Name: isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling
Uploaded: 2021-10-14T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
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Wir danken den Patienten und Freiwilligen, die an unserer Forschung teilgenommen haben.

Menschliche Zellen sind potenziell infektiös. Daher werden die Experimente streng in Übereinstimmung mit den erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen und Verfahren durchgeführt, die als Arbeitsschutzverwaltung (OSHA) und persönliche Schutzausrüstung (PSA) diskutiert werden.
1. Isolierung von PBMCs aus Vollblut
<ol><li>Sammeln Sie alle benötigten Materialien aus Tabelle 1 und bringen Sie sie auf Raumtemperatur (RT). Warm RP10F bis 37 °C. Stellen Sie die Zentrifuge auf RT ein. Führen Sie mit Ausnahme von Zentrifugationen und Zellzählungen alle Schritte mit lebensfähigen Zellen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durch.</li>
	<li>Erhalten Sie Blut in fünf 10 ml Röhrchen (gewünschte Menge), die Antikoagulans enthalten. Lagern Sie das Vollblut bei Umgebungstemperatur (18\u201224 °C). Beschriften Sie 50 ml Trennröhrchen mit der menschlichen Forschungsnummer für die zu verarbeitende Blutprobe.</li>
	<li>Übertragen Sie 10\u201215 ml Blut in jedes Trennröhrchen mit der passenden Probandennummer. Verdünnen Sie das Blut mindestens 2-fach mit Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS). Überschreiten Sie nicht 35 ml verdünntes Blut pro Röhrchen.</li>
	<li>Unterlegen Sie vorsichtig und langsam das Blut mit ~ 13 ml Dichtemedium. Beobachten Sie durch das transparente Dichtemedium am Boden des Rohres und stoppen Sie das Pipettieren, wenn die Pipette fast leer ist (um eine Blasenfreisetzung zu verhindern). Entfernen Sie vorsichtig die Pipette, um eine Vermischung der Blut- und Dichtemittelschichten zu vermeiden.</li>
	<li>Übertragen Sie die gefüllten Trennröhrchen vorsichtig in die Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören.</li>
	<li>Zentrifuge bei 500 x g für 30 min bei ausgeschalteter Zentrifugenbremse (Verzögerung auf Null eingestellt). HINWEIS: Wenn die Zentrifuge nur Drehzahl anzeigt, konsultieren Sie die Rotorspezifikationen, um das Drehzahläquivalent für 500 x g zu schätzen.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig Trennrohre aus der Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören. Beobachten Sie das Buffy-Fell, das sich zwischen den Dichtemittel- und Plasmaschichten gebildet hat.</li>
	<li>Pipette von oben, um den größten Teil der oberen Plasmafraktion zu entfernen und zu verwerfen, so dass 10 ml über der Buffy-Schicht verbleiben. Sammle vorsichtig und langsam den Buffy-Mantel. Übertragen Sie die Buffycoats aus zwei Trennrohren in ein neues vormarkiertes und steriles 50-ml-Röhrchen, wie in Abbildung 1 dargestellt.</li>
	<li>Verdünnen Sie die PBMCs mindestens 2-fach mit HBSS, wodurch das Volumen in jeder neuen Röhre auf 50 ml erhöht wird. Denken Sie daran, die Zentrifugenbremse auf voll zu schalten. Pellet-PBMCs durch Zentrifugation bei 400 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Pellet zu lösen.</li>
	<li>Um verbleibende rote Blutkörperchen (RBC) zu lysieren, resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 1 \u20122 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) -Lysepuffer pro 10 ml ursprünglichem Blutvolumen. Für genau 5 min inkubieren. Stoppen Sie die Lyse umgehend mit einem gleichen oder einem größeren Volumen von HBSS und stellen Sie das Volumen auf 50 ml ein. Zentrifuge bei 400 x g für 10 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Zellpellet zu lösen. Poolzellen desselben Spenders. Bringen Sie die Lautstärke mit HBSS auf bis zu 50 ml. Zentrifuge bei 400 x g für 10 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Zellpellet zu lösen. Resuspendieren Sie Zellen in 10 ml warmem RP10F-Medium und nehmen Sie ein Aliquot für die lebensfähige Zellzählung mit Trypanblau.</li>
	<li>Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jeder Probe mit einem Hämozytometer.</li>
</ol>2. Reinigung von CD4+CD45RO+ T-Zellen aus PBMCs
HINWEIS: Die Reinigung von CD4 + CD45RO + T-Zellen aus PBMCs erfolgt unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen magnetischen Trennung (siehe Materialtabelle) mit geringfügigen Modifikationen. Es wird bevorzugt, das Kit-Handbuch für die Inkubationszeit zu befolgen, da jedes kommerzielle Kit seine eigenen Anweisungen hat.
