Name: analysis of human natural killer cell metabolism
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism at JoVE.com

Los autores agradecen al Dr. Michael N. Sack (Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre) el apoyo y la discusión. Este estudio fue apoyado por los Programas de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer y el Instituto Nacional del Corazón, pulmón y sangre. JT cuenta con el apoyo del programa Ramón y Cajal (beca RYC2018-026050-I) de MICINN (España).

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los principios éticos de investigación médica de la Declaración de Helsinki. Las muestras de sangre periférica de donantes se obtuvieron del Departamento de Medicina de Transfusión de los NIH bajo el protocolo aprobado por el IRB 99-CC-0168, con el consentimiento informado por escrito del paciente.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>
Reactivos para el aislamiento de células NK NOTA: Prepare estos reactivos en un...

<ol>
	<li>Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+natural+killer+cell+responses:+integration+of+signals+for+activation+and+inhibition.">Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition.</a> Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).</li><li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells.">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li><li>Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Proliferation+Induced+by+IL-15+Transpresentation+Is+Negatively+Regulated+by+Inhibitory+Receptors.">NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors.</a> Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).</li><li>Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-2+augments+natural+killer+cell+activity.">Interleukin-2 augments natural killer cell activity.</a> Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).</li><li>Anton, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-endocytosis+of+intact+IL-15Ralpha-IL-15+complex+from+presenting+cells+into+NK+cells+favors+signaling+for+proliferation.">Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).</li><li>Marcais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+checkpoint+kinase+mTOR+is+essential+for+IL-15+signaling+during+the+development+and+activation+of+NK+cells.">The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells.</a> Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).</li><li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements.">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases.">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).</li><li>Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Metabolism+and+Tumor+Microenvironment.">NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).</li><li>Felices, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+treatment+with+IL-15+exhausts+human+NK+cells+via+a+metabolic+defect.">Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+First-in-Human+Phase+I+Study+of+Subcutaneous+Outpatient+Recombinant+Human+IL15+(rhIL15)+in+Adults+with+Advanced+Solid+Tumors.">A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).</li><li>Conlon, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+by+Continuous+Intravenous+Infusion+to+Adult+Patients+with+Solid+Tumors+in+a+Phase+I+Trial+Induced+Dramatic+NK-Cell+Subset+Expansion.">IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).</li><li>Dubois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+Infusion+of+Cancer+Patients+Expands+the+Subpopulation+of+Cytotoxic+CD56(bright)+NK+Cells+and+Increases+NK-Cell+Cytokine+Release+Capabilities.">IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities.</a> Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).</li><li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects.">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes.">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions.">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).</li><li>Theorell, J., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Intracellular+Ca(2+)+Mobilization+in+Human+NK+Cell+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).</li><li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements.">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li><li>O'Brien, K. L., Finlay, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunometabolism+and+natural+killer+cell+responses.">Immunometabolism and natural killer cell responses.</a> Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).</li><li>Ahn, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+mitochondrial+deacetylase+Sirt3+in+regulating+energy+homeostasis.">A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).</li><li>Stram, A. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+mitochondria:+protein+signaling+in+the+powerhouse.">Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).</li><li>Armstrong, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+alters+mitochondrial+bioenergetics+and+modifies+pancreatic+cell+death+independently+of+cyclophilin+D,+resulting+in+an+apoptosis-to-necrosis+shift.">Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate.">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).</li><li>Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+lipophilic+cation+for+determination+of+membrane+potential+in+neuroblastoma-glioma+hybrid+cell+suspensions.">Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).</li><li>Michelet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+natural+killer+cells+in+obesity+limits+antitumor+responses.">Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).</li></ol>

En este artículo, hemos establecido un protocolo para aislar y cultivar eficientemente células NK humanas primarias y viables a partir de sangre periférica. También hemos optimizado las condiciones para la medición de la actividad metabólica de estas células NK evaluadas por la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular mediante el uso de un analizador de flujo extracelular. En comparación con otros métodos respirométricos, el analizador de flujo extracelular es rápido, requiere un pe...

