Name: isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling
Uploaded: 2021-10-14T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÂ©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling at JoVE.com

우리 연구에 참여한 환자와 자원 봉사자들에게 감사드립니다.

인간 세포는 잠재적으로 전염성이 있습니다. 따라서 실험은 산업 안전 보건 행정 (OSHA) 및 개인 보호 장비 (PPE)로 논의 된 필수 예방 조치 및 절차에 따라 엄격하게 수행됩니다.
1. 전혈에서 PBMC의 분리
<ol><li>표 1에서 필요한 모든 재료를 수집하여 실온 (RT)으로 가져 오십시오. RP10F를 37 °C로 따뜻하게하십시오. 원심분리기를 RT로 조정하십시오. 원심분리 및 세포 계수를 제외하고 생물학적 안전 캐비닛에서 생존 가능한 세포를 사용하여 모든 단계를 수행하십시오.</li>
	<li>항응고제를 함유 한 다섯 개의 10 mL 튜브 (원하는 양)에서 혈액을 얻습니다. 전혈을 주변 온도 (18 \ u201224 ° C)에 보관하십시오. 50 mL 분리 튜브에 처리될 혈액 샘플에 대한 인간 연구 대상 번호로 라벨링한다.</li>
	<li>10\u201215 mL의 혈액을 피험자 번호가 일치하는 각 분리 튜브에 옮깁니다. 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 혈액을 적어도 2 배 희석하십시오. 튜브 당 희석 된 혈액의 35 mL를 초과하지 마십시오.</li>
	<li>~ 13 mL의 밀도 배지로 조심스럽게 천천히 혈액을 밑에 눕히십시오. 튜브 바닥의 투명한 밀도 매체를 통해 관찰하고 피펫이 거의 비어있을 때 피펫팅을 중단하십시오 (거품 방출을 방지하기 위해). 피펫을 조심스럽게 제거하여 혈액과 밀도 중간 층이 혼합되지 않도록하십시오.</li>
	<li>채워진 분리 튜브를 층을 방해하지 않고 원심 분리기로 조심스럽게 옮깁니다.</li>
	<li>500 x g 에서 30분 동안 원심분리기를 원심분리기 브레이크 오프(감속이 0으로 설정)하여 분리한다. 참고: 원심분리기가 rpm만 표시하는 경우 로터 사양을 참조하여 500 x g에 해당하는 rpm을 추정 하십시오.</li>
	<li>층을 방해하지 않고 원심 분리기에서 분리 튜브를 조심스럽게 제거하십시오. 밀도 매질과 플라즈마층 사이에 형성된 버피 코트를 관찰하십시오.</li>
	<li>상부로부터 피펫을 제거하고 대부분의 상부 혈장 분획을 버리고, 10 mL가 버피 코트 위에 남게 한다. 조심스럽게 천천히 버피 코트를 수집하십시오. 버피 코트를 두 개의 분리 튜브에서 새로운 사전 라벨이 부착되고 멸균된 50 mL 튜브로 옮깁니다( 그림 1).</li>
	<li>PBMC를 HBSS로 최소 2배 이상 희석하여 각각의 새 튜브의 부피를 최대 50mL까지 가져옵니다. 원심 분리기 브레이크를 완전히 전환하는 것을 잊지 마십시오. 펠릿 PBMCs를 400 x g 에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 가능한 한 많이 제거하고 튜브 바닥을 탭하여 펠렛을 느슨하게하십시오.</li>
	<li>잔류 적혈구(RBC)를 용해시키려면 각 세포 펠릿을 원래 혈액 부피 10mL당 염화암모늄-칼륨(ACK) 용해 완충액 1\u20122mL에 재현탁하십시오. 정확히 5 분 동안 배양하십시오. 동일하거나 더 큰 부피의 HBSS로 즉시 용해를 중단하고 부피를 50 mL로 조절하십시오. 400 x g 에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 튜브 바닥을 탭하여 세포 펠렛을 느슨하게하십시오. 동일한 기증자의 풀 세포. HBSS로 최대 50mL의 부피를 가져옵니다. 400 x g 에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 튜브 바닥을 탭하여 세포 펠렛을 느슨하게하십시오. 세포를 따뜻한 RP10F 배지 10 mL에 재현탁하고, 트리판 블루를 사용하여 생존 가능한 세포 계수를 위한 분취량을 취한다.</li>
	<li>혈구분석기를 사용하여 각 샘플의 총 세포 수를 계산하십시오.</li>
</ol>2. PBMCs로부터의 CD4+CD45RO+ T 세포의 정제
