Name: isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling
Uploaded: 2021-10-14T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
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私たちの研究に参加してくださった患者さんやボランティアの方々に感謝いたします。

ヒト細胞は潜在的に感染性である。したがって、実験は、労働安全衛生管理(OSHA)および個人用保護具(PPE)として議論されている必要な予防措置および手順に従って厳密に実施される。
1. 全血からのPBMCの単離
<ol><li>表1から必要なすべての材料を集め、室温(RT)にします。RP10Fを37°Cに温めます。 遠心分離機をRTに調整します。遠心分離と細胞計数を除き、生物学的安全キャビネット内の生細胞を使用してすべての手順を実行します。</li>
	<li>抗凝固剤を含む5本の10mLチューブ(所望の量)で血液を得る。全血を周囲温度(18°C)で保存する。50mL分離チューブに、処理する血液サンプルのヒト研究対象番号をラベル付けする。</li>
	<li>10〜101215mLの血液を、一致する被験者番号で各分離チューブに移す。血液をハンクのバランス塩溶液(HBSS)で少なくとも2倍に希釈します。チューブあたり35mLの希釈血液を超えないでください。</li>
	<li>血液を約13mLの密度培地で注意深くゆっくりと下敷きにします。チューブの底にある透明な密度媒体を通し、ピペットがほとんど空になったらピペッティングを停止します(気泡放出を防ぐため)。ピペットを慎重に取り外して、血液と密度媒体層が混ざらないようにします。</li>
	<li>充填された分離チューブを、層を乱すことなく遠心分離機に慎重に移します。</li>
	<li>遠心分離機ブレーキをオフにして500 x g で30分間遠心分離します(減速をゼロに設定します)。 メモ: 遠心分離機に rpm しか表示されない場合は、ローターの仕様を参照して、500 x g の rpm 相当額を見積もり ます。</li>
	<li>層を乱すことなく遠心分離機から分離チューブを慎重に取り外します。密度媒体層とプラズマ層の間に形成されたバフィーコートを観察します。</li>
	<li>上部からピペットを除去し、上部血漿画分の大部分を廃棄し、10mLがバフィーコートの上に残るようにする。慎重にゆっくりとバフィーコートを集めます。バフィーコートを2つの分離チューブから、 図1に示すように、新しい予め標識された滅菌50mLチューブに移します。</li>
	<li>PBMCをHBSSで少なくとも2倍に希釈し、新しいチューブの容量を最大50mLにします。遠心分離機ブレーキをフルに切り替えてください。ペレットPBMCsを400 x g で10分間遠心分離した。上澄み液をできるだけ取り除き、チューブの底をタップしてペレットを緩めます。</li>
	<li>残留赤血球(RBC)を溶解するために、各細胞ペレットを元の血液量10mLあたり1〜1〜122mLの塩化アンモニウム - カリウム(ACK)溶解緩衝液に再懸濁する。正確に5分間インキュベートする。同容量以上のHBSSによる溶解を速やかに停止し、容量を50mLに調整する。400 x g で10分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を取り出し、チューブの底をタップして細胞ペレットを緩めます。同じドナーからのプール細胞。HBSSで最大50mLのボリュームを持参してください。400 x g で10分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を取り出し、チューブの底をタップして細胞ペレットを緩めます。細胞を10mLの温かいRP10F培地に再懸濁し、トリパンブルーを用いて生細胞計数のためにアリコートをとる。</li>
	<li>血球計数器を用いて各試料中の総細胞数を計算する。</li>
</ol>2. PBMCからのCD4+CD45RO+ T細胞の精製
注:PBMCsからのCD4+CD45RO+ T細胞の精製は、市販の磁気分離( 材料表を参照)を使用して、若干の修正を加えて行われる。各市販キットには独自の指示書があるため、インキュベーション時間についてはキットのマニュアルに従うことをお勧めします。
<ol><li>所望の量のPBMCを10mLの選択緩衝液で洗浄する。400 x g で10分間遠心分離する。上澄み液を取り出し、チューブの底をタップしてペレットを緩めます。</li>