Las células de Natural Killer (NK) son linfocitos innatos que median las respuestas antitumorales y antivirales. Las células NK comprenden entre el 5 y el 15% de todos los linfocitos en la sangre periférica humana, y también se pueden encontrar en el bazo, el hígado, la médula ósea y los ganglios linfáticos. Las células NK no expresan receptores clonotípicos polimórficos, como los receptores de células T (TCR) o los receptores de células B (BCR). Por el contrario, la activación de sus funciones citolíticas se debe a la realización de receptores que reconocen ligandos invariables en la superficie de una célula diana1,2.
Células NK humanas en reposo aisladas de la sangre periférica pueden sobrevivir durante varios días en medio de cultivo complementado con suero humano. La activación de las células NK por citoquinas como IL-15 o IL-2 impulsa las células a la proliferación y a un aumento de su capacidad de matar, entre otros efectos3,,4,,5. Varios estudios han demostrado una correlación directa entre la activación de la célula NK y los cambios en su actividad metabólica6. Estos cambios metabólicos están destinados a satisfacer los requisitos particulares de las células en términos de energía y biosíntesis.
Las células y organismos aeróbicos obtienen energía a través de una serie de reacciones químicas que implican el catabolismo y la oxidación de carbohidratos, grasas y proteínas. A través de una combinación de glucólisis, el ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, las células eucariotas satisfacen la mayoría de su demanda de ATP y obtienen los intermedios necesarios como bloques de construcción para macromoléculas esenciales para el crecimiento celular y la proliferación. El proceso de glucólisis (Figura 1A) comienza con la entrada de glucosa en la célula. En el citosol, la glucosa se fosforila y se transforma en piruvato (con una producción neta de 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa), que se puede reducir a lactato o transportarse en las mitocondrias para transformarse en acetil-coa y entrar en el ciclo TCA. El ciclo TCA continúa en bicicleta alimentado con más moléculas de acetil-CoA y produce CO2 (que eventualmente se difunderá fuera de la célula y, al reaccionar con H2O en el medio, generará ácido carbónico que conducirá a la acidificación del medio) y NADH, la molécula encargada de donar electrones a la cadena de transporte de electrones (ETC). Los electrones viajan a través de diferentes complejos proteicos y finalmente son aceptados por el oxígeno. Estos complejos (I, III y IV) también bombean H+ desde la matriz mitocondrial en el espacio intermembrano. Como consecuencia del gradiente electroquímico generado, el H + entraráde nuevo en la matriz a través del complejo V (ATP-sintasa), invirtiendo la energía potencial acumulada en la generación de ATP.
Tanto la glucólisis como la respiración mitocondrial se pueden bloquear en diferentes puntos mediante el uso de inhibidores. El conocimiento y uso de estos inhibidores fue la base para el desarrollo del ensayo de flujo extracelular. Mediante la medición de dos parámetros simples en tiempo real como el pH y el oxígeno, el analizador de flujo extracelular infiere la tasa de glucólisis y respiración mitocondrial en una placa de 96 pozos. La prueba de esfuerzo de glucólisis se realiza en un medio basal sin glucosa (Figura 1B)7. Las primeras mediciones de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) son indicativas de acidificación independiente de la glucólisis. Se conoce como acidificación no glucolítica y se correlaciona con elCO2 producido por el TCA que, como se explicó anteriormente, se combina con H2O en el medio para generar H+ (ECAR ligado a TCA). La primera inyección es glucosa para inducir la utilización de glucosa y aumentar la glucólisis. La segunda inyección combina tanto la rotenona, un inhibidor del Complejo I, y la antimicina A, un inhibidor del Complejo III juntos, para bloquear el ETC. Las células responden a esta disminución dramática en la producción de ATP mitocondrial mediante la activación de la glucólisis para mantener los niveles celulares de ATP, y esto representa la cantidad de glucólisis que no es utilizada por la célula en el estado basal, pero podría ser potencialmente reclutada en respuesta a aumentos en la demanda de ATP (glicólisis). La tercera inyección es la glucosa análoga 2-Deoxyglucosa (DG), que compite con la glucosa como sustrato de la enzima hexoquinasa. El producto de esta fosforilación, 2-desoxiglucosa-6-fosfato no se puede transformar en piruvato, y por lo tanto se bloquea la glucólisis, lo que reduce el ECAR al mínimo. El ECAR medido en este punto incluye otras fuentes de acidificación extracelular que no se atribuyen a la glucólisis o actividad respiratoria, así como cualquier glucólisis residual no inhibida completamente por 2-DG (post 2-DG-acidificación).