<ol><li>Waschen Sie die gewünschte Menge an PBMCs in 10 ml Auswahlpuffer. Zentrifuge bei 400 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Pellet zu lösen.</li>
	<li>Verdünnen Sie PBMCs auf 5 x 107 Zellen/ml im Auswahlpuffer und übertragen Sie sie auf ein 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr (12 x 75 mm).</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL Antikörpercocktail pro 1 ml Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Unmittelbar vor dem Gebrauch magnetische Partikel für 30 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit wirbeln. Geben Sie 50 μL magnetische Partikel pro 1 ml Probe in das Röhrchen mit PBMCs und mischen Sie es vorsichtig.</li>
	<li>Bringen Sie die Lautstärke mit Auswahlpuffer auf bis zu 2,5 ml und mischen Sie vorsichtig. Legen Sie das Rohr (ohne Deckel) in den Magneten und inkubieren Sie es bei RT für 2,5 min.</li>
	<li>Nehmen Sie den Magneten auf und drehen Sie in einer kontinuierlichen Bewegung den Magneten und das Rohr um, um die angereicherte Zellsuspension in ein neues steriles Rohr zu gießen.</li>
	<li>Um die Ausbeute zu erhöhen, fügen Sie dem im Magneten verbleibenden Röhrchen 2,5 ml Auswahlpuffer hinzu, ohne die immobilisierten Perlen zu stören. Halten Sie den Magneten für weitere 2,5 Minuten im Magneten und wiederholen Sie Schritt 2.6, um weitere Zellen wiederherzustellen.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Aliquot für die lebensfähige Zellzählung mit Trypanblau. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Reinheit durch Durchflusszytometrie (Abbildung 3).</li>
</ol>3. Chemische Aktivierung
<ol><li>Stellen Sie CD4 + CD45RO + T-Zellen mit warmem RP10F-Medium auf 5 x 106 Zellen / ml ein und verteilen Sie die Zellen in Kulturschalen der gewünschten Größe. Ruhezellen in einem befeuchteten 37 °C 5% CO2 Inkubator über Nacht.</li>
	<li>Pellet-Ruhezellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Zellpellet zu lösen.</li>
	<li>Stellen Sie die Zellkonzentration mit warmem RP10F-Medium auf 5 x 106 Zellen /ml ein und verteilen Sie 0,5 \u20121 x 107 Zellen in jedes der drei sterilen Schraubverschlussröhrchen. HINWEIS: Wenn genügend Zellen verfügbar sind, können doppelte Stimulationen oder zusätzliche Zeitpunkte in das Versuchsdesign einbezogen werden.</li>
	<li>Stimulieren Sie Zellen in den Röhrchen 2 und 3 mit PMA und A23187. Fügen Sie PMA zu 25 ng / ml und A23187 zu 500 ng / ml hinzu und mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie den Zellen in Röhrchen 1 ein gleiches Volumen Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu, das als Vehikel (Kontrolle) dienen wird. Wenn Sie beispielsweise 1 μL PMA und 1 μL A23187 verwenden, fügen Sie dem Fahrzeugrohr 2 μL DMSO hinzu. Halten Sie die Endkonzentration von DMSO in allen Röhrchen unter 0,5%.</li>
	<li>Lösen Sie die Kappen an den Röhrchen und bringen Sie die Zellen für 2 h (Tubus 2) und 6 h (Röhrchen 1 und 3) in den 37 °C 5% CO2-Inkubator zurück. Zum angegebenen Zeitpunkt Zentrifugenzellen bei 500 x g für 10 min.</li>
	<li>Vor der Lyse so viel wie möglich vom Überstand verwerfen, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Lysieren Sie die Zellen umgehend, wie in den Anweisungen des kommerziell erhältlichen RNA-Isolationskits angewiesen (siehe Materialverzeichnis). Fahren Sie mit der RNA-Isolierung fort oder frieren Sie das Lysat bei -80 ° C ein, um es später mit zusätzlichen Proben zu verarbeiten. HINWEIS: Die Reinheit und Integrität der RNA kann mittels Mikrokapillarelektrophorese überprüft werden.</li>
	<li>Optional: Um alle DNA-Spuren vollständig aus der gereinigten RNA-Probe zu entfernen, verwenden Sie das RNA-Reinigungskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Ethische Offenlegung: Dieses Forschungsprotokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) der University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS, Little Rock, AR) genehmigt. Die in dieser Studie vorgestellten Microarray-Daten wurden an den Proben durchgeführt, die im Rahmen eines vom IRB des Henry Ford Hospital (Detroit, MI) genehmigten Forschungsprotokolls rekrutiert wurden.