	<li>PBMCを選択バッファーで5 x107 細胞/mLに希釈し、5 mLのポリスチレン丸底チューブ(12 x 75 mm)に移します。</li>
	<li>サンプル1 mLあたり50 μLの抗体カクテルを加え、穏やかに混合する。室温で5分間インキュベートする。</li>
	<li>使用直前に、磁性粒子を高速で30秒間渦巻きます。PBMCsを含むチューブにサンプル1mLあたり50μLの磁性粒子を加え、穏やかに混合する。</li>
	<li>選択バッファーで2.5 mLまでの容量を持ち込み、優しく混ぜます。チューブ(蓋なし)を磁石に入れ、RTで2.5分間インキュベートします。</li>
	<li>磁石を拾い上げ、連続的な動きで、磁石とチューブを反転させて、濃縮細胞懸濁液を新しい滅菌チューブに注ぐ。</li>
	<li>回収率を上げるには、固定化ビーズを乱すことなく、磁石に残っているチューブに2.5 mLの選択バッファーを追加します。磁石の中にさらに2.5分間保持し、ステップ2.6を繰り返して追加の細胞を回収する。</li>
	<li>トリパンブルーを使用して生細胞計数のためのアリコートを取ります.血球計数器または細胞カウンターを使用して総細胞数を計算する。</li>
	<li>フローサイトメトリーにより純度を確認する(図3)。</li>
</ol>3. 化学活性化
<ol><li>温かいRP10F培地でCD4+CD45RO+ T細胞を5 x106 細胞/mLに調整し、所望のサイズの培養皿に細胞を分配する。加湿した37°C5%CO2 インキュベーター内で細胞を一晩休ませた。</li>
	<li>ペレットは、400 x g で10分間遠心分離することによって細胞を休ませた。上清を取り出し、チューブの底をタップして細胞ペレットを緩めます。</li>
	<li>温かいRP10F培地で細胞濃度を5 x106 細胞/mLに調整し、0.5〜107 細胞を3つの滅菌スクリューキャップチューブのそれぞれに分配する。 注:十分な細胞が利用可能な場合、重複した刺激または追加の時点が実験計画に含まれる可能性がある。</li>
	<li>チューブ2および3内の細胞をPMAおよびA23187で刺激する。PMAを25 ng/mL、A23187を500 ng/mLに添加し、穏やかに混ぜる。等量のジメチルスルホキシド(DMSO)を、ビヒクルとして機能するチューブ1内の細胞に加える(対照)。たとえば、1 μL の PMA と 1 μL の A23187 を使用する場合は、2 μL の DMSO をビヒクルチューブに追加します。DMSOの最終濃度をすべてのチューブで0.5%未満に保ちます。</li>
	<li>チューブ上のキャップを緩め、細胞を37°Cの5%CO2 インキュベーターに2時間(チューブ2)および6時間(チューブ1および3)戻した。示された時間に、細胞を500 x g で10分間遠心分離する。</li>
	<li>溶解前に、細胞ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの上清を捨てる。</li>
	<li>市販のRNA単離キットからの指示に従い、速やかに細胞を溶解する( 材料表を参照のこと)。RNA単離を進めるか、溶解液を-80°Cで凍結して、後で追加のサンプルで処理します。 注:RNAの純度および完全性は、マイクロキャピラリー電気泳動を用いて検証することができる。</li>
	<li>オプション: 精製された RNA サンプルからすべての微量の DNA を完全に除去するには、製造元の指示に従って、RNA クリーンアップキット ( 材料表を参照) を使用します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+and+therapy+of+cutaneous+T+cell+lymphoma.">Immunopathogenesis and therapy of cutaneous T cell lymphoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 798-812 (2005).</li><li>Wong, H. 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著者らは開示するものは何もありません。
倫理的開示: この研究プロトコールは、アーカンソー大学医学部(UAMS、リトルロック、AR)の治験審査委員会(IRB)によって承認されましたこの研究で提示されたマイクロアレイデータは、ヘンリーフォード病院(ミシガン州デトロイト)のIRBによって承認された研究プロトコルの下で募集されたサンプルで行われました。