La prueba de esfuerzo mitocondrial se realiza en un medio con glucosa (Figura 1C)8. Las primeras mediciones de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) corresponden a la línea base de la respiración mitocondrial (respiración basal). La primera inyección es la oligomicina, que inhibe el retorno de protones a través de la ATP sintasa (complejo V), bloqueando la síntesis de ATP y por lo tanto hiperpolarizar rápidamente la membrana mitocondrial, que evita el bombeo de protones a través de complejos respiratorios, y conduce a una disminución en el OCR. La comparación entre la respiración de línea de base y el valor dado por la adición de oligomicina representa la respiración vinculada a ATP. La tasa restante de consumo de oxígeno que no tiene en cuenta la oligomicina se denomina fuga de protones, que representa el flujo de protones a través de la bicapía lipídica o proteínas en la membrana mitocondrial interna, como el translocase nucleótido de adenina9. La segunda inyección es el desacoplador 2,4-dinitrofenol (DNP), un ionóforo que induce una entrada masiva de H+ en la matriz mitocondrial, que conduce a la despolarización de la membrana mitocondrial y la interrupción de la síntesis de ATP mitocondrial. Las células responden a la disipación de la fuerza de protones-motivo aumentando la tasa de transporte de electrones y el consumo de oxígeno a niveles máximos en un intento inútil de recuperar el potencial de la membrana (capacidad respiratoria máxima). La diferencia entre la capacidad respiratoria máxima y la respiración basal es la capacidad respiratoria de repuesto de la célula, que representa la cantidad de respiración que no es utilizada por la célula para generar ATP en estado basal, pero podría ser potencialmente reclutado en respuesta a aumentos en la demanda de ATP o en condiciones de estrés8. La tercera inyección es una combinación de rotenona y antimicina A. Esta inyección detiene completamente el ETC y el OCR disminuye a su nivel más bajo, siendo el consumo restante de oxígeno no mitocondrial (causado por NADPH-oxidases, etc.).
Los cambios en las vías metabólicas podrían predecir de alguna manera el funcionamiento de las células NK, ya que se ha sugerido que la activación continua de células NK con citoquinas in vitro podría conducir al agotamiento de las células NK mediante el estudio de diferentes vías metabólicas10,,11. La correlación entre el estado metabólico de las células NK y la función es muy importante desde el punto de vista de la inmunoterapia contra el cáncer. En este campo, se ha probado la activación de células NK con perfusión de IL-15, solas o en combinación con anticuerpos terapéuticos monoclonales con el fin de mejorar la matanza de células tumorales12,,13,,14. El conocimiento del estado metabólico de las células NK en respuesta a estas estrategias de tratamiento proporcionaría un valioso predictor del estado de activación de la célula NK y la función de matar.
El estudio de las vías metabólicas en otras células mieloides y linfoides como monocitos, células T y B se ha descrito15 y se han publicado métodos optimizados16. En este protocolo proporcionamos un método que combina un protocolo de aislamiento NK que produce un gran número de células NK puras y viables y un protocolo optimizado para medir la actividad metabólica utilizando un analizador de flujo extracelular. Aquí mostramos que este es un método válido para el estudio de los cambios metabólicos en el reposo y las células NK humanas activadas IL-15. Para el ensayo de flujo extracelular, se han probado y optimizado parámetros como el número de células y las concentraciones de fármacos. En comparación con otros métodos respirométricos, el analizador de flujo extracelular está totalmente automatizado y es capaz de probar en tiempo real, con cantidades muy bajas de células, hasta 92 muestras simultáneamente, y por lo tanto permite exámenes de alto rendimiento (con múltiples muestras y réplicas) de una manera relativamente rápida17.
Este método puede ser utilizado por investigadores interesados en evaluar la función celular NK mediante el estudio del metabolismo de las células NK. Se podría aplicar también a las células activadas por otras citoquinas, anticuerpos o estímulos solubles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D8375-5G</td>
			<td>Glycolyisis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D198501</td>
			<td>ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>NK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDIVA Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT cell proliferation assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C7026</td>
			<td>Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>17851</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human NK cell Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>19055</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>10128-446</td>
			<td>NK sell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>NK cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td>Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15-50ug</td>
			<td>NK cell stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum (HS)</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>9C0539</td>
			<td>NK cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td>NK cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of stress test media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34965</td>
			<td>Viability dye for flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>50494X</td>
			<td>PBMCs separation from human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD3 BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563725</td>
			<td>T cell flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD56 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555516</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human NKp46 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557991</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>75351</td>
			<td>Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BP-115</td>
			<td>Cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Controller Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>Extracellular Flux assay base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Flux Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>To prepare the Cell-Tak solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of human natural killer cell metabolism

