe o retorno de prótons através da sintetizadora ATP (complexa V), bloqueando a síntese de ATP e, assim, hiperpolarizar rapidamente a membrana mitocondrial, que impede o bombeamento de prótons através de complexos respiratórios, e leva a uma diminuição do OCR. A comparação entre a respiração da linha de base e o valor dado pela adição de oligomicina representa a respiração ligada à ATP. A taxa de consumo insensível de oligomicina remanescente é chamada de vazamento de prótons, que representa o fluxo de prótons através do bicamadorão lipídico ou proteínas na membrana mitocondrial interna, como o nucleotídeo de adenina translocase9. A segunda injeção é o uncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), um ionóforo que induz uma entrada maciça de H+ na matriz mitocondrial, o que leva à despolarização da membrana mitocondrial e à interrupção da síntese mitocondrial do ATP. As células respondem à dissipação da força-motivo do próton aumentando a taxa de transporte de elétrons e consumo de oxigênio para níveis máximos em uma tentativa fútil de recuperar o potencial da membrana (capacidade respiratória máxima). A diferença entre a capacidade respiratória máxima e a respiração basal é a capacidade respiratória sobressal da célula, que representa a quantidade de respiração que não é usada pela célula para gerar ATP no estado basal, mas pode ser potencialmente recrutada em resposta ao aumento da demanda de ATP ou sob condições de estresse8. A terceira injeção é uma combinação de rotenona e antimicina A. Esta injeção interrompe completamente o ETC e o OCR diminui para seu nível mais baixo, com o consumo restante de oxigênio sendo não mitocondrial (causado por NADPH-oxidases, etc.).
Mudanças nas vias metabólicas poderiam de alguma forma prever o funcionamento das células NK, como tem sido sugerido que a ativação contínua de células NK com citocinas in vitro poderia levar à exaustão celular NK pelo estudo de diferentes vias metabólicas10,,11. A correlação entre o estado metabólico das células NK e a função é muito importante do ponto de vista da imunoterapia do câncer. Neste campo, a ativação de células NK com infusão de IL-15, isoladamente ou em combinação com anticorpos terapêuticos monoclonais foram testadas a fim de melhorar a morte de células tumorais12,,13,14. O conhecimento do estado metabólico das células NK em resposta a essas estratégias de tratamento forneceria um valioso preditor do status de ativação celular NK e função de morte.
O estudo de vias metabólicas em outras células mieloides e linfoides, como monócitos, células T e B, foi descrito15 e métodos otimizados foram publicados16. Neste protocolo, fornecemos um método que combina tanto um protocolo de isolamento NK que produz altos números de células NK puras e viáveis e um protocolo otimizado para medir a atividade metabólica usando um analisador de fluxo extracelular. Aqui mostramos que este é um método válido para o estudo de alterações metabólicas em repouso e células NK humanas ativadas il-15. Para o ensaio de fluxo extracelular, parâmetros como número de células e concentrações de drogas foram testados e otimizados. Comparado com outros métodos respirométricos, o analisador de fluxo extracelular é totalmente automatizado e capaz de testar em tempo real, com quantidades muito baixas de células, até 92 amostras simultaneamente, e assim permite triagens de alto rendimento (com múltiplas amostras e réplicas) de forma relativamente rápida17.
Este método pode ser usado por pesquisadores interessados em avaliar a função celular NK estudando o metabolismo celular NK. Pode ser aplicado também às células ativadas por outras citocinas, anticorpos ou estímulos solúveis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D8375-5G</td>
			<td>Glycolyisis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D198501</td>
			<td>ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>NK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDIVA Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT cell proliferation assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C7026</td>
			<td>Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>17851</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human NK cell Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>19055</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>10128-446</td>
			<td>NK sell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>NK cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td>Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15-50ug</td>
			<td>NK cell stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum (HS)</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>9C0539</td>
			<td>NK cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td>NK cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of stress test media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34965</td>
			<td>Viability dye for flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>50494X</td>
			<td>PBMCs separation from human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD3 BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563725</td>
			<td>T cell flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD56 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555516</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human NKp46 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557991</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>75351</td>
			<td>Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BP-115</td>
			<td>Cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Controller Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>Extracellular Flux assay base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Flux Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>To prepare the Cell-Tak solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of human natural killer cell metabolism

As células do Natural Killer (NK) mediam principalmente respostas anti-tumor e imunes antivirais e respondem a uma variedade de citocinas e outros estímulos para promover a sobrevivência, a proliferação celular, a produção de citocinas como os programas de interferon gama (IFNγ) e/ou citotoxicidade. A ativação celular NK por estimulação de citocina requer uma remodelagem substancial das vias metabólicas para suportar seus requisitos bioenergésicos e biossintéticos. Há um grande conjunto de evidências que sugerem que o metabolismo celular NK prejudicado está associado a uma série de doenças crônicas, incluindo obesidade e câncer, o que destaca a importância clínica da disponibilidade de um método para determinar o metabolismo celular NK. Aqui descrevemos o uso de um analisador de fluxo extracelular, uma plataforma que permite medições em tempo real de glicolise e consumo mitocondrial de oxigênio, como uma ferramenta para monitorar mudanças no metabolismo energético das células NK humanas. O método aqui descrito também permite o monitoramento de alterações metabólicas após a estimulação de células NK com citocinas como o IL-15, um sistema que está sendo investigado atualmente em uma ampla gama de ensaios clínicos.