PBMCを単離するいくつかの方法が開発されており、それぞれに独自の利点と限界がある28。抗凝固剤を含む5本の10mLチューブに最大50mLの血液を定期的に採取しています。PBMC単離のための血液の量は、研究対象の健康状態および年齢、ならびに静脈摘出術の専門知識などのいくつかの要因に依存する。プロトコルにおける重要な手続きステップは、ステップ勾配の形成である。層状化が不十分な場合、PBMCが界面で堆積物に部分的または完全に障害を起こす可能性があります。最下層を開始するのは簡単であるため、ここで説明する下層化方法を好みます。血液の下の密度媒体のすべてを完全に分配するには、空気漏れのないピペットエイドを使用することが重要です。望ましくない細胞型によるPBMC画分の汚染は、バフィーコートの慎重かつ一貫した収集によって最小限に抑えることができ、これは各単離に対して同じ方法で実施されるべきである。PBMCをさらに分画しない場合は、分離間で異なる量の密度勾配およびプラズマ層を収集することは避けるべきである。RBC溶解は、RBCおよび網状赤血球由来RNAの汚染が下流の遺伝子発現分析に及ぼす潜在的な影響を最小限に抑えるために行われる。低張溶解は、過剰な等張緩衝液によって阻害されるであろう。
T細胞サブセットのさらなる単離は、分子研究にとって重要である。ここでは、望ましくない細胞型を除去するためのネガティブセレクションによるその後のCD4+CD45RO+ T細胞選択について説明した。ネガティブセレクションは、すべての望ましくない細胞に対して特異的な細胞表面マーカーを認識する抗体に依存する。次いで、抗体被覆細胞は、磁気ビーズによって除去される。この選択プロトコルは、遺伝子活性化の研究に不可欠な、手つかずの標的細胞や刺激されていない標的細胞を自由に浮遊させながら、不要な細胞を除去します。しかしながら、選択されたCD4+ CD45RO+ T細胞の最終純度を低下させる細胞凝集塊を避けるために注意が必要である。選択バッファー中に存在するエチレンジアミン四酢酸(EDTA)は、細胞凝集を最小限に抑えます。T細胞の収量は、血液の初期体積、患者に投与される治療および試料採取時の疾患ステージなどの患者変数などの因子に依存する。患者に与えられる治療はまた、細胞生存率に影響を及ぼし得る。さらに、光フェレーシスなどの任意の手順の前にサンプルを採取することも、CD4 + CD45RO+ T細胞の純度にプラスの影響を与えます。我々は、光フェレーシス処理手順後のサンプル収集がCD4+CD45RO+ T細胞の収量に悪影響を及ぼすことを観察した。
SS患者由来の新生物T細胞クローンは、成熟した記憶CD4 T細胞表現型29、30と一致する表面マーカーを最も頻繁に発現する。しかしながら、表現型可塑性は、CD4、CD45RO、CD45RA、CD7および/またはCD2631を含む表面マーカーに関して時折観察されてきた。以前の研究では、SS患者におけるCD45ROおよびCD45RA発現の不均一性も示されている29が、SS症例の大部分は依然としてCD45RO+である。Roelensら31はまた、SSがナイーブ(TN)、セントラルメモリ(TCM)、トランジショナルメモリ(TTM)、エフェクターメモリ(TEM)、および末端エフェクターメモリ(TEMRA)サブセットの混合集団と個体間および個体内不均一性を示す可能性があることを示した。しかしながら、彼らの結果は、SS細胞の大部分がTCM表現型を有することを明らかに示している。SS患者に最も多いCD45RO+表面免疫表現型に着目し、フローサイトメトリーにより表現型を確認した。患者におけるT細胞サブセットの計画研究においては、研究されている疾患の表現型不均一性を考慮することが重要であり、したがって、分析のために所望のT細胞集団を得るために、必要に応じて精製戦略を調整することができる。