Es wurden mehrere Möglichkeiten zur Isolierung von PBMCs entwickelt, von denen jede ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen hat28. Wir sammeln routinemäßig bis zu 50 ml Blut in fünf 10-ml-Röhrchen, die Antikoagulans enthalten. Das Volumen des Blutes für die PBMC-Isolierung hängt von mehreren Faktoren wie Gesundheit und Alter des Forschungssubjekts und auch von der Expertise des Phlebotomikers ab. Ein kritischer Verfahrensschritt im Protokoll ist die Bildung des Schrittgradienten. Eine schlechte Schichtung kann dazu führen, dass PBMCs an der Grenzfläche teilweise oder vollständig versagen. Wir bevorzugen die hier beschriebene Under-Layering-Methode, da es einfach ist, die untere Schicht zu starten. Um das gesamte Dichtemedium unter dem Blut vollständig abzugeben, ist es wichtig, eine Pipettehilfe ohne Luftlecks zu verwenden. Die Kontamination der PBMC-Fraktion durch unerwünschte Zelltypen kann durch sorgfältige und konsequente Sammlung der Buffy-Schicht minimiert werden, die für jede Isolierung auf die gleiche Weise durchgeführt werden sollte. Wenn PBMCs nicht weiter fraktioniert werden, sollte das Sammeln unterschiedlicher Mengen des Dichtegradienten und der Plasmaschichten zwischen den Isolationen vermieden werden. Die RBC-Lyse wird durchgeführt, um die potenziellen Auswirkungen der Kontamination von RBC- und Retikulozyten-abgeleiteter RNA auf nachgeschaltete Genexpressionsanalysen zu minimieren. Die hypotone Lyse wird durch überschüssigen isotonischen Puffer gehemmt.
Eine weitere Isolierung der T-Zell-Untergruppe ist für molekulare Studien wichtig. Hier beschrieben wir die nachfolgende CD4+CD45RO+ T-Zellselektion durch negative Selektion, um unerwünschte Zelltypen zu entfernen. Die negative Selektion beruht darauf, dass Antikörper spezifische Zelloberflächenmarker für alle unerwünschten Zellen erkennen. Antikörperbeschichtete Zellen werden dann durch magnetische Kügelchen entfernt. Dieses Selektionsprotokoll entfernt unerwünschte Zellen, während unberührte und nicht stimulierte Zielzellen frei schweben können, was für die Untersuchung der Genaktivierung unerlässlich ist. Es muss jedoch darauf geachtet werden, Zellklumpen zu vermeiden, die die Endreinheit ausgewählter CD4+ CD45RO+ T-Zellen verringern. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die im Selektionspuffer vorhanden ist, minimiert die Zellverklumpung. Die Ausbeute an T-Zellen hängt von Faktoren wie dem Anfangsvolumen des Blutes, den Patientenvariablen wie der Behandlung, die dem Patienten verabreicht wird, und dem Krankheitsstadium zum Zeitpunkt der Probenentnahme ab. Die Behandlung der Patienten kann auch die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen. Darüber hinaus hat die Probenentnahme vor einem Verfahren wie der Photopherese auch positive Auswirkungen auf die Reinheit der CD4 + CD45RO + T-Zellen. Wir haben beobachtet, dass die Probenentnahme nach der Photopheresebehandlung negative Auswirkungen auf die Ausbeute von CD4 + CD45RO + T-Zellen hat.
Neoplastische T-Zell-Klone von SS-Patienten exprimieren am häufigsten Oberflächenmarker, die mit einem ausgereiften CD4-T-Zell-Phänotyp29,30 übereinstimmen. Phänotypische Plastizität wurde jedoch gelegentlich in Bezug auf Oberflächenmarker wie CD4, CD45RO,CD45RA, CD7 und/oder CD26 31 beobachtet. Frühere Studien haben auch die Heterogenität der CD45RO- und CD45RA-Expression bei SS-Patienten29 gezeigt, während die Mehrheit der SS-Fälle immer noch CD45RO+ ist. Roelens et al.31 zeigten auch, dass SS interindividuelle und intraindividuelle Heterogenität mit einer gemischten Population von naiven (TN), zentralen Gedächtnis (TCM), Übergangsgedächtnis (TTM), Effektorgedächtnis (TEM) und terminalem Effektorgedächtnis (TEMRA) -Teilmengen aufweisen kann. Ihre Ergebnisse zeigen jedoch deutlich, dass die Mehrheit der SS-Zellen einen TCM-Phänotyp aufweist. Wir konzentrierten unsere Studie auf den bei SS-Patienten häufigsten CD45RO+-Oberflächenimmunphänotyp und bestätigten den Phänotyp durch Durchflusszytometrie. Bei der Planung von Studien von T-Zell-Untergruppen bei Patienten ist es wichtig, die phänotypische Heterogenität der untersuchten Krankheit zu berücksichtigen, und die Reinigungsstrategie kann daher bei Bedarf angepasst werden, um die gewünschte T-Zell-Population für die Analyse zu erhalten.