Name: isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling
Uploaded: 2021-10-14T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÂ©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling at JoVE.com

Vi takker de patienter og frivillige, der deltog i vores forskning.

Humane celler er potentielt smitsomme. Derfor udføres forsøgene strengt i overensstemmelse med de krævede forholdsregler og procedurer, der diskuteres som arbejdsmiljøadministration (OSHA) og personligt beskyttelsesudstyr (PPE).
1. Isolering af PBMC'er fra fuldblod
<ol><li>Saml alle de nødvendige materialer fra tabel 1 og bring dem til stuetemperatur (RT). Varm RP10F til 37 °C. Juster centrifugen til RT. Bortset fra centrifugeringer og celletælling skal du udføre alle trin ved hjælp af levedygtige celler i et biologisk sikkerhedsskab.</li>
	<li>Få blod i fem 10 ml rør (ønsket mængde) indeholdende antikoagulantia. Opbevar hele blodet ved omgivelsestemperatur (18 °C). Mærk 50 ml separationsrør med det humane forskningsemnenummer for den blodprøve, der skal behandles.</li>
	<li>Overfør 10\u201215 ml blod til hvert separationsrør (er) med det matchende emnenummer. Fortynd blodet mindst 2 gange med Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS). Overskrid ikke 35 ml fortyndet blod pr. Rør.</li>
	<li>Forsigtigt og langsomt underlagt blodet med ~ 13 ml densitetsmedium. Se gennem det gennemsigtige densitetsmedium i bunden af røret, og stop pipettering, når pipetten er næsten tom (for at forhindre boblefrigivelse). Fjern forsigtigt pipetten for at undgå at blande blod- og densitetsmediumlagene.</li>
	<li>Overfør forsigtigt de fyldte separationsrør til centrifugen uden at forstyrre lagene.</li>
	<li>Centrifuge ved 500 x g i 30 minutter med centrifugebremsen slukket (deceleration indstillet til nul). BEMÆRK: Hvis centrifugen kun viser omdrejningstal, skal du se rotorspecifikationerne for at estimere omdrejningstalsækvivalenten for 500 x g.</li>
	<li>Fjern forsigtigt separationsrørene fra centrifugen uden at forstyrre lagene. Overhold buffy coat, som er dannet mellem densitetsmediet og plasmalagene.</li>
	<li>Pipette fra toppen for at fjerne og kassere det meste af den øvre plasmafraktion, så 10 ml forbliver over buffy coat. Saml forsigtigt og langsomt buffy frakken. Overfør buffy coats fra to separationsrør til et nyt formærket og sterilt 50 ml rør, som vist i figur 1.</li>
	<li>Fortynd PBMC'erne mindst 2 gange med HBSS, hvilket bringer volumenet i hvert nyt rør op til 50 ml. Husk at skifte centrifugebremsen til fuld. Pellet PBMC'er ved centrifugering ved 400 x g i 10 min. Fjern supernatanten så meget som muligt, og tryk på bunden af røret for at løsne pillen.</li>
	<li>For at lyse resterende røde blodlegemer (RBC) skal du genbruge hver cellepille i 1 ML ammoniumchlorid-kalium (ACK) lysisbuffer pr. 10 ml originalt blodvolumen. Inkuber i præcis 5 minutter. Stop straks lysis med et lige eller større volumen HBSS og juster lydstyrken til 50 ml. Centrifuge ved 400 x g i 10 min.</li>
	<li>Fjern supernatanten, og tryk på bunden af røret for at løsne cellepillen. Pool celler fra samme donor. Bring volumen op til 50 ml med HBSS. Centrifuge ved 400 x g i 10 min.</li>
	<li>Fjern supernatanten, og tryk på bunden af røret for at løsne cellepillen. Resuspend celler i 10 ml varmt RP10F medium, og tag en alikvote til levedygtig celletælling ved hjælp af trypan blå.</li>
	<li>Beregn det samlede celletal i hver prøve ved hjælp af et hæmocytometer.</li>
</ol>2. Oprensning af CD4 + CD45RO + T-celler fra PBMC'er
BEMÆRK: Oprensning af CD4+CD45RO+ T-celler fra PBMC'er sker ved hjælp af kommercielt tilgængelig magnetisk separation (se materialetabel) med mindre ændringer. Det foretrækkes at følge kitmanualen for inkubationstid, da hvert kommercielt sæt har deres egne instruktioner.
<ol><li>Vask den ønskede mængde PBMC'er i 10 ml udvælgelsesbuffer. Centrifuge ved 400 x g i 10 min. Fjern supernatanten og tryk på bunden af røret for at løsne pelleten.</li>
	<li>Fortynd PBMC'er til 5 x 107 celler/ml i selektionsbuffer, og overfør dem til et 5 ml polystyren rør med rund bund (12 x 75 mm).</li>
	<li>Tilsæt 50 μL antistofcocktail pr. 1 ml prøve, og bland forsigtigt. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter.</li>
	<li>Umiddelbart før brug, hvirvel magnetiske partikler i 30 sek ved høj hastighed. Der tilsættes 50 μL magnetiske partikler pr. 1 ml prøve til røret, der indeholder PBMC'er, og blandes forsigtigt.</li>
	<li>Bring lydstyrken op til 2,5 ml med markeringsbuffer og bland forsigtigt. Anbring røret (uden låg) i magneten, og inkuber ved RT i 2,5 min.</li>
	<li>Tag magneten op, og i en kontinuerlig bevægelse skal du vende magneten og røret for at hælde den berigede cellesuspension i et nyt sterilt rør.</li>
	<li>For at øge genvindingen skal du tilføje 2,5 ml udvælgelsesbuffer til røret, der er tilbage i magneten, uden at forstyrre de immobiliserede perler. Opbevar magneten i yderligere 2,5 minutter, og gentag trin 2,6 for at gendanne yderligere celler.</li>
	<li>Tag en alikvote til levedygtig celletælling ved hjælp af trypanblå. Beregn det samlede celletal ved hjælp af et hæmocytometer eller celletæller.</li>
	<li>Bekræft renheden ved flowcytometri (figur 3).</li>
</ol>3. Kemisk aktivering
<ol><li>Juster CD4+CD45RO+ T-celler til 5 x 106 celler/ml med varmt RP10F-medium, og fordel cellerne i dyrkningsfade af den ønskede størrelse. Hvil celler i en befugtet 37 °C 5 % CO2 inkubator natten over.</li>
	<li>Pellet hvilede celler ved centrifugering ved 400 x g i 10 minutter. Fjern supernatanten, og tryk på bunden af røret for at løsne cellepillen.</li>
	<li>Juster cellekoncentrationen til 5 x 106 celler / ml med varmt RP10F-medium, og fordel 0,5 \ 107 celler i hvert af tre sterile skruehætterør. BEMÆRK: Hvis der er tilstrækkelige celler til rådighed, kan duplikatstimuleringer eller yderligere tidspunkter indgå i det eksperimentelle design.</li>
	<li>Stimuler celler i rør 2 og 3 med PMA og A23187. Tilsæt PMA til 25 ng / ml og A23187 til 500 ng / ml og bland forsigtigt. Tilsæt et lige stort volumen dimethylsulfoxid (DMSO) til cellerne i rør 1, der vil fungere som et køretøj (kontrol). Hvis du f.eks. bruger 1 μL PMA og 1 μL A23187, skal du tilføje 2 μL DMSO til køretøjets rør. Hold den endelige koncentration af DMSO under 0,5% i alle rør.</li>