참고: PBMCs로부터 CD4+CD45RO+ T 세포의 정제는 약간의 변형과 함께 상업적으로 이용가능한 자기 분리( 물질의 표 참조)를 사용하여 수행된다. 각 상용 키트에는 자체 지침이 있으므로 인큐베이션 시간 동안 키트 설명서를 따르는 것이 바람직합니다.
<ol><li>원하는 양의 PBMC를 10 mL의 선택 완충액으로 세척한다. 400 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 튜브 바닥을 탭하여 펠렛을 느슨하게하십시오.</li>
	<li>PBMC를 선택 버퍼에서 5 x 107 cells/mL로 희석하고 5mL의 폴리스티렌 둥근바닥 튜브(12 x 75mm)로 옮깁니다.</li>
	<li>샘플 1mL당 50μL의 항체 칵테일을 넣고 부드럽게 섞는다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>사용 직전에 고속으로 30 초 동안 자성 입자를 와류시킵니다. 샘플 1mL당 50μL의 자성 입자를 PBMC가 들어있는 튜브에 넣고 부드럽게 섞는다.</li>
	<li>선택 버퍼로 부피를 최대 2.5mL까지 가져오고 부드럽게 섞으십시오. 튜브 (뚜껑 없음)를 자석에 넣고 RT에서 2.5 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>자석을 집어 들고 연속 동작으로 자석과 튜브를 뒤집어 농축 된 세포 현탁액을 새로운 멸균 튜브에 붓습니다.</li>
	<li>회수율을 높이려면 고정화된 비드를 방해하지 않고 자석에 남아있는 튜브에 2.5mL의 선택 버퍼를 첨가한다. 자석에 2.5분 동안 보관하고, 단계 2.6을 반복하여 추가적인 세포를 회수한다.</li>
	<li>트리판 블루를 사용하여 실행 가능한 세포 계수를위한 분취량을 가져 가라. 혈구세포계 또는 세포 계수기를 사용하여 총 세포 수를 계산하십시오.</li>
	<li>유세포 분석기로 순도를 확인합니다(그림 3).</li>
</ol>3. 화학적 활성화
<ol><li>따뜻한 RP10F 배지로 CD4+CD45RO+ T 세포를 5 x 106 세포/mL로 조정하고 원하는 크기의 배양 접시에 세포를 분배합니다. 휴지 세포는 가습된 37°C 5%CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양된다.</li>
	<li>펠릿 휴지된 세포를 400 x g 에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 튜브 바닥을 탭하여 세포 펠렛을 느슨하게하십시오.</li>
	<li>따뜻한 RP10F 배지로 세포 농도를 5 x 106 cells/mL로 조정하고 0.5\u20121 x 107 셀을 세 개의 멸균 스크류 캡 튜브 각각에 분배합니다. 참고: 충분한 세포를 사용할 수 있는 경우, 중복 자극 또는 추가 시점이 실험 설계에 포함될 수 있습니다.</li>
	<li>튜브 2와 3의 세포를 PMA 및 A23187로 자극하십시오. PMA를 25ng/mL, A23187을 500ng/mL에 넣고 부드럽게 섞습니다. 비히클(대조군)으로서 작용할 튜브 1의 세포에 동량의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가한다. 예를 들어, 1 μL의 PMA와 1 μL의 A23187을 사용하는 경우, 2 μL의 DMSO를 차량 튜브에 첨가하십시오. DMSO의 최종 농도를 모든 튜브에서 0.5% 미만으로 유지하십시오.</li>
	<li>튜브 상의 캡을 느슨하게 하고, 세포를2h (튜브 2) 및 6시간 동안 37°C 5% CO2 인큐베이터(튜브 1 및 3)로 복귀시킨다. 지시된 시간에, 세포를 500 x g 에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>용해되기 전에, 세포 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 폐기하십시오.</li>
	<li>상업적으로 이용가능한 RNA 분리 키트로부터의 지시에 의해 지시된 바와 같이 세포를 즉시 용해시킨다( 표 문헌 참조). RNA 단리를 진행하거나, 용해물을 -80°C에서 동결시켜 추후 추가 샘플로 처리한다. 참고: RNA 순도 및 완전성은 미세모세관 전기영동을 사용하여 검증될 수 있다.</li>
	<li>선택 사항: 정제된 RNA 샘플에서 DNA의 모든 흔적을 완전히 제거하려면 제조업체의 지침에 따라 RNA 정리 키트( 재료 표 참조)를 사용합니다.</li>
</ol>