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, T-Zellen und PBMCs zu stimulieren, um die funktionelle Genexpression zu untersuchen. Wir bevorzugen die chemische Aktivierung (PMA + A23187 Ionophor), da wir uns für die Genregulation im Zellkern interessieren. Die chemische Aktivierung ist die beste Option für diesen Zweck, da sie als breiter Aktivator wirkt und im Vergleich zur antigenspezifischen Stimulation einheitlicher ist. PMA ist eine kleine organische Verbindung, die durch die Zellmembran in das Zytoplasma diffundiert und die Proteinkinase C direkt aktiviert. A23187 lässt Kalzium durch Membranen passieren. Diese Verbindungen umgehen Oberflächenrezeptoren und ahmen zusammen die Wirkungen der T-Zell-Rezeptorligatur mit Co-Stimulation nach, die durch CD28 vermittelt wird. Die Chemikalien aktivieren mehrere intrazelluläre Signalwege, was zu einer Aktivierung des Kerntranskriptionsfaktors und einer Hochregulierung von Zytokingenen führt, die für die Transkriptionsaktivierung zugänglich sind. Obwohl die chemische Aktivierung und die CD3CD28-Ligation in normalen Zellen auffallend ähnliche globale Genexpressionsprofile erzeugen32, ist die chemische Aktivierung mit PMA + A23187 eine gute Wahl, da SS-T-Zellen die Expression von Oberflächenrezeptoren einschließlich der TCR-Komponentenverlieren können 33. Chong et al.22 verglichen die Aktivierung von Zytokingenen zwischen PMA/A23187 und Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern in PBMCs von normalen, frühen MF/CTCL- und späten MF/CTCL-Patienten. Sie berichteten, dass PMA/A23187 eine schnellere und intensivere Aktivierung des IL-2-Gens im Vergleich zur Anti-CD3/CD28-Stimulation verursachte. Darüber hinaus zeigten sie, dass die langsamere Aktivierungskinetik mit Anti-CD3/CD28-Antikörpern möglicherweise auf die Vernetzung und Membransignalisierung zurückzuführen ist, die für die Stimulation notwendig sind. Darüber hinaus wurden Trends in der Expression von Zytokinen unter den verschiedenen untersuchten Zellpopulationen mit PMA/A23187 beibehalten. Da wir uns für die Aktivierung der Genexpression interessieren, ist die chemische Stimulation ein idealer Ansatz, da sie als breiter Aktivator wirkt und im Vergleich zur antigenspezifischen Stimulation konsistenter ist. Die CD3/CD28-Ligatur ist ideal, um Signalwege zu untersuchen, die für die membranbasierte Signaltransduktion wichtig sind. Darüber hinaus ist die chemische Aktivierung kostengünstiger und erfordert keine spezielle Ausrüstung. In der aktuellen Studie aktivierte PMA + A23187 signifikant Zytokingene in ND-, aber nicht in SS-T-Zellen, was darauf hindeutet, dass SS-T-Zellen funktionelle Mängel nach der TCR aufweisen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll phänotypisch reine T-Zellen aus wertvollem Patientenblut und eine Methode zur Beurteilung genomweiter Veränderungen der funktionellen Genexpression bietet. Wir zeigen, dass das transkriptomische Profiling von SS-T-Zellen im Vergleich zu normalen CD45RO+-T-Zellen tiefgreifende Unterschiede in der Genaktivierung in frischen menschlichen T-Zellen von Patienten mit CTCL zeigt. Diese Studien werden die Entwicklung von diagnostischen Biomarkern und therapeutischen Strategien unterstützen, die auf neuartige Marker in CTCL abzielen. Darüber hinaus können diese Strategie und dieses Protokoll bei der Untersuchung primärer menschlicher T-Zellen bei der Anpassung an Studien anderer T-Zell-vermittelter Krankheiten wertvoll sein.

Das kutane T-Zell-Lymphom (CTCL), einschließlich der häufigsten Subtypen Mycosis fungoides (MF) und Sézary-Syndrom (SS), ist eine heterogene Gruppe von Krankheiten, die aus der Transformation und unkontrollierten Proliferation reifer Hauthoming-T-Zellen resultieren 1,2. Die neoplastischen T-Zellen haben einen reifen CD4 + CD45RO +, Gedächtnisphänotyp3, und exprimieren Hauthoming-Adhäsionsmarker, wodurch der Epidermotropismus4 erhöht wird, der sich insbesondere bei frühen Erkrankungen als Hautausschlag manifestiert. Der klinische Verlauf der MF ist oft indolent, wenn er routinemäßig betreut wird, aber eine Untergruppe von Patienten kann zu einer fortgeschritteneren Erkrankung fortschreiten. In diesen MF-Fällen wachsen und verdicken sich Hautläsionen zu großen Tumoren, und neoplastische T-Zellen können sich auf Lymphknoten und viszerale Organe ausbreiten. Im Gegensatz dazu ist SS eine aggressivere, leukämische Variante von CTCL5, die durch einen Dreiklang von Symptomen gekennzeichnet ist: generalisierte Erythrodermie (definiert als >80% der gesamten Körperoberfläche), Lymphadenopathie und Vorhandensein von mehr als 1000/mm 3 zirkulierenden klonalen atypischen T-Zellen mit zerebriformen Kernen, sogenannten Sézary-Zellen 6,7 . Die Prognose für SS-Patienten ist signifikant schlechter als bei MF. SS ist mit einer Inzidenzrate von 0,1/100.000 selten und macht etwa 3% der gesamten CTCL-Fälle 8,9 aus. CTCL tritt typischerweise bei älteren Erwachsenen mit einem Durchschnittsalter von etwa 60 Jahren10 auf. Die Inzidenzrate für CTCL war gestiegen, und obwohl die Ursache unklar ist, hat sich die Rate seit1998 stabilisiert 11,12.