	<li>Løsn hætterne på rørene, og returner cellerne til 37 °C 5 % CO 2-inkubatoren i 2 timer (rør 2) og 6 timer (rør 1 og 3). På det angivne tidspunkt centrifugeceller ved 500 x g i 10 minutter.</li>
	<li>Før lysis kasseres så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre cellepillen.</li>
	<li>Lys straks cellerne, som anvist af instruktioner fra det kommercielt tilgængelige RNA-isolationssæt (se Tabel over materialer). Fortsæt med RNA-isolering, eller frys lysatet ved -80 ° C for at behandle senere med yderligere prøver. BEMÆRK: RNA-renhed og integritet kan verificeres ved hjælp af mikrokapillær elektroforese.</li>
	<li>Valgfrit: For fuldstændigt at fjerne alle spor af DNA fra den rensede RNA-prøve skal du bruge RNA-oprydningssæt (se Tabel over materialer) i henhold til producentens anvisninger.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+and+therapy+of+cutaneous+T+cell+lymphoma.">Immunopathogenesis and therapy of cutaneous T cell lymphoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 798-812 (2005).</li><li>Wong, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+Insights+in+the+Pathogenesis+and+Therapy+of+Cutaneous+T-cell+lymphoma+(Mycosis+Fungoides+and+Sezary+Syndrome).">Evolving Insights in the Pathogenesis and Therapy of Cutaneous T-cell lymphoma (Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome).</a> British Journal of Haematology. 155 (2), 150-166 (2011).</li><li>Whittaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+insights+into+the+pathogenesis+of+cutaneous+T-cell+lymphomas+(CTCL).">Biological insights into the pathogenesis of cutaneous T-cell lymphomas (CTCL).</a> Seminars in oncology. 33 (3), 3-6 (2006).</li><li>Kallinich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+expression+on+neoplastic+and+reactive+T+cells+in+the+skin+at+different+stages+of+Mucosis+Fungoides.">Chemokine receptor expression on neoplastic and reactive T cells in the skin at different stages of Mucosis Fungoides.</a> Journal of Investigative Dermatology. 121 (5), 1045-1052 (2003).</li><li>Rodd, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+Emerging+Therapeutics+for+Cutaneous+T-Cell+Lymphoma:+Histone+Deacetylase+Inhibitors.">Current and Emerging Therapeutics for Cutaneous T-Cell Lymphoma: Histone Deacetylase Inhibitors.</a> Lymphoma. 2012, 1-10 (2012).</li><li>Olsen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisions+to+the+staging+and+classification+of+mycosis+fungoides+and+Sezary+syndrome:+a+proposal+of+the+International+Society+for+Cutaneous+Lymphomas+(ISCL)+and+the+cutaneous+lymphoma+task+force+of+the+European+Organization+of+Research+and+Treatment+of+Cancer+(EORTC).">Revisions to the staging and classification of mycosis fungoides and Sezary syndrome: a proposal of the International Society for Cutaneous Lymphomas (ISCL) and the cutaneous lymphoma task force of the European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC).</a> Blood. 110, 1713-1722 (2007).</li><li>Hameetman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPHA4+is+overexpressed+but+not+functionally+active+in+S&#233;zary+syndrome.">EPHA4 is overexpressed but not functionally active in S&#233;zary syndrome.</a> Oncotarget. 6 (31), 31868-31876 (2015).</li><li>Willemze, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO-EORTC+classification+for+cutaneous+lymphomas.">WHO-EORTC classification for cutaneous lymphomas.</a> Blood. 105, 3768-3785 (2005).</li><li>Bradford, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+lymphoma+incidence+patterns+in+the+United+States:+a+population-based+study+of+3884+cases.">Cutaneous lymphoma incidence patterns in the United States: a population-based study of 3884 cases.</a> Blood. 113, 5064-5073 (2009).</li><li>Wilson, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age,+race,+sex,+stage,+and+incidence+of+cutaneous+lymphoma.">Age, race, sex, stage, and incidence of cutaneous lymphoma.</a> Clinical Lymphoma Myeloma and Leukemia. 12, 291-296 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+cutaneous+T+cell+lymphoma:+new+and+emerging+targets+and+treatment+options.">Management of cutaneous T cell lymphoma: new and emerging targets and treatment options.</a> Cancer Management and Research. 4, 75-89 (2012).</li><li>Korgavkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+incidence+trends+of+cutaneous+T-cell+lymphoma.">Changing incidence trends of cutaneous T-cell lymphoma.</a> Jama Dertmatology. 149 (11), 1295-1299 (2013).</li><li>Dulmage, B. O., Geskin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+gene+expression+profiling+of+cutaneous+T-cell+lymphoma.">Lessons learned from gene expression profiling of cutaneous T-cell lymphoma.</a> British Journal of Dermatology. 169 (6), 1188-1197 (2013).</li><li>Boonk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Immunophenotypic+and+Molecular+Biomarkers+for+S&#233;zary+Syndrome+Using+Standard+Operating+Procedures:+A+Multicenter+Study+of+59+Patients.">Evaluation of Immunophenotypic and Molecular Biomarkers for S&#233;zary Syndrome Using Standard Operating Procedures: A Multicenter Study of 59 Patients.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (7), 1364-1372 (2016).</li><li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+Lymphoma+International+Consortium+Study+of+Outcome+in+Advanced+Stages+of+Mycosis+Fungoides+and+S&#233;zary+Syndrome:+Effect+of+Specific+Prognostic+Markers+on+Survival+and+Development+of+a+Prognostic+Model.">Cutaneous Lymphoma International Consortium Study of Outcome in Advanced Stages of Mycosis Fungoides and S&#233;zary Syndrome: Effect of Specific Prognostic Markers on Survival and Development of a Prognostic Model.</a> Journal of Clinical Oncology. 10 (33), 3766-3773 (2015).</li><li>Benoit, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD164+identifies+CD4++T+cells+highly+expressing+genes+associated+with+malignancy+in+S&#233;zary+syndrome:+the+S&#233;zary+signature+genes,+FCRL3,+Tox,+and+miR-214.">CD164 identifies CD4+ T cells highly expressing genes associated with malignancy in S&#233;zary syndrome: the S&#233;zary signature genes, FCRL3, Tox, and miR-214.</a> Archives of Dermatological Research. 309, 11-19 (2017).