T細胞およびPBMCを刺激して機能的遺伝子発現を調べるには、いくつかの方法があります。我々は核内の遺伝子調節に興味があるので、我々は化学的活性化(PMA + A23187イオノフォア)を好む。化学的活性化は、広範な活性化剤として作用し、抗原特異的刺激と比較してより均一であるため、この目的のための最良の選択肢である。PMAは、細胞膜を通って細胞質に拡散し、プロテインキナーゼC.A23187を直接活性化する小さな有機化合物であり、カルシウムが膜を通過することを可能にする。これらの化合物は、表面受容体をバイパスし、CD28によって媒介される共刺激を伴うT細胞受容体ライゲーションの効果を一緒に模倣する。これらの化学物質は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路を活性化し、核転写因子活性化および転写活性化にアクセス可能なサイトカイン遺伝子の上方制御をもたらす。化学的活性化およびCD3CD28ライゲーションは、正常細胞32において驚くほど類似したグローバル遺伝子発現プロファイルを産生するが、SS T細胞はTCR成分33を含む表面受容体の発現を失う可能性があるため、PMA+ A23187による化学的活性化は良い選択である。Chong et al.22は、正常、初期MF/CTCL、および後期MF/CTCL患者のPBMCにおけるPMA/A23187抗体間のサイトカイン遺伝子の活性化を抗CD3抗体および抗CD28抗体と比較した。彼らは、PMA/A23187が抗CD3/CD28刺激と比較してIL-2遺伝子のより迅速かつ激しい活性化を引き起こしたことを報告した。さらに、抗CD3/CD28抗体による活性化速度論の遅さは、刺激に必要な架橋および膜シグナル伝達によるものである可能性があることが示された。さらに、研究した異なる細胞集団におけるサイトカインの発現の傾向をPMA/A23187で保存した。我々は遺伝子発現活性化に興味を持っているので、化学的刺激は広範な活性化剤として作用し、抗原特異的刺激と比較してより一貫しているため、理想的なアプローチである。CD3/CD28ライゲーションは、膜ベースのシグナル伝達において重要な経路を調査するのに理想的です。さらに、化学的活性化は安価であり、特別な装置を必要としない。現在の研究では、PMA + A23187はNDではサイトカイン遺伝子を有意に活性化したが、SS T細胞では活性化しておらず、SS T細胞はTCRの下流に機能不全を有することを示唆している。
要約すると、このプロトコールは、貴重な患者由来の血液由来の表現型的に純粋なT細胞、および機能的遺伝子発現におけるゲノムワイドな変化を評価するための方法を提供する。我々は、正常なCD45RO+ T細胞と比較したSS T細胞のトランスクリプトームプロファイリングが、CTCL患者の新鮮なヒトT細胞における遺伝子活性化の重大な違いを明らかにすることを実証する。これらの研究は、CTCLにおける新規マーカーを標的とした診断バイオマーカーおよび治療戦略の開発に役立つであろう。さらに、初代ヒトT細胞を研究する際のこの戦略およびプロトコールは、他のT細胞媒介性疾患の研究に適応する上で価値がある可能性がある。

皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)は、最も一般的なサブタイプである真菌症真菌症(MF)およびセザリー症候群(SS)を含む、成熟皮膚ホーミングT細胞の形質転換および制御不能な増殖に由来する疾患の不均一な群である1,2。新生物T細胞は、成熟CD4+CD45RO+、記憶表現型3を有し、皮膚ホーミング接着マーカーを発現し、表皮向性4を増大させ、特に初期疾患において発疹として現れる。MFの臨床経過は、日常的な管理されたケアを受けているとき、しばしば怠惰であるが、患者のサブセットはより進行した疾患に進行する可能性がある。これらのMF症例では、皮膚病変が成長して大きな腫瘍に肥厚し、腫瘍性T細胞がリンパ節および内臓に播種し得る。対照的に、SSはCTCL5のより攻撃的な白血病変異体であり、全身性赤皮症(全身表面積の>80%に影響を及ぼすと定義される)、リンパ節腫脹、および1000 / mm3以上の循環クローン非定型T細胞の存在、いわゆるセザリー細胞6,7.SS患者の予後はMFよりも有意に悪い。SSは発生率が0.1/100,000とまれであり、CTCL症例8,9全体の約3%を占めています。CTCLは、典型的には、約60歳10の中央値年齢を有する高齢者に現れる。CTCLの発生率は増加しており、原因は不明であるが、1998年以来、その割合は安定している11,12。
SSの分子的病因は不明のままである。遺伝学的、エピジェネティック、および遺伝子発現研究は、豊富な新規データを生み出したが、主に研究された小規模な患者コホート2、ならびに実験計画および対照集団の違いのために、一貫性のない所見が残っている13,14。改善されたゲノムおよびトランスクリプトーム特性評価は、疾患メカニズムとこれまで未調査の治療標的の両方に光を当てる可能性があります。したがって、この異種悪性腫瘍をよりよく理解するためには、より大きな患者集団からのより多くの研究が必要である。1つのSSコホートにおいて高感度かつ特異的であるバイオマーカーパネルは、他のコホートにおいてあまり均一に行われておらず15、これはSS16の信頼性の高い診断および予後バイオマーカーの開発において深刻な障害となっている。理想的な診断用バイオマーカーは、悪性T細胞において一貫してかつ高度に過剰発現されるであろうが、正常なT細胞においては存在しないか、またはほとんど存在しない17。疾患特異的バイオマーカーの発見は、SSの診断および治療プロトコルの進歩にとって重要である。
悪性T細胞と正常T細胞の両方について高品質のトランスクリプトームデータには、サンプル調製への効率的で信頼性の高いアプローチが必要です。ここでは、SSに関連するT細胞集団からRNAサンプルを取得するための詳細かつ簡単な戦略について説明します。全血からの末梢血単核球(PBMC)の単離、疾患関連CD4+CD45RO+ T細胞集団の負の磁気選択、機能応答の違いを明らかにするための化学的活性化、およびトランスクリプトームプロファイリングのためのRNAの調製について議論する。現在のプロトコルでは、以前の研究でCTCLにおけるT細胞受容体シグナル伝達の欠陥が示されており、PMA/A23187による刺激がT細胞受容体20,21をバイパスするため、化学的活性化がミリスチン酸酢酸ホルボール(PMA)およびカルシウムイオノフォア(A23187)18,19を用いて行われてきた。また、PMA/A23187は、サイトカイン遺伝子の活性化に必要な核シグナルのより直接的な近位活性化を可能にする。最後に、T細胞の刺激は、動的変化が存在しない静止T細胞からは得られなかった遺伝子発現の調節に関するさらなるレベルの洞察を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:706px;" width="706">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:269px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1000 ul Pipet tips</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10017-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">15 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">25 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">5 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">50 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">A23187 ionophore</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMSO</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650-5x5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit</td>
			<td style="width:151px;">StemCell</td>
			<td style="width:119px;">19157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FBS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HBSS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">P184-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-072-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:151px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">10378-23-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">phorbol12-myristate13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:151px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rneasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:151px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">T-25 Flask</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling

皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)は、成熟皮膚ホーミングT細胞の形質転換および制御不能な増殖に由来し、真菌症ファンゴイド(MF)およびセザリー症候群(SS)は最も一般的なサブタイプを表す。CTCLの遺伝子発現、遺伝子変異、エピジェネティックな異常を特徴付ける多くの研究にもかかわらず、MF/SSの分子病因は不明のままである。MFは、皮膚優勢を有するより一般的なCTCLを指し、通常は皮膚に限定されるが、SSは、広範な皮膚関与を有するCTCLの積極的な白血病変異体であり、主に血液、皮膚、およびリンパ節を含む腫瘍性分布によって特徴付けられる。臨床現場に着目し、遺伝子発現バイオマーカーの同定は、MF/SSの診断と治療を改善する大きな可能性を秘めています。実際、最近のトランスクリプトーム研究では、正常T細胞と悪性T細胞の遺伝子発現の違いから潜在的な診断バイオマーカーが同定されており、SS生物学の理解が向上し、潜在的な治療標的が明らかになる可能性があります。この原稿は、SSと診断された患者からの新鮮な全血からの末梢血単核球の単離、CD4+メモリーT細胞(CD4+CD45RO+ T細胞)の選択、化学的刺激、およびトランスクリプトームプロファイリングに適したRNAの調製のための詳細な再現可能なプロトコールを記載し、疾患病因におけるさらなる洞察を得るための新規予後分子マーカーを発見する。核調節を活性化するための化学アゴニストを用いた刺激は、動的転写調節および遺伝子発現において重要な経路のより具体的な評価を提供し、細胞膜におけるTCR抗原喪失から生じる上流シグナル伝達欠陥から生じる可能性のある交絡欠陥を排除する。無刺激から刺激されたSS T細胞へのトランスクリプトームの比較から得られたデータは、静止非刺激細胞の分析から明らかではない機能調節遺伝子発現欠陥を覆い隠す。さらに、このアプローチから概説される方法は、他のT細胞免疫疾患におけるT細胞遺伝子発現欠損を研究するために適合させることができる。