Die molekulare Pathogenese von SS bleibt unklar. Genetische, epigenetische und Genexpressionsstudien haben eine Fülle neuartiger Daten hervorgebracht, es gibt jedoch nach wie vor inkonsistente Ergebnisse, hauptsächlich aufgrund der untersuchten kleinen Patientenkohorten2, sowie der Unterschiede im experimentellen Design und in den Kontrollpopulationen13,14. Eine verbesserte genomische und transkriptomische Charakterisierung kann Aufschluss über Krankheitsmechanismen und bisher unerforschte therapeutische Ziele geben. Daher sind mehr Studien aus einer größeren Patientenpopulation erforderlich, um diese heterogene Malignität besser zu verstehen. Biomarker-Panels, die in einer SS-Kohorte hochempfindlich und spezifisch sind, haben in anderen Kohorten15 weniger einheitlich abgeschnitten, was ein ernsthaftes Hindernis bei der Entwicklung zuverlässiger diagnostischer und prognostischer Biomarker für SS16 darstellt. Ideale diagnostische Biomarker werden in malignen T-Zellen konsistent und stark überexprimiert, während sie in normalen T-Zellen fehlen oder fast fehlen17. Die Entdeckung krankheitsspezifischer Biomarker ist wichtig für die Weiterentwicklung diagnostischer und therapeutischer Protokolle für SS.
Qualitativ hochwertige transkriptomische Daten sowohl für maligne als auch für normale T-Zellen erfordern einen effizienten und zuverlässigen Ansatz zur Probenvorbereitung. Hier werden wir eine detaillierte, aber einfache Strategie zur Gewinnung von RNA-Proben aus T-Zell-Populationen diskutieren, die für SS relevant sind. Wir werden die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) aus Vollblut, die negative magnetische Selektion von krankheitsrelevanten CD4 + CD45RO + T-Zellpopulationen, die chemische Aktivierung zur Aufdeckung von Unterschieden in funktionellen Reaktionen und die Vorbereitung von RNA für das transkriptomische Profiling diskutieren. Im aktuellen Protokoll wurde eine chemische Aktivierung mit Phorbolmyristatacetat (PMA) und Calciumionophor (A23187)18,19 durchgeführt, da frühere Studien eine defekte T-Zell-Rezeptorsignalisierung in CTCL gezeigt haben und die Stimulation mit PMA/A23187 den T-Zell-Rezeptor20,21 umgeht. Außerdem ermöglicht PMA/A23187 eine direktere proximale Aktivierung von Kernsignalen, die für die Aktivierung von Zytokingenen benötigt werden. Schließlich bietet die Stimulation von T-Zellen eine zusätzliche Ebene des Einblicks in die Regulation der Genexpression, die von ruhenden T-Zellen, in denen dynamische Veränderungen fehlen, nicht gewonnen werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:706px;" width="706">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:269px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1000 ul Pipet tips</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10017-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">15 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">25 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">5 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">50 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">A23187 ionophore</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMSO</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650-5x5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit</td>
			<td style="width:151px;">StemCell</td>
			<td style="width:119px;">19157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FBS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HBSS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">P184-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-072-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:151px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">10378-23-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">phorbol12-myristate13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:151px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rneasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:151px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">T-25 Flask</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling

Kutane T-Zell-Lymphome (CTCL) stammen aus der Transformation und unkontrollierten Proliferation reifer Skin-Homing-T-Zellen, und Mycosis fungoides (MF) und Sézary-Syndrom (SS) stellen die häufigsten Subtypen dar. Trotz einer Reihe von Studien zur Charakterisierung der Genexpression, genetischer Veränderungen und epigenetischer Anomalien von CTCL bleibt die molekulare Pathogenese von MF / SS unklar. MF bezieht sich auf die häufigere CTCL mit einer Hautdominanz und ist normalerweise auf die Haut beschränkt, während SS eine aggressive leukämische Variante von CTCL mit weit verbreiteter Hautbeteiligung ist und durch neoplastische Verteilung gekennzeichnet ist, die hauptsächlich Blut, Haut und Lymphknoten umfasst. Die Identifizierung von Genexpressions-Biomarkern konzentriert sich auf die klinische Praxis und hat ein enormes Potenzial, die Diagnose und Behandlung von MF/SS zu verbessern. In der Tat haben neuere transkriptomische Studien potenzielle diagnostische Biomarker aus Unterschieden in der Genexpression zwischen normalen und bösartigen T-Zellen identifiziert, die unser Verständnis der SS-Biologie verbessern und potenzielle therapeutische Ziele aufdecken könnten. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes reproduzierbares Protokoll für die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen aus frischem Vollblut von Patienten, bei denen SS diagnostiziert wurde, die Auswahl von CD4 + -Gedächtnis-T-Zellen (CD4 + CD45RO + T-Zellen), chemische Stimulation und die Herstellung von RNA, die für die transkriptomische Profilierung geeignet ist, um neue prognostische molekulare Marker zu entdecken, um zusätzliche Einblicke in die Ätiologie der Krankheit zu gewinnen. Die Stimulation mit chemischem Agonisten zur Aktivierung der Kernregulation bietet eine spezifischere Bewertung für Signalwege, die für die dynamische Transkriptionsregulation und Genexpression wichtig sind, und beseitigt verwirrende Defekte, die durch vorgelagerte Signaldefekte entstehen können, die durch TCR-Antigenverlust an der Zellmembran entstehen. Die Daten aus dem Vergleich des Transkriptoms von unstimulierten bis stimulierten SS-T-Zellen entlarven funktionelle regulatorische Genexpressionsdefekte, die aus der Analyse ruhender unstimulierter Zellen nicht ersichtlich sind. Darüber hinaus kann die aus diesem Ansatz skizzierte Methode für die Untersuchung von T-Zell-Genexpressionsdefekten bei anderen T-Zell-Immunerkrankungen angepasst werden.