</li><li>Dulmage, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarker+landscape+in+mycosis+fungoides+and+S&#233;zary+syndrome.">The biomarker landscape in mycosis fungoides and S&#233;zary syndrome.</a> Experimental Dermatology. 26 (8), 668-676 (2017).</li><li>Pick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mediation+of+Lymphokine+Action:+Mimicry+of+Migration+Inhibitory+Factor+(MIF)+Action+by+Phorbol+Myristate+Acetate+(PMA)+and+the+Ionophore+A23187.">Intracellular Mediation of Lymphokine Action: Mimicry of Migration Inhibitory Factor (MIF) Action by Phorbol Myristate Acetate (PMA) and the Ionophore A23187.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 94 (332), 378-394 (1979).</li><li>Chong, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+S&#233;zary+syndrome+PBMCs+poorly+express+immune+response+genes+up-regulated+in+stimulated+memory+T+cells.">Induced S&#233;zary syndrome PBMCs poorly express immune response genes up-regulated in stimulated memory T cells.</a> Journal of Dermatological Science. 60 (1), 8-20 (2010).</li><li>Fargnoli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+TCR+signaling+in+cutaneous+T+cell+lymphoma+is+associated+with+decreased+activities+of+Zap70,+Syk+and+membrane-associated+Csk.">Diminished TCR signaling in cutaneous T cell lymphoma is associated with decreased activities of Zap70, Syk and membrane-associated Csk.</a> Leukemia. 11, 1338-1346 (1997).</li><li>Hansen, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemic+T+cells+from+patients+with+cutaneous+T-cell+lymphoma+demonstrate+enhanced+activation+through+CDw60,+CD2,+and+CD28+relative+to+activation+through+the+T-cell+antigen+receptor+complex.">Leukemic T cells from patients with cutaneous T-cell lymphoma demonstrate enhanced activation through CDw60, CD2, and CD28 relative to activation through the T-cell antigen receptor complex.</a> Journal of Investigative Dermatology. , 667-673 (1993).</li><li>Chong, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Function+Abnormalities+in+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cell+Cytokine+Expression+Differentiates+Stages+of+Cutaneous+T-Cell+Lymphoma/Mycosis+Fungoides.">Immune Function Abnormalities in Peripheral Blood Mononuclear Cell Cytokine Expression Differentiates Stages of Cutaneous T-Cell Lymphoma/Mycosis Fungoides.</a> Clinical Cancer Research. 14 (3), 646-653 (2008).</li><li>Moerman-Herzog, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+S&#233;zary+syndrome+and+lymphocytic-variant+hypereosinophilic+syndrome+T+cells+reveals+common+and+divergent+genes.">Transcriptome analysis of S&#233;zary syndrome and lymphocytic-variant hypereosinophilic syndrome T cells reveals common and divergent genes.</a> Oncotarget. 10, 5052-5069 (2019).</li><li>Fanok, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dysregulated+Cytokine+Signaling+and+Bacterial+Triggers+in+the+Pathogenesis+of+Cutaneous+T-Cell+Lymphoma.">Role of Dysregulated Cytokine Signaling and Bacterial Triggers in the Pathogenesis of Cutaneous T-Cell Lymphoma.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138, 1116-1125 (2018).</li><li>Su, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+expression+of+T-plastin+in+Sezary+cells.">Aberrant expression of T-plastin in Sezary cells.</a> Cancer Research. 63, 7122-7127 (2003).</li><li>van Doorn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+expression+of+the+tyrosine+kinase+receptor+EphA4+and+the+transcription+factor+twist+in+Sezary+syndrome+identified+by+gene+expression+analysis.">Aberrant expression of the tyrosine kinase receptor EphA4 and the transcription factor twist in Sezary syndrome identified by gene expression analysis.</a> Cancer Research. 64, 5578-5586 (2004).</li><li>Booken, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sezary+syndrome+is+a+unique+cutaneous+T-cell+lymphoma+as+identified+by+an+expanded+gene+signature+including+diagnostic+marker+molecules+CDO1+and+DNM3.">Sezary syndrome is a unique cutaneous T-cell lymphoma as identified by an expanded gene signature including diagnostic marker molecules CDO1 and DNM3.</a> Leukemia. 22, 393-399 (2008).</li><li>Dagur, P. K., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+,+storage,+and+preparation+of+human+blood+cells.">Collection , storage, and preparation of human blood cells.</a> Current Protocol Cytometry. 73, 1-16 (2016).</li><li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Circulating+CD4++Memory+T-cell+Subsets+in+Erythrodermic+Patients:+CD27+Analysis+Can+Help+to+Distinguish+Cutaneous+T-cell+Lymphomas+From+Inflammatory+Erythroderma.">Heterogeneity of Circulating CD4+ Memory T-cell Subsets in Erythrodermic Patients: CD27 Analysis Can Help to Distinguish Cutaneous T-cell Lymphomas From Inflammatory Erythroderma.</a> Dermatology. 216 (3), 213-221 (2008).</li><li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S&#233;zary+syndrome+and+mycosis+fungoides+arise+from+distinct+T-cell+subsets:+a+biologic+rationale+for+their+distinct+clinical+behaviors.">S&#233;zary syndrome and mycosis fungoides arise from distinct T-cell subsets: a biologic rationale for their distinct clinical behaviors.</a> Blood. 116 (5), 767-771 (2010).</li><li>Roelens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+and+skin-derived+Sezary+cells:+clonal+but+with+phenotypic+plasticity.">Circulating and skin-derived Sezary cells: clonal but with phenotypic plasticity.</a> Blood. 130 (12), 1468-1471 (2017).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+expression+programs+and+the+integration+of+the+CD28+costimulatory+signal+in+T+cell+activation.">Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11796-11801 (2002).</li><li>Fuji, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+therapies+and+immunological+findings+in+cutaneous+T-cell+lymphoma.">New therapies and immunological findings in cutaneous T-cell lymphoma.</a> Frontiers in Oncology. 8, 12-28 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.
Etisk offentliggørelse: Denne forskningsprotokol blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) ved University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS, Little Rock, AR) Mikroarray-dataene, der blev præsenteret i denne undersøgelse, blev udført på prøverne rekrutteret under en forskningsprotokol godkendt af IRB fra Henry Ford Hospital (Detroit, MI).