Las células de Natural Killer (NK) median principalmente las respuestas inmunitarias antitumorales y antivirales innatas y responden a una variedad de citoquinas y otros estímulos para promover la supervivencia, la proliferación celular, la producción de citoquinas como la gamma de interferón (IFN) y/o los programas de citotoxicidad. La activación de células NK por estimulación de la citoquina requiere una remodelación sustancial de las vías metabólicas para apoyar sus requisitos bioenergéticos y biosintéticos. Hay un gran cuerpo de evidencia que sugiere que el metabolismo de células NK deteriorado está asociado con una serie de enfermedades crónicas incluyendo la obesidad y el cáncer, que destaca la importancia clínica de la disponibilidad de un método para determinar el metabolismo de las células NK. Aquí describimos el uso de un analizador de flujo extracelular, una plataforma que permite mediciones en tiempo real de la glucólisis y el consumo de oxígeno mitocondrial, como una herramienta para monitorear los cambios en el metabolismo energético de las células NK humanas. El método descrito aquí también permite el seguimiento de los cambios metabólicos después de la estimulación de las células NK con citoquinas como IL-15, un sistema que actualmente se está investigando en una amplia gama de ensayos clínicos.

El aislamiento de las células NK de la sangre periférica proporciona una población pura y viable
El ensayo de flujo extracelular se basa en la medición de la concentración de H+ y O2 en el pozo y no distinguirá entre diferentes poblaciones de células o su viabilidad. Por esta razón, la obtención de una población altamente pura y viable de la célula de interés fue el paso clave para tener éxito en estos experimentos.
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Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

En este artículo, describimos un método para medir la glucólisis y la respiración mitocondrial en células humanas primarias de Asesino Natural (NK) aisladas de sangre periférica, en reposo o después de la activación inducida por IL15. El protocolo descrito podría extenderse fácilmente a las células NK humanas primarias activadas por otras citoquinas o estímulos solubles.