<ol>
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윤리적 공개: 이 연구 프로토콜은 아칸소 대학 의료 과학 (UAMS, Little Rock, AR)의 기관 검토위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다.이 연구에서 제시된 마이크로 어레이 데이터는 Henry Ford Hospital (디트로이트, MI)의 IRB가 승인 한 연구 프로토콜에 따라 모집 된 샘플에서 수행되었습니다.

PBMC를 분리하는 여러 가지 방법이 개발되었으며, 각각은 그들 자신의 장점과 한계(28)를 갖는다. 우리는 항응고제가 들어있는 5 개의 10 mL 튜브에 최대 50 mL의 혈액을 일상적으로 수집합니다. PBMC 격리를위한 혈액의 양은 연구 대상의 건강 및 나이와 같은 몇 가지 요인과 정맥 내과 전문의 전문 지식에 달려 있습니다. 프로토콜에서 중요한 절차 단계는 단계 구배의 형성입니다. 불량한 계층화는 PBMC가 계면에서 퇴적물에 부분적으로 또는 완전히 실패하는 결과를 초래할 수 있습니다. 우리는 하단 레이어를 쉽게 시작할 수 있기 때문에 여기에 설명 된 언더 레이어링 방법을 선호합니다. 혈액 아래의 모든 밀도 매체를 완전히 분배하려면 공기 누출없이 피펫 보조제를 사용하는 것이 중요합니다. 바람직하지 않은 세포 유형에 의한 PBMC 분획의 오염은 버피 코트의 신중하고 일관된 수집에 의해 최소화될 수 있으며, 이는 각각의 단리에 대해 동일한 방식으로 수행되어야 한다. PBMC가 더 이상 분별되지 않을 경우, 분리들 사이의 밀도 구배와 플라즈마 층의 상이한 양을 수집하는 것은 피해야 한다. RBC 용해는 하류 유전자 발현 분석에 대한 RBC- 및 망상적혈구 유래 RNA의 잠재적 영향을 최소화하기 위해 수행된다. 저조성 용해는 과도한 등장성 완충제에 의해 억제될 것이다.
T 세포 하위세트의 추가 단리는 분자 연구에 중요하다. 여기에서는 바람직하지 않은 세포 유형을 제거하기 위한 음성 선택에 의한 후속 CD4+CD45RO+ T 세포 선택을 기술하였다. 음성 선택은 모든 바람직하지 않은 세포에 대한 특정 세포 표면 마커를 인식하는 항체에 의존합니다. 항체 코팅된 세포는 이어서 자기 비드에 의해 제거된다. 이 선택 프로토콜은 원치 않는 세포를 제거하면서 손길이 닿지 않은 표적 세포와 자극되지 않은 표적 세포가 자유롭게 떠 다니는 것을 허용하며, 이는 유전자 활성화를 연구하는 데 필수적입니다. 그러나, 선택된 CD4+ CD45RO+ T 세포의 최종 순도를 감소시키는 세포 덩어리를 피하기 위해 주의를 기울여야 한다. 선택 완충액에 존재하는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 세포 응집을 최소화합니다. T 세포의 수율은 혈액의 초기 부피, 환자에게 투여되는 치료 및 샘플 수집시의 질병 단계와 같은 환자 변수와 같은 인자에 의존한다. 환자에게 주어진 치료는 또한 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 광페레시스와 같은 임의의 절차 전에 샘플 수집은 또한 CD4+CD45RO+ T 세포 순도에 긍정적인 영향을 미친다. 우리는 광페레시스 처리 절차 후 샘플 수집이 CD4 + CD45RO + T 세포 수율에 부정적인 영향을 미친다는 것을 관찰했습니다.