Der er udviklet flere måder at isolere PBMC'er på, og hver har deres egne fordele og begrænsninger28. Vi indsamler rutinemæssigt op til 50 ml blod i fem 10 ml rør indeholdende antikoagulerende middel. Blodvolumenet til PBMC-isolering afhænger af flere faktorer såsom forskningspersonens sundhed og alder og også af phlebotomistekspertise. Et kritisk proceduremæssigt trin i protokollen er dannelsen af tringradienten. Dårlig lagdeling kan resultere i delvis eller fuldstændig svigt af PBMC'er til sediment ved grænsefladen. Vi foretrækker den underlagsmetode, der er beskrevet her, da det er let at starte bundlaget. For fuldstændigt at dispensere alt densitetsmediet under blodet er det vigtigt at bruge et pipethjælpemiddel uden luftlækager. Forurening af PBMC-fraktionen med uønskede celletyper kan minimeres ved omhyggelig og konsekvent indsamling af buffy coat, som skal udføres på samme måde for hver isolering. Hvis PBMC'er ikke fraktioneres yderligere, bør det undgås at indsamle forskellige mængder af densitetsgradienten og plasmalagene mellem isolationer. RBC-lyser udføres for at minimere den potentielle virkning af forurening af RBC- og reticulocytafledt RNA på downstream-genekspressionsanalyser. Hypotonisk lysis vil blive hæmmet af overskydende isotonisk buffer.
Yderligere isolering af T-celledelmængde er vigtig for molekylære undersøgelser. Her beskrev vi efterfølgende CD4 + CD45RO + T-cellevalg ved negativ selektion for at fjerne uønskede celletyper. Negativ selektion er afhængig af antistoffer, der genkender specifikke celleoverflademarkører for alle uønskede celler. Antistofbelagte celler fjernes derefter af magnetiske perler. Denne udvælgelsesprotokol fjerner uønskede celler, samtidig med at uberørte og ustimulerede målceller forbliver frit flydende, hvilket er vigtigt for at studere genaktivering. Man skal dog sørge for at undgå celleklumper, som reducerer den endelige renhed af udvalgte CD4+ CD45RO+ T-celler. Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), der er til stede i udvælgelsesbufferen, minimerer celleklumpning. Udbyttet af T-celler afhænger af faktorer som blodets indledende volumen, patientvariabler såsom den behandling, der administreres til patienten, og sygdomsstadiet på tidspunktet for prøveindsamlingen. Behandling givet til patienterne kan også påvirke cellens levedygtighed. Derudover har prøveindsamling før enhver procedure såsom fotoferese også positiv indvirkning på CD4 + CD45RO + T-cellernes renhed. Vi har observeret, at prøveindsamling efter fotoferesebehandlingsprocedure har negativ indvirkning på CD4 + CD45RO + T-cellernes udbytte.
Neoplastiske T-cellekloner fra SS-patienter udtrykker oftest overflademarkører i overensstemmelse med en moden, hukommelse CD4 T-cellefænotype29,30. Imidlertid er fænotypisk plasticitet lejlighedsvis blevet observeret med hensyn til overflademarkører, herunder CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 og / eller CD2631. Tidligere undersøgelser har også vist heterogeniteten i CD45RO- og CD45RA-ekspression blandt SS-patienter29, mens størstedelen af SS-tilfældene stadig er CD45RO+. Roelens et al.31 viste også, at SS kan udvise interindividuel og intraindividuel heterogenitet med blandet population af naiv (TN), central hukommelse (TCM), overgangshukommelse (TTM), effektorhukommelse (TEM) og terminal effektorhukommelse (TEMRA) delmængder. Imidlertid viser deres resultater tydeligt, at størstedelen af SS-cellerne har TCM-fænotype. Vi fokuserede vores undersøgelse på CD45RO+ overfladeimmunfenotypen, der er mest almindelig hos SS-patienter, og bekræftede fænotype ved flowcytometri. Ved planlægning af undersøgelser af T-celleundergrupper hos patienter er det vigtigt at overveje fænotypisk heterogenitet af den sygdom, der undersøges, og oprensningsstrategien kan derfor justeres efter behov for at opnå den ønskede T-cellepopulation til analyse.
Der er flere måder at stimulere T-celler og PBMC'er til at undersøge funktionel genekspression. Vi foretrækker kemisk aktivering (PMA + A23187 ionophore), da vi er interesserede i genregulering i kernen. Kemisk aktivering er en bedste mulighed til dette formål, fordi den fungerer som en bred aktivator og er mere ensartet sammenlignet med antigenspecifik stimulering. PMA er en lille organisk forbindelse, der diffunderer gennem cellemembranen ind i cytoplasmaet og aktiverer proteinkinase C. A23187 tillader calcium at passere gennem membraner. Disse forbindelser omgår overfladereceptorer og efterligner sammen virkningerne af T-cellereceptorligation med co-stimulering medieret af CD28. Kemikalierne aktiverer flere intracellulære signalveje, hvilket resulterer i aktivering af nuklear transkriptionsfaktor og opregulering af cytokingener, der er tilgængelige for transkriptionsaktivering. Selvom kemisk aktivering og CD3CD28-ligering producerer påfaldende lignende globale genekspressionsprofiler i normale celler32, er kemisk aktivering med PMA + A23187 et godt valg, da SS T-celler kan miste ekspression af overfladereceptorer, herunder TCR-komponenter33. Chong et al.22 sammenlignede aktiveringen af cytokingener mellem PMA/A23187 med anti-CD3- og anti-CD28-antistoffer i PBMC'er fra normale, tidlige MF/CTCL- og sene MF/CTCL-patienter. De rapporterede, at PMA / A23187 forårsagede hurtigere og intens aktivering af IL-2-genet sammenlignet med anti-CD3 / CD28-stimulering. Derudover viste de, at den langsommere aktiveringskinetik med anti-CD3 / CD28-antistoffer potentielt er fra tværbinding og membransignalering, der er nødvendig for stimulering. Desuden blev tendenser i ekspression af cytokiner blandt de forskellige undersøgte cellepopulationer bevaret med PMA/A23187. Da vi er interesserede i genekspressionsaktivering, er kemisk stimulering en ideel tilgang, fordi den fungerer som en bred aktivator og er mere konsistent sammenlignet med antigenspecifik stimulering. CD3 / CD28-ligering er ideel til at undersøge veje, der er vigtige i membranbaseret signaltransduktion. Derudover er kemisk aktivering billigere og kræver ikke specielt udstyr. I den aktuelle undersøgelse aktiverede PMA + A23187 signifikant cytokingener i ND, men ikke SS T-celler, hvilket tyder på, at SS T-celler har funktionelle mangler nedstrøms for TCR.
Sammenfattende giver denne protokol fænotypisk rene T-celler fra dyrebart patientafledt blod og en metode til vurdering af genom-brede ændringer i funktionel genekspression. Vi viser, at transkriptomisk profilering af SS T-celler sammenlignet med normale CD45RO+ T-celler afslører dybe forskelle i genaktivering i friske humane T-celler fra patienter med CTCL. Disse undersøgelser vil hjælpe udviklingen af diagnostiske biomarkører og terapeutiske strategier rettet mod nye markører i CTCL. Derudover kan denne strategi og protokol til undersøgelse af primære humane T-celler være værdifuld i tilpasningen til undersøgelser af andre T-cellemedierede sygdomme.