Análisis del metabolismo celular natural humano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Este método permite la determinación del metabolismo natural de las células asesinas. Un parámetro clave en la activación midiendo el consumo de oxígeno y los cambios de pH en el medio extracelular. La ventaja del analizador de flujo extracelular es que está totalmente automatizado y es capaz de probar hasta 92 muestras en tiempo real con bajas cantidades de células.Permitiendo así pantallas de alto rendimiento. Un método válido para determinar la glucólisis y la respiración en las células de la inocuidad es muy importante en la clínica. Dado que hay muchas enfermedades incluyendo la obesidad y el cáncer donde el metabolismo celular se deteriora.Comience por pipetear 20 mililitros de medio de separación de linfocitos en un tubo cónico de 50 mililitros. Mientras mantiene el tubo en un ángulo de 30 grados, pipetee suavemente 20 mililitros de sangre sobre el medio. Creación de una interfaz visible y bien definida entre los dos fluidos.Centrifugar los tubos durante 25 minutos a 1000 veces G.Then cuidadosamente tomar los tubos fuera de la centrífuga y colocarlos en un bastidor. Compruebe la presencia de una capa visible de células en la interfaz entre LSM y plasma. Aspirar suavemente la capa de celda mononuclear con una pipeta de plástico de 10 mililitros y colóquela en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.Lave las células mononucleares dos veces con 45 mililitros de PBS. Y centrifugarlos a 800 veces G durante cinco minutos. Para aislar las células o engaves asesinos naturales, cuente los mares de PVM y resuspútelos en el búfer de separación NK en un tiempo de 10 a las octavas células por mililitro.A continuación, transfiera 10 mililitros de la suspensión celular a un nuevo tubo de 50 mililitros. Añadir 500 microlitros de mezcla de anticuerpos de aislamiento de células NK. Y 10 microlitros de anti CD tres mezcla de anticuerpos de aislamiento positivo a los PBMC.Y incubarlos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Cuentas magnéticas de vórtice y añadir un mililitro a los PBMC y anticuerpos. Luego incubar el MIGS durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional.Agregue 35 mililitros de tampón de aislamiento NK y coloque el tubo en el imán durante 15 minutos. Recoja cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de plástico de 50 mililitros sin tocar los lados o la parte inferior del tubo. Cuente las células y centrifúquelas a 800 veces G durante cinco minutos.Para estimular las células NK con pasillo soluble 15, resuspender 750,000 células en 100 microlitros de IMDM que contienen 10%HS en un pozo de una placa de 96 pozos. Diluir el pasillo humano de 15 a un microgramo por mililitro en el IMDM y el 10%HS. Y añadir 100 microlitros del pasillo humano diluido 15 a las células.Repare una muestra de control con células no estimuladas y coloque ambas muestras en la incubadora a 37 grados centígrados. Estimular las células durante 48 horas y luego realizar el ensayo de flujo extracelular. El día antes del experimento, encienda el analizador y deje que se caliente hasta 37 grados centígrados.Abra el paquete del cartucho de censura y separe el cartucho de la placa de utilidad. A continuación, añada 200 microlitros de la solución calibrante a cada pozo de la placa de utilidad. Y vuelva a colocar el cartucho central para asegurarse de que los sensores estén completamente sumergidos.Para obtener resultados óptimos, incuba el cartucho durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora libre de dióxido de carbono. Que debidamente humidificado. Para preparar una hoja recubierta adhesiva, pipetee 25 microlitros de la solución adhesiva celular a cada pozo de la placa.E incubado a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, retire la solución y lave la placa dos veces con 200 microlitros de agua estéril por pozo. Mantenga la placa abierta durante 15 minutos dentro de la capucha de cultivo celular para permitir que los pozos se sequen.Centrifugar las células NK previamente aisladas añaden 200 veces G durante cinco minutos. Luego retire los sobrenadantes y lave las células en el medio de prueba de esfuerzo mitocondrial calentado o en el medio de prueba de esfuerzo de glucólisis. Pele las células de nuevo y resusppend a la concentración celular preferida en el mismo medio.Coloca 180 microlitros de suspensión celular por pozo en la placa de ensayo. Utilice pozos A uno, A 12 H uno y H 12 como pozos de control para la corrección de fondo. Añadiendo 180 microlitros del medio de ensayo a estos Pozos Incubar la placa durante 30 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora libre de dióxido de carbono.Centrifugar la placa a 200 veces G durante cinco minutos. Luego observe las células bajo el microscopio para comprobar que forman una capa de mano en la parte inferior del pozo. Incubar las células durante otros 25 minutos.Soluciones de trabajo cálidas a 37 grados centígrados. Y reajuste su pH a 7.4 si es necesario. Cargue los compuestos previamente preparados para una prueba de esfuerzo mitocondrial o para una prueba de esfuerzo de glucólisis en las placas A, B y C del cartucho de censura hidratado Vuelva a colocar el cartucho de censura cargado en la incubadora mientras configura el programa.Para configurar el protocolo de ensayo de flujo extracelular, abra el software y utilice Definiciones de grupo para definir las condiciones de pretratamiento. Utilice la pestaña Mapa de placas para indicar los grupos de pozos que tienen condiciones similares Indicar también la corrección de fondo y los pozos vacíos. A continuación, establezca el programa en la pestaña de protocolos.Inicie el programa y coloque el cartucho del sensor y la placa de utilidad en la bandeja. Después del paso de calibración, sustituya la placa calibrante de la placa de ensayo por las celdas conectadas. Una vez completada la ejecución, recupere los datos y analícelos.Con el fin de evaluar la pureza y viabilidad de las células NK. Los pequeños alec Watts de los mares PVM y la población aislada de células NK fueron manchados y analizados por citometría de flujo. La pureza de la población de células NK se estableció por doble permanencia contra CD tres y CD 56 o NKP 46.Aquí se muestra una gran tasa de consumo de oxígeno mitocondrial para las células NK humanas. Como era de esperar, los números de celda I mostraban valores de OCR más altos. Los números celulares también se correlacionan linealmente con la cantidad de ADN o proteína en el pozo.Por otro lado, los números de celda más altos no eran óptimos. Porque tras la adición de DNP, la concentración de oxígeno en el pozo se agotó totalmente en cada ciclo. Lo que impidió el cálculo preciso del OCR.En las células NK humanas, 100 micromolar DNP fue encontrado para ser la dosis óptima. Aquí se muestra un experimento típico de prueba de esfuerzo mitocondrial con 750.000 células NK por pozo. En esta prueba la oligomicina conduce a una disminución dramática en el consumo de oxígeno.Y un aumento en ECAR. Lo que representa un cambio a la glucólisis y un esfuerzo para mantener los niveles celulares de ATP. La activación de las células NK por el pasillo 15 causó un aumento tanto en el consumo de oxígeno mitocondrial como en la acidificación extracelular.La respiración basal máxima y la respiración vinculada a ATP aumentaron, pero no la fuga de protones o la respiración no mitocondrial. Además, la tasa de OCR/ECA disminuyó Indicando un cambio a un metabolismo glucolítico después de la estimulación IL 15. Al realizar este protocolo, es muy importante obtener una población celular pura y saludable para determinar el número de célula óptimo y valorar la concentración de nocabadores.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultivo Celular

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...