SS 환자로부터의 신생물성 T 세포 클론은 성숙한, 기억 CD4 T 세포 표현형29,30과 일치하는 표면 마커를 가장 빈번하게 발현한다. 그러나, 표현형 가소성은 CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 및/또는 CD26(31)을 포함하는 표면 마커에 대하여 때때로 관찰되었다. 이전의 연구는 또한 SS 환자29 사이에서 CD45RO 및 CD45RA 발현에서 이질성을 보여 주었지만, SS 사례의 대부분은 여전히 CD45RO+이다. Roelens et al.31은 또한 SS가 나이브 (TN), 중앙 메모리 (TCM), 과도기 메모리 (TTM), 이펙터 메모리 (TEM) 및 말단 이펙터 메모리 (TEMRA) 서브 세트의 혼합 집단과 함께 개인간 및 개인 내 이질성을 나타낼 수 있음을 보여주었습니다. 그러나, 그들의 결과는 SS 세포의 대다수가 TCM 표현형을 가지고 있음을 분명히 보여준다. 우리는 SS 환자에서 가장 흔한 CD45RO+ 표면 면역 표현형에 대한 우리의 연구에 초점을 맞추었고, 유세포 분석기에 의해 표현형을 확인했다. 환자에서 T 세포 서브세트에 대한 연구를 계획할 때, 연구되는 질병의 표현형 이질성을 고려하는 것이 중요하며, 따라서 정제 전략은 분석을 위해 원하는 T 세포 집단을 얻기 위해 필요에 따라 조정될 수 있다.
기능적 유전자 발현을 검사하기 위해 T 세포 및 PBMC를 자극하는 몇 가지 방법이 있다. 우리는 핵에서 유전자 조절에 관심이 있기 때문에 화학 활성화 (PMA + A23187 ionophore)를 선호합니다. 화학적 활성화는 광범위한 활성화제로서 작용하고 항원 특이적 자극에 비해 더 균일하기 때문에 이러한 목적에 가장 적합한 선택이다. PMA는 세포막을 통해 세포질로 확산되는 작은 유기 화합물로, 단백질 키나아제 C. A23187을 직접 활성화시켜 칼슘이 막을 통과할 수 있게 합니다. 이들 화합물은 표면 수용체를 우회하고, 함께 CD28에 의해 매개되는 공동자극과 함께 T 세포 수용체 라이게이션의 효과를 모방한다. 화학 물질은 여러 세포 내 신호 전달 경로를 활성화시켜 핵 전사 인자 활성화 및 전사 활성화에 접근 할 수있는 사이토 카인 유전자의 상향 조절을 초래합니다. 화학적 활성화 및 CD3CD28 라이게이션이 정상 세포(32)에서 현저하게 유사한 글로벌 유전자 발현 프로파일을 생성하지만, SS T 세포가 TCR 성분(33)을 포함하는 표면 수용체의 발현을 잃을 수 있기 때문에 PMA+A23187을 사용한 화학적 활성화는 좋은 선택이다. Chong et al.22는 PMA/A23187 사이의 사이토카인 유전자의 활성화를 정상, 초기 MF/CTCL 및 후기 MF/CTCL 환자의 PBMC에서 항-CD3 및 항-CD28 항체와 비교하였다. 그들은 PMA / A23187이 항 CD3 / CD28 자극에 비해 IL-2 유전자의 더 빠르고 강렬한 활성화를 일으킨다고보고했다. 추가적으로, 그들은 항-CD3/CD28 항체를 사용한 느린 활성화 동역학이 자극에 필요한 가교결합 및 막 신호전달로부터 잠재적으로 나타난다는 것을 보여주었다. 또한, 연구된 상이한 세포 집단들 사이에서 사이토카인의 발현 경향은 PMA/A23187로 보존되었다. 우리는 유전자 발현 활성화에 관심이 있기 때문에, 화학적 자극은 광범위한 활성화제로서 작용하고 항원 특이적 자극에 비해 더 일관적이기 때문에 이상적인 접근법이다. CD3/CD28 라이게이션은 막 기반 신호 전달에 중요한 경로를 조사하는 데 이상적입니다. 또한 화학 활성화는 비용이 적게 들고 특수 장비가 필요하지 않습니다. 현재의 연구에서, PMA + A23187은 ND에서 사이토카인 유전자를 유의하게 활성화시켰지만 SS T 세포는 활성화시키지 않았으므로, SS T 세포가 TCR의 하류에 기능적 결함을 갖는다는 것을 시사한다.
요약하면, 이 프로토콜은 귀중한 환자 유래 혈액으로부터의 표현형적으로 순수한 T 세포, 및 기능적 유전자 발현의 게놈 전체 변화를 평가하는 방법을 제공한다. 우리는 정상 CD45RO+ T 세포와 비교하여 SS T 세포의 전사체 프로파일링이 CTCL 환자로부터의 신선한 인간 T 세포에서의 유전자 활성화에 심오한 차이를 나타낸다는 것을 입증한다. 이러한 연구는 CTCL에서 새로운 마커를 표적으로 하는 진단 바이오마커 및 치료 전략의 개발을 도울 것이다. 또한, 일차 인간 T 세포를 연구하는 이러한 전략 및 프로토콜은 다른 T 세포 매개 질환의 연구에 적응하는데 유용할 수 있다.