Kutant T-cellelymfom (CTCL), herunder de mest almindelige undertyper mycosis fungoides (MF) og Sézary syndrom (SS), er en heterogen gruppe af sygdomme afledt af transformation og ukontrolleret spredning af modne hud-homing T-celler 1,2. De neoplastiske T-celler har en moden CD4 + CD45RO +, hukommelsesfænotype3 og udtrykker hudhoming adhæsionsmarkører, hvilket øger epidermotropisme4, som manifesterer sig som udslæt især i tidlig sygdom. Det kliniske forløb af MF er ofte ugideligt, når det er under rutinemæssig styret pleje, men en delmængde af patienter kan udvikle sig til mere avanceret sygdom. I disse MF-tilfælde vokser hudlæsioner og tykner til store tumorer, og neoplastiske T-celler kan sprede sig til lymfeknuder og viscerale organer. I modsætning hertil er SS en mere aggressiv, leukæmisk variant af CTCL5, der er karakteriseret ved en triade af symptomer: generaliseret erytrodermi (defineret som påvirker >80% af det samlede kropsoverfladeareal), lymfadenopati og tilstedeværelse af mere end 1000 / mm3 cirkulerende klonale atypiske T-celler med cerebriforme kerner, såkaldte Sézary-celler 6,7 . Prognosen for SS-patienter er signifikant dårligere end MF. SS er sjælden med en incidensrate på 0,1/100.000 og udgør ca. 3 % af de samlede CTCL-tilfælde 8,9. CTCL findes typisk hos ældre voksne med en medianalder på ca. 60 år10. Incidensraten for CTCL havde været stigende, og mens årsagen er uklar, har satsen stabiliseret sig siden 199811,12.
Den molekylære patogenese af SS forbliver uklar. Genetiske, epigenetiske og genekspressionsundersøgelser har produceret et væld af nye data, men der er stadig inkonsekvente fund, primært på grund af de små patientkohorter, der er undersøgt2, samt forskelle i eksperimentelle design- og kontrolpopulationer13,14. Forbedret genomisk og transkriptomisk karakterisering kan kaste lys over både sygdomsmekanismer og tidligere uudforskede terapeutiske mål. Derfor er der behov for flere undersøgelser fra en større patientpopulation for bedre at forstå denne heterogene malignitet. Biomarkørpaneler, der er meget følsomme og specifikke i en SS-kohorte, har klaret sig mindre ensartet i andre kohorter15, hvilket udgør en alvorlig hindring for udviklingen af pålidelige diagnostiske og prognostiske biomarkører for SS16. Ideelle diagnostiske biomarkører vil være konsekvent og stærkt overekspressionerede i maligne T-celler, mens de er fraværende eller næsten fraværende i normale T-celler17. Opdagelsen af sygdomsspecifikke biomarkører er vigtig for udviklingen af diagnostiske og terapeutiske protokoller for SS.
Transkriptomiske data af høj kvalitet for både maligne og normale T-celler kræver en effektiv og pålidelig tilgang til prøveforberedelse. Her vil vi diskutere en detaljeret, men enkel strategi for at opnå RNA-prøver fra T-cellepopulationer, der er relevante for SS. Vi vil diskutere isolering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC) fra fuldblod, negativ magnetisk selektion af sygdomsrelevante CD4 + CD45RO + T-cellepopulationer, kemisk aktivering for at afsløre forskelle i funktionelle responser og forberedelse af RNA til transkriptomisk profilering. I den nuværende protokol er kemisk aktivering blevet udført ved anvendelse af phorbolmyristatacetat (PMA) og calciumionofor (A23187) 18,19, fordi tidligere undersøgelser har vist defekt T-cellereceptorsignalering i CTCL, og stimulering med PMA / A23187 omgår T-cellereceptoren20,21. PMA / A23187 tillader også en mere direkte proksimal aktivering af nukleare signaler, der er nødvendige for cytokingenaktivering. Endelig giver stimulering af T-celler et yderligere niveau af indsigt i reguleringen af genekspression, som ikke kunne opnås ved at hvile T-celler, hvor dynamisk forandring er fraværende.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:706px;" width="706">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:269px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1000 ul Pipet tips</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10017-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">15 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">25 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">5 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">50 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">A23187 ionophore</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMSO</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650-5x5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit</td>
			<td style="width:151px;">StemCell</td>
			<td style="width:119px;">19157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FBS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HBSS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">P184-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-072-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:151px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">10378-23-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">phorbol12-myristate13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:151px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rneasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:151px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">T-25 Flask</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling

Kutane T-cellelymfomer (CTCL) er afledt af transformation og ukontrolleret spredning af modne hud-homing T-celler, og mycosis fungoides (MF) og Sézary syndrom (SS) repræsenterer de mest almindelige undertyper. På trods af en række undersøgelser af karakterisering af genekspression, genetiske ændringer og epigenetiske abnormiteter af CTCL forbliver den molekylære patogenese af MF / SS uklar. MF refererer til den mere almindelige CTCL med en hud-overvægt, og er normalt begrænset til hud, mens SS er en aggressiv leukæmisk variant af CTCL med udbredt hudinddragelse og er karakteriseret ved neoplastisk fordeling, der hovedsageligt involverer blod, hud og lymfeknude. Med fokus på klinisk praksis har identifikationen af genekspressionsbiomarkører et enormt potentiale til at forbedre diagnosticering og behandling af MF/SS. Faktisk har nylige transkriptomiske undersøgelser identificeret potentielle diagnostiske biomarkører fra forskelle i genekspression mellem normale og maligne T-celler, hvilket kan forbedre vores forståelse af SS-biologi og afsløre potentielle terapeutiske mål. Dette manuskript beskriver en detaljeret reproducerbar protokol til isolering af mononukleære celler i perifert blod fra frisk fuldblod fra patienter diagnosticeret med SS, udvælgelse af CD4 + hukommelse T-celler (CD4 + CD45RO + T-celler), kemisk stimulering og forberedelse af RNA egnet til transkriptomisk profilering for at opdage nye prognostiske molekylære markører for at få yderligere indsigt i sygdomsætiologi. Stimuleringen ved hjælp af kemisk agonist til aktivering af nuklear regulering giver mere specifik vurdering af veje, der er vigtige i den dynamiske transkriptionsregulering og genekspression og eliminerer forvirrende defekter, der kan opstå som følge af opstrøms signaldefekter som følge af TCR-antigentab ved cellemembranen. De data, der er opnået ved sammenligning af transkriptomet af ustimulerede til stimulerede SS T-celler, afslører funktionelle regulatoriske genekspressionsdefekter, der ikke fremgår af analyse af stillestående ustimulerede celler. Desuden kan den metode, der er skitseret ud fra denne tilgang, tilpasses til at studere T-celle genekspressionsdefekter i andre T-celleimmunsygdomme.