O isolamento das células NK do sangue periférico proporciona uma população pura e viável
O ensaio de fluxo extracelular baseia-se na medição da concentração de H+ e O2 no poço e não distinguirá entre diferentes populações de células ou sua viabilidade. Por essa razão, a obtenção de uma população altamente pura e viável da célula de interesse foi o passo fundamental para ter sucesso nesses experimentos.
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Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Neste artigo, descrevemos um método para medir a glicólise e a respiração mitocondrial em células primárias do Assassino Natural (NK) humanas isoladas do sangue periférico, em repouso ou após a ativação induzida pelo IL15. O protocolo descrito poderia ser facilmente estendido para células NK humanas primárias ativadas por outras citocinas ou estímulos solúveis.

Análise do Metabolismo celular assassino natural humano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Este método permite a determinação do metabolismo celular assassino natural. Um parâmetro-chave na ativação medindo o consumo de oxigênio e as alterações de pH no meio extracelular. A vantagem do analisador de fluxo extracelular é que ele é totalmente automatizado e capaz de testar até 92 amostras em tempo real com baixas quantidades de células.Permitindo assim telas de alto rendimento. Um método válido para determinar a glicólise e a respiração em células inky é muito importante na clínica. Uma vez que existem muitas doenças, incluindo obesidade e câncer, onde o metabolismo celular inky é prejudicado.Comece por tubos de 20 mililitros de meio de separação de linfócitos em um tubo cônico de 50 mililitros. Mantendo o tubo no ângulo de 30 graus, gentilmente pipeta 20 mililitros de sangue sobre o meio. Criando uma interface visível e bem definida entre os dois fluidos.Centrifugar os tubos por 25 minutos a 1000 vezes G.Em seguida, retire cuidadosamente os tubos da centrífuga e coloque-os em um rack. Verifique se há uma camada visível de células na interface entre LSM e plasma. Aspire suavemente a camada de célula mononuclear com uma pipeta de plástico de 10 mililitros e coloque-a em um novo tubo cônico de 50 mililitros.Lave as células mononucleares duas vezes com 45 mililitros de PBS. E centrifuá-los a 800 vezes G por cinco minutos. Para isolar as células assassinas naturais ou engaves, conte os mares PVM e resuspensá-los no tampão de separação NK em uma vez 10 para as oitavas células por mililitro.Em seguida, transfira 10 mililitros da suspensão celular para um novo tubo de 50 mililitros. Adicione 500 microliters da mistura de anticorpos de isolamento celular NK. E 10 microliters de anti CD três mistura de anticorpos de isolamento positivo para os PBMCs.E incuba-los à temperatura ambiente por 10 minutos. Contas magnéticas de vórtice e adicione um mililitro aos PBMCs e anticorpos. Em seguida, incubar o MIGS por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação ocasional.Adicione 35 mililitros de tampão de isolamento NK e coloque o tubo no ímã por 15 minutos. Colete cuidadosamente o supernatante com uma pipeta de plástico de 50 mililitros sem tocar nas laterais ou na parte inferior do tubo. Conte as células e centrífuga-as a 800 vezes G por cinco minutos.Para estimular as células NK com corredor solúvel 15, resuspenque 750.000 células em 100 microliters de IMDM contendo 10%HS em um poço de uma placa de poço 96. Diluir corredor humano 15 a um micrograma por mililitro no IMDM e 10% HS. E adicione 100 microliters do corredor humano diluído 15 às células.Repare uma amostra de controle com células não estimuladas e coloque ambas as amostras na incubadora a 37 graus Celsius. Estimule as células por 48 horas e realize o ensaio de fluxo extracelular. Um dia antes do experimento, ligue o analisador e deixe aquecer até 37 graus Celsius.Abra o pacote do cartucho de censura e separe o cartucho da placa de utilidade. Em seguida, adicione 200 microliters da solução calibrante a cada poço da placa de utilidade. E coloque o cartucho central de volta para garantir que os sensores estão completamente submersos.Para obter resultados ideais, incubar