가장 흔한 아형 진균증 진균증 (MF) 및 세자리 증후군 (SS)을 포함하는 피부 T 세포 림프종 (CTCL)은 성숙한 피부 호밍 T 세포 1,2의 형질전환 및 조절되지 않은 증식으로부터 유래된 이종 질환 그룹이다. 신생물성 T 세포는 성숙한 CD4+CD45RO+, 기억 표현형3을 가지며, 피부 호밍 부착 마커를 발현하여, 표피촉진증4을 증가시키며, 이는 특히 초기 질환에서 발진으로 나타난다. MF의 임상 과정은 일상적인 관리 치료를받을 때 종종 나태하지만 환자의 하위 집합은보다 진행된 질병으로 진행될 수 있습니다. 이러한 MF의 경우, 피부 병변은 성장하고 큰 종양으로 두꺼워지며, 신생물성 T 세포는 림프절 및 내장 장기로 전파될 수 있다. 대조적으로, SS는 CTCL5의 더 공격적이고 백혈병 변종으로, 증상의 삼중항을 특징으로합니다 : 일반화 된 적혈구 종증 (전체 신체 표면적의 >80 %에 영향을 미치는 것으로 정의됨), 림프절 병증 및 1000 / mm 이상의순환 클론 비정형 T 세포의 존재, 소위 세자리 세포 6,7 . SS 환자의 예후는 MF보다 훨씬 나쁩니다. SS는 0.1/100,000의 발생률로 드물며, 전체 CTCL 사례 8,9의 약 3%를 나타냅니다. CTCL은 전형적으로 약 60세10세의 중간 연령을 가진 고령자에게 제시한다. CTCL의 발생률은 증가하고 있었고 원인은 불분명하지만 1998 년11,12 이후 그 비율이 안정화되었습니다.
SS의 분자 병인은 불분명하다. 유전적, 후성유전학적, 유전자 발현 연구는 풍부한 새로운 데이터를 만들어 냈지만, 주로 연구된 작은 환자 코호트 2와 실험 설계 및 통제 집단의 차이13,14로 인해 일관성없는 결과가 남아 있습니다. 개선된 게놈 및 전사체 특성화는 질병 메커니즘과 이전에 탐구되지 않은 치료 표적 둘 다에 대해 밝혀줄 수 있다. 따라서이 이질적인 악성 종양을 더 잘 이해하기 위해서는 더 큰 환자 집단의 더 많은 연구가 필요합니다. 하나의 SS 코호트에서 고도로 민감하고 특이적인 바이오마커 패널은 다른 코호트(15)에서 덜 균일하게 수행되었으며, 이는 SS16에 대한 신뢰할 수 있는 진단 및 예후 바이오마커의 개발에 심각한 장애물을 나타낸다. 이상적인 진단 바이오마커는 악성 T 세포에서 일관되고 고도로 과발현되는 반면, 정상 T 세포(17)에서는 부재하거나 거의 부재할 것이다. 질병 특이적 바이오마커의 발견은 SS에 대한 진단 및 치료 프로토콜의 발전에 중요하다.
악성 및 정상 T 세포 모두에 대한 고품질 전사체 데이터는 샘플 준비에 대한 효율적이고 신뢰할 수 있는 접근법을 필요로 한다. 여기에서는 SS와 관련된 T 세포 집단으로부터 RNA 샘플을 얻기 위한 상세하면서도 간단한 전략에 대해 논의할 것이다. 우리는 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 분리, 질병 관련 CD4 + CD45RO + T 세포 집단의 음성 자기 선택, 기능적 반응의 차이를 밝히기위한 화학적 활성화 및 전사 프로파일링을위한 RNA의 준비에 대해 논의 할 것입니다. 현재의 프로토콜에서, 화학적 활성화는 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) 및 칼슘 이오노포어 (A23187)18,19를 사용하여 수행되었는데, 이는 이전 연구들이 CTCL에서 결함 있는 T 세포 수용체 신호전달을 보여주었고, PMA/A23187을 이용한 자극은 T-세포 수용체20,21을 우회하기 때문이다. 또한, PMA/A23187은 사이토카인 유전자 활성화에 필요한 핵 신호의 보다 직접적인 근위 활성화를 허용한다. 마지막으로, T 세포의 자극은 동적 변화가 부재하는 휴지 T 세포로부터 얻을 수 없었던 유전자 발현의 조절에 대한 추가적인 수준의 통찰력을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:706px;" width="706">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:269px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1000 ul Pipet tips</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10017-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">15 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">25 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">5 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">50 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">A23187 ionophore</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMSO</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650-5x5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit</td>
			<td style="width:151px;">StemCell</td>
			<td style="width:119px;">19157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FBS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HBSS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">P184-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-072-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:151px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">10378-23-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">phorbol12-myristate13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:151px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rneasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:151px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">T-25 Flask</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling

피부 T 세포 림프종 (CTCL)은 성숙한 피부 호밍 T 세포의 형질전환 및 조절되지 않은 증식으로부터 유래되며, 진균증 진균증 (MF) 및 세자리 증후군 (SS)은 가장 흔한 아류형을 나타낸다. CTCL의 유전자 발현, 유전 적 변화 및 후성 유전 적 이상을 특성화하기위한 많은 연구에도 불구하고 MF / SS의 분자 병인은 불분명하다. MF는 피부 우세를 가진 더 일반적인 CTCL을 말하며, 일반적으로 피부로 제한되는 반면, SS는 광범위한 피부 관여를 가진 CTCL의 공격적인 백혈병 변종이며 주로 혈액, 피부 및 림프절과 관련된 신생물 분포를 특징으로합니다. 임상 실습에 초점을 맞추고, 유전자 발현 바이오마커의 확인은 MF / SS의 진단 및 치료를 향상시킬 수있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 실제로, 최근의 전사 연구는 SS 생물학에 대한 우리의 이해를 향상시키고 잠재적 인 치료 표적을 밝힐 수있는 정상 및 악성 T 세포 사이의 유전자 발현의 차이로부터 잠재적 인 진단 바이오마커를 확인했다. 이 원고는 SS로 진단된 환자로부터 신선한 전혈로부터 말초 혈액 단핵 세포를 분리하기 위한 상세한 재현 가능한 프로토콜, CD4+ 기억 T 세포(CD4+CD45RO+ T 세포)의 선택, 화학적 자극 및 전사 프로파일링에 적합한 RNA의 제조를 기술하여 질병 병인학에 대한 추가적인 통찰력을 얻기 위한 새로운 예후 분자 마커를 발견한다. 핵 조절을 활성화하기 위해 화학적 작용제를 사용하는 자극은 동적 전사 조절 및 유전자 발현에 중요한 경로에 대한보다 구체적인 평가를 제공하고 세포막에서의 TCR 항원 손실로 인해 발생하는 상류 신호 전달 결함으로 인해 발생할 수있는 혼란스러운 결함을 제거합니다. 자극되지 않은 SS T 세포에 대한 자극되지 않은 전사체의 비교로부터 수득된 데이터는 정지된 자극되지 않은 세포의 분석으로부터 명백하지 않은 기능적 조절 유전자 발현 결함을 마스크한다. 더욱이, 이러한 접근법으로부터 개괄된 방법은 다른 T 세포 면역 질환에서 T 세포 유전자 발현 결함을 연구하기 위해 적응될 수 있다.