Dieses Protokoll umfasst Verfahren zur Isolierung von PBMCs aus SS-Blut, zur Reinigung von CD4 + CD45RO + -T-Zellen durch negative Selektion, zur Stimulation gereinigter T-Zellen und zur Isolierung der gesamten RNA für die transkriptomische Profilerstellung. Abbildung 1 beschreibt den Prozess der PBMC-Isolierung aus Vollblut. Bitte beachten Sie, dass die Gesamtausbeute an SS-PBMCs mit dem Anfangsblutvolumen und der zirkulierenden Tumorlast jedes Patienten variiert. In unserem Labor betrug die durchschnittliche Ausbeute an SS-PBMCs 4,6 × 10 6 Zellen/ml Vollblut (1,85 × 106 – 3,25 x 10 7 Zellen/ml für7 SS). Die mittlere Lebensfähigkeit isolierter PBMCs betrug 95\u201299%. Abbildung 2 zeigt die hohe Reinheit und Lebensfähigkeit ausgewählter CD4+CD45RO+-Speicher-T-Zellen. Die durchschnittliche Ausbeute von CD4+CD45RO+ T-Zellen aus SS-PBMCs betrug 75% (75,6% – 84%), verglichen mit 15,9% (3% – 30%) von normalen Spendern (ND) PBMCs, die aus Leukoreduktionssystem-Kammern (LRS) gewonnen wurden. Die Lebensfähigkeit und Reinheit von CD4+CD45RO+-T-Zellen, die durch dieses negative Selektionsprotokoll erhalten wurden, war konstant hoch (Abbildung 3).
Wir haben zuvor das obige Aktivierungsprotokoll mit Microarrays kombiniert, um die funktionellen Veränderungen in den Transkriptomen von SS- und ND-T-Zellen zu untersuchen, und haben gezeigt, dass SS-Speicher-T-Zellen und SS-PBMCs Zytokin und andere Immunantwortgene im Vergleich zu ND-T-Zellen und PBMCsschlecht exprimieren 19,22,23. Abbildung 4 zeigt die robuste Aktivierung mehrerer Zytokingene, einschließlich IL4, IL 10, IL13 und IL22 in ND-T-Zellen, jedoch nicht in SS-T-Zellen. Dieser Defekt in der funktionellen Genexpression in SS-T-Zellen wurde inzwischen von anderen Gruppen24 bestätigt. Darüber hinaus werden viele Gene, die normalerweise nicht in ND-T-Zellen exprimiert werden, in SS-T-Zellen sowohl in Ruhe als auch nach der Stimulation hoch exprimiert (Abbildung 4). Dazu gehören die zuvor beschriebenen SS-Biomarkergene DNM3, PLS3, TOX und TWIST125,26,27 sowie ANK1 und SGCE, die zuerst von unserer Gruppe berichtet wurden. Diese positiven Biomarker werden in SS, aber nicht in ND stark exprimiert und vermeiden technische Fallstricke, die mit negativen Biomarkern verbunden sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2.jpg"> Abbildung 1: PBMC-Isolierung aus Vollblut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig2.jpg"> Abbildung 2: Negative Selektion von CD4+-Speicher-T-Zellen aus isolierten PBMCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig3.jpg"> Abbildung 3: Die Reinheit der CD4+CD45RO+ T-Zellen wurde durch Durchflusszytometrie bestätigt. Lymphozyten wurden durch Lichtstreuung (A) eingezäunt, lebende Lymphozyten schlossen eFluor780-Viabilitätsfarbstoff (B) aus und (C) repräsentiert nicht ausgewählte normale Spender (ND). Negative Selektion führte zu nahezu reinen Populationen von CD45RO+ T-Zellen bei ND (D) und SS-Patienten (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig4.jpg"> Abbildung 4: Differentielle Genexpression in ruhenden und aktivierten CD4+CD45RO+-Speicher-T-Zellen aus SS und ND. Der Genexpressions-Z-Score wird durch eine Farbskala von Rot (hohe Expression) bis grün (niedrige Expression) dargestellt. Farbige Balken oben auf der Heatmap stellen Zellbehandlungen dar: Mock/Fahrzeug behandelt (rot), 2 h stimuliert (blau) und 6 h stimuliert (gelb). Mehrere SS-Biomarker-Gene sind stark exprimiert und Zytokingene werden in SS-T-Zellen im Vergleich zu ND-T-Zellen schlecht exprimiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Reagenzien</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dichte Medium</td>
			<td>Lymphozyten-Trennmedium, Ficoll-Hypaque oder gleichwertiges Dichtemedium mit einer Dichte von = 1,077-1,080 g/ml bei 20°C.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td>1x Hank's ausgewogene Salzlösung, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP10F</td>
			<td>RPMI 1640 mittel, 10 % hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS), 1x Penicillin-Streptomycin-Lösung, pH 7,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACK-Lysepuffer</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Keine Anpassung des pH-Werts. Es sollte ~ 7.3 sein.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Auswahlpuffer</td>