o cartucho durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora livre de dióxido de carbono. Que corretamente umidificado. Para preparar uma lâmina revestida de adesivo, pipeta 25 microliters da solução adesiva celular para cada poço da placa.E incubado à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, remova a solução e lave a placa duas vezes com 200 microliters de água estéril por poço. Mantenha a placa aberta por 15 minutos dentro do capô de cultura celular para permitir que os poços sequem.Centrifugar as células NK anteriormente isoladas adicionam 200 vezes G por cinco minutos. Em seguida, remova os supernacantes e lave as células em meio de teste de estresse mitocondrial aquecido ou meio de teste de estresse glicólise. Pelotar as células novamente e resuspensá-las para a concentração celular preferida no mesmo meio.Coloque 180 microliters de suspensão celular por poço na placa de ensaio. Use poços A, A 12 H um e H 12 como poços de controle para correção de fundo. Adicionando 180 microliters do meio de ensaio a estes Poços Incubar a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora livre de dióxido de carbono.Centrifugar a placa a 200 vezes G por cinco minutos. Em seguida, observe as células sob o microscópio para verificar se elas formam uma camada mano na parte inferior do poço. Incubar as células por mais 25 minutos.Soluções de trabalho quentes a 37 graus Celsius. E reajustar o pH para 7,4, se necessário. Carregue os compostos previamente preparados para um teste de estresse mitocondrial ou para um teste de estresse de glicolise nas placas A, B e C do cartucho de censura hidratado Coloque o cartucho de censura carregado de volta na incubadora durante a configuração do programa.Para configurar o protocolo de ensaio de fluxo extracelular, abra o software e use as definições do Grupo para definir as condições de pré-tratamento. Use a guia Mapa Placa para indicar os grupos de poços que possuem condições semelhantes Também indique a correção de fundo e os poços vazios. Em seguida, defina o programa na guia protocolos.Inicie o programa e coloque o cartucho do sensor e a placa de utilidade na bandeja. Após a etapa de calibração, substitua a placa calibrante pela placa de ensaio pelas células anexadas. Uma vez concluída a execução, recupere os dados e analise-os.A fim de avaliar a pureza e viabilidade das células NK. O pequeno Alec Watts dos mares PVM e a população isolada de células NK foram manchados e analisados por citometria de fluxo. A pureza da população celular NK foi estabelecida por dupla permanência contra CD três e CD 56 ou NKP 46.Muitas taxas de consumo de oxigênio mitocondrial para as células NK humanas são mostradas aqui. Como esperado, os números de células I apresentaram valores OCR mais altos. Os números celulares também se correlacionam linearmente com a quantidade de DNA ou proteína no poço.Por outro lado, os números de células mais elevados não foram ótimos. Porque após a adição de DNP, a concentração de oxigênio no poço foi totalmente esgotada em cada ciclo. O que impediu o cálculo preciso do OCR.Nas células NK humanas, 100 DNP micromolar foram encontrados como a dose ideal. Um típico experimento de teste de estresse mitocondrial com 750.000 células NK por poço é mostrado aqui. Neste teste, a oligomicina leva a uma redução drástica no consumo de oxigênio.E um aumento no ECAR. O que representa uma mudança para a glicólise e um esforço para manter os níveis de ATP celulares. A ativação das células NK pelo corredor 15 causou um aumento tanto no consumo mitocondrial de oxigênio quanto na acidificação extracelular.A respiração ligada a Basal Maximal e ATP aumentou, mas não o vazamento de prótons ou a respiração não mitocondrial. Além disso, a taxa de OCR/ECA diminuiu indicando uma mudança para um metabolismo glicóltico após a estimulação do IL 15. Ao realizar este protocolo, é muito importante obter uma população celular pura e saudável para determinar o número ideal da célula e para titular a concentração de uncablers.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Imunologia e Infecção

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...