이 프로토콜은 SS 혈액으로부터 PBMC의 단리, 음성 선택에 의한 CD4+CD45RO+ T 세포의 정제, 정제된 T 세포의 자극, 전사체 프로파일링을 위한 총 RNA의 단리를 위한 절차를 포함한다. 도 1은 전혈로부터 PBMC를 분리하는 과정을 설명한다. SS PBMC의 총 수율은 각 환자의 혈액량 및 순환 종양 부담에 따라 달라질 수 있습니다. 우리 실험실에서 SS PBMC의 평균 수율은 전혈의 10 6 세포 / mL× 4.6 (1.85 × 106 - 3.25 x 10 7 세포 / mL7 SS). 분리된 PBMC의 평균 생존율은 95\u201299%였다. 도 2는 선택된 CD4+CD45RO+ 기억 T 세포의 고순도 및 생존력을 나타낸다. SS PBMCs로부터의 CD4+CD45RO+ T 세포의 평균 수율은 75%(75.6% – 84%)였으며, 이는 백혈구 환원 시스템(LRS) 챔버로부터 얻은 정상 공여자(ND) PBMC의 15.9%(3% – 30%)와 비교된다. 이러한 음성 선택 프로토콜에 의해 수득된 CD4+CD45RO+ T 세포의 생존력 및 순도는 지속적으로 높았다(도 3).
우리는 이전에 SS 및 ND T 세포 모두의 전사체의 기능적 변화를 연구하기 위해 위의 활성화 프로토콜을 마이크로어레이와 결합했으며, SS 기억 T 세포 및 SS PBMC가 ND T 세포 및 PBMCs19,22,23에 비해 사이토카인 및 기타 면역 반응 유전자를 제대로 발현하지 못한다는 것을 입증했습니다. 도 4는 SS T 세포에서는 그렇지 않지만 ND T 세포에서 IL4, IL 10, IL13 및 IL22를 포함하는 몇몇 사이토카인 유전자의 강력한 활성화를 보여준다. SS T 세포에서 기능적 유전자 발현의 이러한 결함은 이후 다른 그룹24에 의해 확인되었다. 또한, ND T 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 많은 유전자는 휴식 및 자극 후 둘 다에서 SS T 세포에서 고도로 발현된다 (도 4). 이들은 이전에 기술된 SS 바이오마커 유전자 DNM3, PLS3, TOX 및 TWIST125,26,27 뿐만 아니라 ANK1 및 SGCE를 포함하며, 이는 우리 그룹에 의해 처음 보고되었다. 이들 양성 바이오마커는 SS에서 고도로 발현되지만, ND에서는 발현되지 않으며, 음성 바이오마커와 관련된 기술적 함정을 피한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2.jpg"> 그림 1: 전혈로부터의 PBMC 분리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig2.jpg"> 도 2: 분리된 PBMC로부터의 CD4+ 메모리 T 세포의 음성 선택. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig3.jpg"> 도 3: CD4+CD45RO+ T 세포의 순도는 유세포 분석기로 확인하였다. 림프구는 광 산란 (A), 살아있는 림프구 배제 eFluor780 생존력 염료 (B), 및 (C)는 선택되지 않은 정상 공여자 (ND)에 의해 게이팅되었다. 음성 선택은 ND (D) 및 SS 환자 (E)에서 CD45RO+ T 세포의 거의 순수한 집단을 초래했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig4.jpg"> 도 4: SS 및 ND로부터의 휴지 및 활성화된 CD4+CD45RO+ 기억 T 세포에서의 차등 유전자 발현. 유전자 발현 z-스코어는 적색(고발현)에서 녹색(저발현)까지의 색 척도로 표시된다. 히트 맵 상단의 컬러 바는 세포 처리를 나타냅니다 : 모의 / 차량 처리 (빨간색), 2 시간 자극 (파란색) 및 6 시간 자극 (노란색). 몇몇 SS 바이오마커 유전자는 고도로 발현되고 사이토카인 유전자는 ND T 세포에 비해 SS T 세포에서 저조하게 발현된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>시약</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>밀도 매체</td>
			<td>림프구 분리 배지, Ficoll-Hypaque 또는 20oC에서 밀도 = 1.077-1.080g / ml의 등가 밀도 배지.</td>
		</tr>
<tr>
<td>증권 시세 표시기</td>
			<td>행크의 균형 잡힌 소금 용액 1개, 4.2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>롤플레포10F</td>
			<td>RPMI 1640 배지, 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린-스트렙토마이신 용액, pH 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACK 용해 완충액</td>
			<td>155 mMNH4Cl, 10 mMKHCO3, 0.1 mMNa2EDTA, pH를 조정할 필요가 없다. ~ 7.3이어야합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>선택 버퍼</td>
			<td>HBSS 1개, FBS 2%, 2mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>포볼12-미리스테이트13-아세테이트 (PMA)</td>
			<td>DMSO에 50 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A23187 이오노포어</td>
			<td>DMSO 500 μg/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 시약.