このプロトコルには、SS血液からのPBMCの単離、ネガティブセレクションによるCD4+CD45RO+ T細胞の精製、精製T細胞の刺激、およびトランスクリプトームプロファイリングのための全RNAの単離のための手順が含まれています。 図1は 、全血からのPBMC単離のプロセスを説明する。SS PBMCの総収量は、各患者の開始血液量および循環腫瘍量によって異なることに留意されたい。当研究室では、SS PBMCの平均収量は全血106細胞/mLに対して4.6 ×(7SSに対して1.85×106~ 3.25×107 細胞/mL)でした。単離されたPBMCの平均生存率は95〜999%であった。 図2 は、選択されたCD4+CD45RO+メモリーT細胞の高純度および生存率を示す。SS PBMCsからのCD4+CD45RO+ T細胞の平均収率は、白血球還元系(LRS)チャンバーから得られた正常ドナー(ND)PBMCからの15.9%(3%-30%)と比較して、75%(75.6%-84%)であった。このネガティブ選択プロトコルによって得られたCD4+CD45RO+ T細胞の生存率および純度は一貫して高い(図3)。
我々は以前、上記の活性化プロトコルをマイクロアレイと組み合わせて、SS細胞およびND T細胞の両方のトランスクリプトームの機能的変化を研究し、SSメモリーT細胞およびSS PBMCがND T細胞およびPBMCと比較してサイトカインおよび他の免疫応答遺伝子をあまり発現しないことを実証した19、22、23。図4は、ND T細胞におけるIL4、IL10、IL13およびIL22を含むいくつかのサイトカイン遺伝子の堅牢な活性化を示すが、SS T細胞ではそうではない。 SS T細胞における機能的遺伝子発現におけるこの欠陥は、それ以来、他のグループ24によって確認されている。さらに、ND T細胞では通常発現しない多くの遺伝子は、静時および刺激後の両方でSS T細胞で高発現される(図4)。これらには、前述のSSバイオマーカー遺伝子DNM3、PLS3、TOXおよびTWIST125、26、27、ならびに我々のグループによって最初に報告されたANK1およびSGCEが含まれる。これらの陽性バイオマーカーはSSで高度に発現されるがNDでは発現せず、陰性バイオマーカーに関連する技術的な落とし穴を回避する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2.jpg"> 図1:全血からのPBMC単離。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig2.jpg"> 図2:単離されたPBMCからのCD4+メモリーT細胞のネガティブセレクション。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig3.jpg"> 図3:CD4+CD45RO+ T細胞の純度をフローサイトメトリーにより確認した。 光散乱によりゲーティングしたリンパ球(A)、eFluor780生存率色素を除外した生リンパ球(B)、および(C)は、非選択正常ドナー(ND)を表す。ネガティブな選択は、ND(D)およびSS患者(E)におけるCD45RO+ T細胞のほぼ純粋な集団をもたらした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig4.jpg"> 図4:SSおよびND由来の休止および活性化CD4+CD45RO+メモリーT細胞における差異遺伝子発現。 遺伝子発現zスコアは、赤色(高発現)から緑色(低発現)までのカラースケールで表される。ヒートマップの上部にある色付きのバーは、モック/ビヒクル処理済み(赤)、2時間刺激(青)、および6時間刺激(黄色)の細胞処理を表します。いくつかのSSバイオマーカー遺伝子はND T細胞と比較してSS T細胞において高発現しており、サイトカイン遺伝子は低発現である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>密度ミディアム</td>
			<td>リンパ球分離培地、Ficoll-Hypaque、または密度= 1.077-1.080g / mlの同等の密度培地(20oC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ティッカー</td>
			<td>1x ハンクスバランス塩溶液、4.2 mM NaHCO3、10 mM HEPES、pH 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP10F</td>
			<td>RPMI 1640培地、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、1xペニシリン - ストレプトマイシン溶液、pH 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACK溶解バッファー</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pHを調整する必要はありません。〜7.3でなければなりません。</td>
		</tr>
<tr>
<td>選択バッファ</td>
			<td>1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)</td>
			<td>50 μg/ml (DMSO 内)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A23187 アイオノフォア</td>
			<td>500 μg/ml (DMSO中)</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:試薬