			<td>1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>phorbol12-myristat13-acetat (PMA)</td>
			<td>50 μg/ml in DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>A23187 Ionophor</td>
			<td>500 μg/ml in DMSO</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Reagenzien

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Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Wir präsentieren ein einfaches Protokoll für die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen aus Vollblut, das von Patienten mit diagnostiziertem Sézary-Syndrom gewonnen wurde, gefolgt von der Auswahl von CD4+ T-Zellen, ihrer Stimulation mit Phorbol12-Myristat13-Acetat und A23187-Ionophor und der Vorbereitung von RNA für die transkriptomische Profilerstellung.

Isolierung menschlicher mononukleärer Blutzellen und CD4+ T-Zellen von Patienten mit Sézary-Syndrom für transkriptomisches Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Lymphozyten-T-Zellen von Patienten mit der Krankheit für Studien, den molekularen Defekt und den immunologischen Defekt zu isolieren. Diese Methode ermöglicht es uns, lebensfähige Zellen, Zellen mit den Krankheitsanomalien für die Reinigung von RNA, DNA und Protein von diesen Patienten zu isolieren und molekulare Defekte zu charakterisieren, um Pathways-Anomalien zu verstehen, die in der Pathogenese wichtig sind. Diese Methode ist wertvoll für die Isolierung von peripherem Blut, das weiter fraktioniert werden kann, um Blutzellen in normalen Zuständen sowie Blutzellen von Krankheiten mit Immunanomalien zu untersuchen.Alanna, eine medizinische studentische Forscherin aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie eine periphere Blutprobe in fünf 10-Milliliter-Röhrchen erhalten haben, die Antikoagulans enthalten, geben Sie 10 bis 15 Milliliter Blut in 50-Milliliter-Trennröhrchen, die mit der Probandennummer gekennzeichnet sind, und verdünnen Sie die Proben mindestens zweifach, jedoch auf nicht mehr als 35 Milliliter pro Röhrchen mit HBSS. Unterlegen Sie das Blut vorsichtig und langsam mit etwa 13 Millilitern Dichtemedium pro Röhrchen und stoppen Sie das Pipettieren, wenn die Pipette fast leer ist, um Blasen zu vermeiden.Entfernen Sie die Pipette langsam, um eine Vermischung der Blut- und Dichtemittelschichten zu vermeiden, und geben Sie die gefüllten Trennröhrchen vorsichtig in die Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören. Nachdem Sie die Zellen durch Zentrifugation getrennt haben, entfernen Sie alle bis auf die letzten 10 Milliliter des Plasmas, das die obere Schicht enthält, bevor Sie vorsichtig und langsam das Buffy-Fell sammeln. Fassen Sie die Buffy-Schicht zwischen zwei Trennrohren zu einem einzigen sterilen 50-Milliliter-Röhrchen zusammen und verdünnen Sie das PBMC mindestens zweimal mit frischem HBSS auf insgesamt 50 Milliliter pro Röhrchen.Wenn alle Buffycoats gesammelt wurden, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand aus jedem Röhrchen. Klopfen Sie auf den Röhrchenboden, um das Pellet zu lösen und die Pellets in ein bis zwei Milliliter ACK-Lysepuffer pro ursprünglichem 10-Milliliter-Blutprobenvolumen pro Röhrchen zu resuspendieren. Stoppen Sie nach genau fünf Minuten die Lyse in jeder Röhre mit einem gleichen oder einem größeren Volumen von HBSS und stellen Sie jedes Volumen auf 50 Milliliter ein.Verwerfen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, sammeln Sie die Zellen desselben Spenders und bringen Sie das Volumen mit frischem HBSS für eine weitere Zentrifugation auf bis zu 50 Milliliter. Dann suspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern 37 Grad Celsius RP 10F Medium zum Zählen. Für die CD4 + CD45RO + T-Zellreinigung drehen Sie die Zellen herunter und verdünnen Sie die PBMC auf eine fünfmal 10 bis siebte Zelle pro Milliliter Selektionspufferkonzentration.Übertragen Sie die Zellen in ein fünf Milliliter rundes Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden und fügen Sie 50 Mikroliter Antikörpercocktail pro Milliliter Probe mit sanftem Mischen hinzu. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur wirbeln magnetische Partikel mit hoher Geschwindigkeit für 30 Sekunden auf, bevor 50 Mikroliter magnetische Partikel pro Milliliter Probe mit schonendem Mischen in das Rohr gegeben werden. Bringen Sie das Volumen mit frischem Auswahlpuffer und schonendem Mischen auf 2,5 Milliliter und legen Sie das Rohr für 2,5 Minuten auf einen Magneten.Nehmen Sie am Ende der Inkubation den Magneten auf und drehen Sie das Rohr in einer kontinuierlichen Bewegung um, um die angereicherte Zellsuspension in ein neues steriles Rohr zu dekantieren. Um die Zellerholung zu erhöhen, fügen Sie 2,5 Milliliter Selektionspuffer in das Röhrchen hinzu, ohne die immobilisierten Perlen für eine weitere 2,5-minütige Inkubation auf dem Magneten zu stören, und fügen Sie die Wäsche dem Sammelrohr hinzu, dann zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer und bestätigen Sie die Zellreinheit durch Durchflusszytometrie. Um die Zellen zu aktivieren, stellen Sie CD4+CD45RO+T-Zellen auf eine fünfmal 10 bis sechste Zelle pro Milliliter von 37 Grad Celsius RP 10F mittlerer Konzentration ein und säen Sie die Zellen auf entsprechend große Kulturschalen.Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid-Inkubator ruhen. Am nächsten Morgen sammeln Sie die ausgeruhten Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren das Pellet bei einer fünfmal 10 bis sechsten Zelle pro Milliliter von 37 Grad Celsius RP 10F mittlerer Konzentration. Teilen Sie die Suspension in fünf bis 10 mal 10 bis sechste Zellaliquoten in jeweils drei sterilen Schraubverschlussröhrchen auf und stimulieren Sie die Zellen in Röhrchen zwei mit PMA und Tube drei mit A23187 und schonendem Mischen.Fügen Sie dem ersten Röhrchen, das als Fahrzeugsteuerung dient, ein gleiches Volumen Dimethylsulfoxid hinzu und platzieren Sie die Röhrchen mit den gelösten Kappen für die entsprechende Aktivierungsdauer in den Inkubator. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwerfen so viel Überstand wie möglich, ohne das Zellpellet zu stören. Dann lysieren Sie die Zellen nach Anweisung eines handelsüblichen RNA-Isolationskits und isolieren Sie die RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.Die Lebensfähigkeit und Reinheit von CD4+CD45RO+T-Zellen, die durch dieses negative Selektionsprotokoll erhalten werden, ist konstant hoch. Die Ausbeute an CD4+CD45RO+T-Zellen, die aus Leukoreduktionssystemkammern von SS-PBMCs gewonnen werden, beträgt typischerweise etwa 75% im Vergleich zu etwa 16% von normalen Spender-PBMCs. SS-Speicher-T-Zellen und SS-PBMCs exprimierten Zytokin und andere Immunantwortgene im Vergleich zu Zellen aus normalen Spender-T-Zellen und PBMCs.Darüber hinaus werden viele Gene, die normalerweise nicht in normalen Spender-T-Zellen exprimiert werden, in SS-T-Zellen sowohl in Ruhe als auch nach der Stimulation hoch exprimiert. Eine gute sterile Technik und eine konsequente Routine sind wirklich wichtig für den Erfolg dieser Technik. Es ist auch sehr wichtig, während Sie den Ficoll schichten, dass Sie eine automatische Pipette mit feiner Steuerung verwenden und Sie achten wirklich auf die Geschwindigkeit, mit der Sie den Ficoll ablegen.Zellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, sind lebensfähig und können für Toxizitätsstudien, molekularbiochemische Studien zur Charakterisierung von Signaltransduktionswegen, Durchflusszytometrie und Genexpressionsstudien verwendet werden. Die Methode kann zur Isolierung von Zellen von Patienten mit Krankheit, für entzündliche Erkrankungen und auch für andere Krankheiten wie Krebs für direkte Studien verwendet werden. Beispiele für diese Krankheiten sind Psoriasis und atopische Dermatitis.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Erfassung und Veröffentlichung durchführbare zirkulierender Tumorzellen aus Blut

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Forschung

Krebsforschung

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellierung von Osteosarkom mit Li-Fraumeni-Syndrom, die Patienten abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale Stammzellen isoliert von Pulpagewebe und Kokultur mit Krebszellen ihre Interaktionen zu untersuchen

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

Eine automatisierte mikroskopische Scoring-Methode für den γ-H2AX-Foci-Assay in humanen peripheren Blutlymphozyten

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Entwicklung onkogener heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...