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Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

우리는 세자리 증후군으로 진단 된 환자로부터 얻은 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포를 분리하기위한 간단한 프로토콜을 제시하고, CD4 + T 세포의 선택, phorbol12-myristate13-acetate 및 A23187 ionophore로 자극, 전사 프로파일 링을위한 RNA 준비.

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

이 프로토콜은 우리가 연구를 위해 질병, 분자 결함 및 면역 학적 결함이있는 환자로부터 림프구 T 세포를 분리 할 수있는 능력을 허용합니다. 이 방법을 사용하면 생존 가능한 세포, RNA, DNA 및 단백질을 이러한 환자로부터 정제하기위한 질병 이상을 가진 세포를 분리 할 수 있으며 분자 결함을 특성화하여 병인에 중요한 경로 이상을 이해할 수 있습니다. 이 방법은 정상 상태의 혈액 세포뿐만 아니라 면역 이상이있는 질병으로부터 혈액 세포를 연구하기 위해 추가로 분획 될 수있는 말초 혈액의 분리에 유용합니다.이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 의대생 연구원 인 Alanna가 될 것입니다. 항응고제가 들어있는 5 밀리리터 튜브에서 말초 혈액 샘플을 얻은 후, 10 ~ 15 밀리리터의 혈액을 피험자 번호로 표시된 50 밀리리터 분리 튜브로 옮기고 샘플을 적어도 두 배로 희석하지만 HBSS로 튜브 당 35 밀리리터 이하로 희석하십시오. 튜브 당 약 13 밀리리터의 밀도 매체로 조심스럽게 천천히 혈액을 밑에 깔고 피펫이 거의 비어있을 때 피펫팅을 멈추어 거품을 방지하십시오.피펫을 천천히 제거하여 혈액과 밀도가 높은 매질층이 혼합되지 않도록 하고 채워진 분리관을 층을 방해하지 않고 원심분리기로 조심스럽게 옮깁니다. 원심분리에 의해 세포를 분리한 후, 상층을 함유하는 플라즈마의 마지막 10 밀리리터를 제외한 모든 것을 제거한 후, 조심스럽게 그리고 천천히 버피 코트를 수집하였다. 두 개의 분리 튜브 사이에서 버피 코트를 단일 라벨이 붙은 멸균 50 밀리리터 튜브에 풀링하고 신선한 HBSS로 PBMC를 튜브 당 총 50 밀리리터로 적어도 두 배 희석하십시오.모든 버피 코트가 수집되었을 때, 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고 각 튜브로부터 가능한 한 많은 상청액을 제거한다. 튜브 바닥을 탭하여 펠렛을 느슨하게하고 튜브 당 원래 10 밀리리터 혈액 샘플 부피 당 1 ~ 두 밀리리터의 ACK 용해 버퍼에 펠렛을 재현탁하십시오. 정확히 5 분 후, HBSS의 동일하거나 더 큰 부피로 각 튜브에서 용해를 중단하고 각 부피를 50 밀리리터로 조정하십시오.원심분리 후, 상층액을 버리고, 동일한 공여체로부터 세포를 풀링하고, 또 다른 원심분리를 위해 신선한 HBSS로 최대 50 밀리리터의 부피를 가져온다. 그런 다음 세포를 계수를 위해 섭씨 37도 RP 10F 배지 10밀리리터에 재현탁시킨다. CD4+CD45RO+T 세포 정제를 위해, 세포를 스핀다운하고 PBMC를 선택 완충액 농도의 밀리리터당 7번째 세포에 5배 10배로 희석한다.세포를 5 밀리리터의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮기고 부드러운 혼합으로 샘플 한 밀리리터 당 50 마이크로 리터의 항체 칵테일을 첨가하십시오. 실온에서 5 분 후, 30 초 동안 고속으로 자성 입자를 와류시킨 다음 샘플 한 밀리리터 당 50 마이크로 리터의 자성 입자를 부드럽게 혼합하여 튜브에 첨가합니다. 신선한 선택 버퍼와 부드러운 혼합으로 부피를 2.5 밀리리터로 가져 와서 튜브를 자석에 2.5 분 동안 놓습니다.인큐베이션이 끝나면 자석을 집어 들고 튜브를 하나의 연속 운동으로 반전시켜 농축 된 세포 현탁액을 새로운 멸균 튜브로 데컨팅하십시오. 세포 회수율을 높이려면 고정화된 비드를 방해하지 않고 튜브에 2.5밀리리터의 선택 버퍼를 넣고 자석 상에서 2.5분간 추가로 배양한 다음 세척 튜브에 세척한 다음 혈구분석기를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계수하고 유세포 분석기로 세포 순도를 확인합니다. 세포를 활성화시키려면, CD4+CD45RO+T 세포를 섭씨 37도 RP 10F 배지 농도의 밀리리터당 6배 10배 세포로 조정하고 적절한 크기의 배양 접시에 세포를 시드한다.세포를 가습 된 섭씨 37도, 5 % 이산화탄소 배양기에서 하룻밤 동안 쉬게하십시오. 다음날 아침, 원심분리에 의해 휴지된 세포를 수집하고, 펠렛을 섭씨 37도 RP 10F 배지 농도의 밀리리터당 여섯 번째 세포에 5회 10 내지 5회 재현탁시켰다. 현탁액을 세 개의 멸균 스크류 캡 튜브 각각에서 여섯 번째 세포 분취량을 10 내지 5 내지 10배로 분할하고, PMA로 튜브 2 및 튜브 3에서 세포를 A23187과 부드럽게 혼합하여 자극한다.첫 번째 튜브에 동일한 부피의 디메틸 설폭사이드를 추가하여 차량 제어 역할을 수행하고 캡이 느슨한 튜브를 적절한 활성화 기간 동안 인큐베이터에 배치하십시오. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 버립니다. 그런 다음 상업적으로 이용 가능한 RNA 분리 키트의 지시에 따라 세포를 용해시키고 제조자의 지시에 따라 RNA를 분리하십시오.이 음성 선택 프로토콜에 의해 얻어진 CD4+CD45RO+T 세포의 생존력 및 순도는 지속적으로 높다. SS PBMCs로부터 백혈구 환원 시스템 챔버로부터 수득된 CD4+CD45RO+T 세포의 수율은 정상 공여자 PBMCs로부터의 약 16%에 비해 전형적으로 약 75%이다. SS 기억 T-세포 및 SS PBMCs는 정상 공여자 T 세포 및 PBMC로부터의 세포와 비교하여 저조하게 발현된 사이토카인 및 다른 면역 반응 유전자이다.또한, 정상 공여자 T 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 많은 유전자는 휴식 및 자극 후 둘 다에서 SS T 세포에서 고도로 발현된다. 좋은 멸균 기술과 일관된 루틴은이 기술의 성공을 위해 정말로 중요합니다. 또한 Ficoll을 레이어링하는 동안 미세 제어 기능이 있는 자동 피펫을 사용하고 Ficoll을 내려놓는 속도에 주의를 기울이는 것도 정말 중요합니다.이 방법을 사용하여 분리된 세포는 생존 가능하며 독성 연구, 신호 전달 경로의 특성화를 위한 분자 생화학적 연구, 유세포 분석 및 유전자 발현 연구에 사용될 수 있다. 이 방법은 질병을 앓고있는 환자, 염증성 질환 및 직접 연구를 위해 암과 같은 다른 질병으로부터 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이들 질환의 예는 건선 및 아토피성 피부염을 포함한다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

연구

암 연구학

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li Fraumeni 증후군 환자에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 다리를 모델링

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

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