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Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

我々は、セザリー症候群と診断された患者から得られた全血から末梢血単核球を単離し、続いてCD4+ T細胞の選択、phorbol12-ミリスチン酸13-アセテートおよびA23187イオノフォアによるそれらの刺激、およびトランスクリプトームプロファイリングのためのRNAの調製のための簡単なプロトコールを提示する。

トランスクリプトームプロファイリングのためのセザリー症候群患者からのヒト末梢血単核球およびCD4+ T細胞の単離

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

このプロトコルにより、研究、分子欠損および免疫学的欠損のために、疾患を有する患者からリンパ球T細胞を単離する能力が可能になる。この方法により、これらの患者からRNA、DNA、タンパク質を精製するために、生存細胞、疾患異常を有する細胞を単離することができ、分子欠陥を特徴付けて、病因に重要な経路異常を理解することができる。この方法は、正常状態の血球、ならびに免疫異常を有する疾患からの血球を研究するためにさらに分画することができる末梢血の単離に有用である。この手順を実演するのは、私の研究室の医学生研究員であるAlannaです。抗凝固剤を含む5本の10ミリリットルチューブで末梢血サンプルを得た後、被験者番号でラベル付けされた50ミリリットルの分離チューブに10〜15ミリリットルの血液を移し、サンプルを少なくとも2倍に希釈するが、HBSSでチューブあたり35ミリリットル以下とする。チューブあたり約13ミリリットルの密度媒体で血液を慎重にゆっくりと下敷きにし、泡を防ぐためにピペットがほとんど空になったらピペッティングを停止します。血液と密度媒体層が混ざらないようにピペットをゆっくりと取り外し、充填した分離チューブを層を乱すことなく慎重に遠心分離機に移します。遠心分離によって細胞を分離した後、上層を含む血漿の最後の10ミリリットルを除くすべてを除去してから、バフィーコートを注意深くゆっくりと回収する。2つの分離チューブの間からバフィーコートを単一のラベル付き滅菌50ミリリットルチューブにプールし、PBMCを新鮮なHBSSで少なくとも2倍に希釈して、チューブあたり合計50ミリリットルにします。すべてのバフィーコートが収集されたら、遠心分離によって細胞をペレット化し、各チューブからできるだけ多くの上清を除去する。チューブの底部をタップしてペレットを緩め、チューブあたり元の10ミリリットルの血液サンプル量あたり1〜2ミリリットルのACK溶解バッファーにペレットを再懸濁します。正確に5分後、等容量以上のHBSSで各チューブの溶解を停止し、各容量を50ミリリットルに調整する。遠心分離後、上清を捨て、同じドナーから細胞をプールし、別の遠心分離のために新鮮なHBSSで最大50ミリリットルの容量をもたらす。次いで、計数のために細胞を10ミリリットルの摂氏37度RP 10F培地に再懸濁する。CD4+CD45RO+T細胞精製のために、細胞をスピンダウンし、PBMCを選択緩衝液濃度のミリリットル当たり10〜7番目の細胞の5倍に希釈する。細胞を5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに移し、穏やかに混合しながらサンプル1ミリリットルあたり50マイクロリットルの抗体カクテルを加える。室温で5分後、渦磁性粒子を30秒間高速で加速し、その後、穏やかに混合しながらチューブに試料1ミリリットルあたり50マイクロリットルの磁性粒子を加える。新鮮な選択バッファーと穏やかな混合で容量を2.5ミリリットルにし、チューブを磁石の上に2.5分間置きます。インキュベーションの最後に、磁石を拾い上げ、チューブを1つの連続運動で反転させて、濃縮細胞懸濁液を新しい滅菌チューブにデカントする。細胞回収率を高めるには、固定化ビーズを邪魔することなくチューブに2.5ミリリットルの選択バッファーを加え、磁石上でさらに2.5分間インキュベーションし、洗浄液を収集チューブに追加し、血球計数器を使用して生細胞数をカウントし、フローサイトメトリーによって細胞純度を確認します。細胞を活性化するには、CD4+CD45RO+T細胞を37°CのRP 10F培地濃度のミリリットル当たり10~6個目の細胞の5倍になるように調整し、適切な大きさの培養皿に細胞を播種する。加湿された摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を一晩休ませる。翌朝、遠心分離により休止細胞を回収し、37°C摂氏RP 10F培地濃度の1ミリリットル当たり10~6個目の細胞を5回10~5回でペレットを再懸濁した。懸濁液を3つの滅菌スクリューキャップチューブのそれぞれで5〜10回10〜6個の細胞アリコートに分割し、チューブ2の細胞をPMAで、チューブ3をA23187で刺激し、穏やかに混合する。等量のジメチルスルホキシドを第1のチューブに加えてビヒクルコントロールとして機能し、キャップを緩めたチューブを適切な活性化期間の間インキュベーターに入れます。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細胞を収集し、細胞ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上清を捨てる。次いで、市販のRNA単離キットの指示に従って細胞を溶解し、製造業者の指示に従ってRNAを単離する。このネガティブ選択プロトコルによって得られたCD4 + CD45RO + T細胞の生存率および純度は一貫して高い。SS PBMCsからの白血還元系チャンバーから得られたCD4+CD45RO+T細胞の収量は、正常ドナーPBMCsから約16%と比較して典型的には約75%である。 SSメモリーT細胞およびSS PBMCは、正常なドナーT細胞およびPBMCからの細胞と比較して、サイトカインおよび他の免疫応答遺伝子の発現が乏しい。さらに、正常なドナーT細胞では通常発現しない多くの遺伝子は、静置時および刺激後の両方でSS T細胞において高発現される。優れた滅菌技術と一貫したルーチンは、この技術の成功にとって非常に重要です。また、Ficollを重ねている間は、細かいコントロールを備えた自動ピペットを使用し、Ficollを敷設する速度に本当に注意を払うことも非常に重要です。この方法を用いて単離された細胞は生存可能であり、毒性研究、シグナル伝達経路の特性評価のための分子生化学的研究、フローサイトメトリーおよび遺伝子発現研究に使用することができる。この方法は、疾患を有する患者から細胞を単離するために、炎症性疾患のために、および直接研究のために癌などの他の疾患のためにも使用することができる。これらの疾患の例には、乾癬およびアトピー性皮膚炎が含まれる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)移植型ヒト型異物移植モデル翻訳免疫腫瘍学(I-O)研究

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

アペレットヒト産物からのガンマデルタ(γδ)T細胞の増殖と濃縮

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

ヒト末梢血リンパ球におけるγ-H2AX Fociアッセイの自動微視的スコアリング法

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

進行性大腸癌を再現するマウスへの患者由来癌細胞の同所性移植

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...