Denne protokol omfatter procedurer for isolering af PBMC'er fra SS-blod, oprensning af CD4 + CD45RO + T-celler ved negativ selektion, stimulering af rensede T-celler og isolering af total RNA til transkriptomisk profilering. Figur 1 beskriver processen med PBMC-isolering fra fuldblod. Bemærk, at det samlede udbytte af SS PBMC'er vil variere med startblodvolumen og cirkulerende tumorbyrde for hver patient. I vores laboratorium var det gennemsnitlige udbytte af SS PBMC'er 4,6 × 106 celler / ml fuldblod (1,85 × 106 - 3,25 x 107 celler / ml for 7 SS). Den gennemsnitlige levedygtighed af isolerede PBMC'er var 95\u201299%. Figur 2 viser høj renhed og levedygtighed af udvalgte CD4+CD45RO+-hukommelses-T-celler. Det gennemsnitlige udbytte af CD4 + CD45RO + T-celler fra SS PBMC'er var 75% (75,6% - 84%) sammenlignet med 15,9% (3% - 30%) fra normale donorer (ND) PBMC'er opnået fra leukoreduktionssystem (LRS) kamre. Levedygtigheden og renheden af CD4 + CD45RO + T-celler opnået ved denne negative selektionsprotokol har været konsekvent høj (figur 3).
Vi har tidligere kombineret aktiveringsprotokollen ovenfor med mikroarrays for at studere de funktionelle ændringer i transkriptomer af både SS- og ND T-celler og har vist, at SS-hukommelses-T-celler og SS PBMC'er dårligt udtrykker cytokin og andre immunresponsgener sammenlignet med ND T-celler og PBMC'er 19,22,23. Figur 4 viser den robuste aktivering af flere cytokingener, herunder IL4, IL 10, IL13 og IL22 i ND T-celler, men ikke i SS T-celler. Denne defekt i funktionel genekspression i SS T-celler er siden blevet bekræftet af andre grupper24. Derudover udtrykkes mange gener, der normalt ikke udtrykkes i ND T-celler, stærkt i SS T-celler, både i hvile og efter stimulering (figur 4). Disse omfatter de tidligere beskrevne SS-biomarkørgener DNM3, PLS3, TOX og TWIST1 25,26,27 samt ANK1 og SGCE, som først blev rapporteret af vores gruppe. Disse positive biomarkører udtrykkes stærkt i SS, men ikke ND, og undgår tekniske faldgruber forbundet med negative biomarkører.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2.jpg"> Figur 1: PBMC-isolering fra fuldblod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig2.jpg"> Figur 2: Negativt valg af CD4+ hukommelse t-celler fra isolerede PBMC'er. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig3.jpg"> Figur 3: Renheden af CD4 + CD45RO + T-celler blev bekræftet ved flowcytometri. Lymfocytter blev gated af lysspredning (A), levende lymfocytter udelukket eFluor780 levedygtighedsfarvestof (B) og (C) repræsenterer ikke-udvalgte normale donorer (ND). Negativ selektion resulterede i næsten rene populationer af CD45RO+ T-celler i ND (D) og SS-patienter (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig4.jpg"> Figur 4: Differentiel genekspression i hvilende og aktiverede CD4 + CD45RO + hukommelse T-celler fra SS og ND. Genekspression z-score er repræsenteret af en farveskala fra rød (høj ekspression) til grøn (lav ekspression). Farvede bjælker øverst på varmekortet repræsenterer cellebehandlinger: mock/køretøj behandlet (rødt), 2 timer stimuleret (blå) og 6 timer stimuleret (gul). Flere SS-biomarkørgener er stærkt udtrykt, og cytokingener udtrykkes dårligt i SS T-celler sammenlignet med ND T-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Reagenser</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tæthed Medium</td>
			<td>Lymfocytseparationsmedium, Ficoll-Hypaque eller tilsvarende densitetsmedium med densitet = 1,077-1,080 g/ml ved 20oC.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td>1x Hanks afbalancerede saltopløsning, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP10F</td>
			<td>RPMI 1640 medium, 10 % varmeinaktiveret føtalt kvægserum (FBS), 1x penicillin-streptomycinopløsning, pH 7,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Ingen grund til at justere pH. Det skal være ~ 7,3.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer til udvælgelse</td>
			<td>1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>phorbol12-myristate13-acetat (PMA)</td>
			<td>50 μg/ml i DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>A23187 iofor</td>
			<td>500 μg/ml i DMSO</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Reagenser.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÂ©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling at JoVE.com

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Vi præsenterer en simpel protokol til isolering af mononukleære celler i perifert blod fra fuldblod opnået fra patienter diagnosticeret med Sézary syndrom efterfulgt af udvælgelse af CD4 + T-celler, deres stimulering med phorbol12-myristate13-acetat og A23187 ionophore og forberedelse af RNA til transkriptomisk profilering.

Isolering af humane perifere blodmononukleære celler og CD4 + T-celler fra Sézary syndrom patienter til transkriptomisk profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Denne protokol giver os mulighed for at isolere lymfocytter T-celler fra patienter med sygdommen til undersøgelser, molekylær defekt og immunologisk defekt. Denne metode giver os mulighed for at isolere levedygtige celler, celler med sygdomsabnormiteter til oprensning af RNA, DNA og protein fra disse patienter, og det giver os mulighed for at karakterisere molekylære defekter for at forstå veje abnormiteter, der er vigtige i patogenese. Denne metode er værdifuld til isolering af perifert blod, der kan fraktioneres yderligere for at studere blodlegemer i normale tilstande samt blodlegemer fra sygdomme med immunabnormiteter.Demonstrerer denne procedure vil være Alanna, som er en medicinsk studerende forsker fra mit laboratorium. Efter udsætning af en perifer blodprøve i fem 10 ml rør indeholdende antikoagulantia overføres 10 til 15 ml blod til 50 ml separationsrør mærket med emnenummeret og fortyndes prøverne mindst to gange, men til højst 35 ml pr. rør med HBSS. Læg forsigtigt og langsomt blodet med ca. 13 ml densitetsmedium pr. rør, hvilket stopper pipettningen, når pipetten er næsten tom for at forhindre bobler.Fjern pipetten langsomt for at undgå at blande blod- og densitetsmediumlagene, og overfør forsigtigt de fyldte separationsrør til centrifugen uden at forstyrre lagene. Efter at have adskilt cellerne ved centrifugering, skal du fjerne alle undtagen de sidste 10 ml af plasmaet, der indeholder det øverste lag, før du forsigtigt og langsomt opsamler buffy coat. Pool buffy coat fra mellem to separationsrør i et enkelt mærket sterilt 50 ml rør og fortynd PBMC mindst dobbelt med frisk HBSS til i alt 50 ml pr. Rør.Når alle buffy coats er blevet indsamlet, pellets cellerne ved centrifugering og fjerne så meget af supernatanten fra hvert rør som muligt. Tryk på rørbunden for at løsne pelleten og genanvende pellets i en til to milliliter ACK lysisbuffer pr. Original 10 ml blodprøvevolumen pr. Rør. Efter nøjagtigt fem minutter skal du stoppe lysen i hvert rør med et lige eller større volumen HBSS og justere hvert volumen til 50 ml.Efter centrifugering kasseres supernatanten, samler cellerne fra den samme donor og bringer volumen op til 50 ml med frisk HBSS til en anden centrifugering. Derefter suspenderes cellerne igen i 10 ml 37 grader Celsius RP 10F medium til tælling. For CD4 + CD45RO + T-cellerensning skal cellerne spindes ned og fortyndes PBMC til en fem gange 10 til den syvende celle pr. Milliliter selektionsbufferkoncentration.Overfør cellerne til et fem milliliter rundt bundpolystyrenrør og tilsæt 50 mikroliter antistofcocktail pr. 1 milliliter prøve med skånsom blanding. Efter fem minutter ved stuetemperatur hvirvel magnetiske partikler ved høj hastighed i 30 sekunder, før der tilsættes 50 mikroliter magnetiske partikler pr. En milliliter prøve til røret med skånsom blanding. Bring lydstyrken op på 2,5 ml med frisk markeringsbuffer og skånsom blanding, og læg røret på en magnet i 2,5 minutter.Ved afslutningen af inkubationen skal du samle magneten op og vende røret i en kontinuerlig bevægelse for at dekantere den berigede cellesuspension i et nyt sterilt rør. For at øge cellegenvindingen tilsættes 2,5 ml selektionsbuffer til røret uden at forstyrre de immobiliserede perler i yderligere 2,5 minutters inkubation på magneten og tilsæt vasken til opsamlingsrøret, tæl derefter antallet af levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer og bekræft cellens renhed ved flowcytometri. For at aktivere cellerne skal du justere CD4 + CD45RO + T-celler til en fem gange 10 til den sjette celler pr. Milliliter på 37 grader Celsius RP 10F medium koncentration og frø cellerne på passende størrelse kulturskåle.Hvil cellerne i en befugtet 37 grader Celsius, 5% kuldioxid inkubator natten over. Næste morgen samles de udhvilede celler ved centrifugering og suspenderer pelleten igen med en fem gange 10 til de sjette celler pr. Milliliter på 37 grader Celsius RP 10F medium koncentration. Opdel suspensionen i fem til 10 gange 10 til den sjette celle aliquots i hver af tre sterile skruehætterør og stimuler cellerne i rør to med PMA og rør tre med A23187 og skånsom blanding.Tilsæt et lige stort volumen dimethylsulfoxid til det første rør for at tjene som køretøjskontrol, og anbring rørene med hætterne løsnet i inkubatoren i den passende aktiveringsperiode. Ved afslutningen af inkubationen opsamles cellerne ved centrifugering og kasseres så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre cellepillen. Derefter lyser cellerne som anvist af et kommercielt tilgængeligt RNA-isolationssæt og isolerer RNA'et i henhold til producentens instruktion.Levedygtigheden og renheden af CD4 + CD45RO + T-celler opnået ved denne negative selektionsprotokol er konsekvent høj. Udbyttet af CD4+ CD45RO+T-celler opnået fra leukoreduktionssystemkamre fra SS PBMC'er er typisk ca. 75 % sammenlignet med ca. 16 % fra normale donor-PBMC'er. SS-hukommelses-T-celler og SS PBMC'er udtrykte dårligt cytokin og andre immunresponsgener sammenlignet med celler fra normale donor-T-celler og PBMC'er.Derudover udtrykkes mange gener, der normalt ikke udtrykkes i normale donor-T-celler, stærkt i SS T-celler både i hvile og efter stimulering. God steril teknik og en konsekvent rutine er virkelig vigtig for succesen med denne teknik. Det er også virkelig vigtigt, mens du lægger Ficoll'en i lag, at du bruger en automatisk pipette med fin kontrol, og du er virkelig opmærksom på den hastighed, du lægger Ficoll ned.Celler isoleret ved hjælp af denne metode vil være levedygtige og kan anvendes til toksicitetsundersøgelser, molekylære biokemiske undersøgelser til karakterisering af signaltransduktionsveje, flowcytometri og genekspressionsundersøgelser. Metoden kan bruges til isolering af celler fra patienter med sygdom, til inflammatoriske sygdomme og også andre sygdomme såsom kræft til direkte undersøgelser. Eksempler på disse sygdomme omfatter psoriasis og atopisk dermatitis.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture og Frigivelse af levedygtige Cirkulerende tumorceller fra Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom ved hjælp af Li-Fraumeni syndrom Patient-afledte inducerede pluripotente stamceller-celler

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

Et humant perifert blod mononukleære celle (PBMC) Enpodet humaniseret xenograft model for translational immuno-onkologi (I-O) forskning

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kortlægning af strukturfunktionsforhold for uordnede onkogene transskriptionsfaktorer ved hjælp af transskriptomisk analyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Udvidelse og berigelse af Gamma-Delta (γδ) T-celler fra aferesed humant produkt

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

En automatiseret mikroskopisk scoringsmetode til γ-H2AX Foci-analysen i humane perifere blodlymfocytter

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortopisk implantation af patientafledte kræftceller hos mus rekapitulerer avanceret kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Engineering onkogen heterozygot gain-of-function mutationer i humane hæmatopoietiske stamceller og stamceller

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...