Name: isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling
Uploaded: 2021-10-14T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÂ©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling at JoVE.com

Agradecemos aos pacientes e voluntários que participaram da nossa pesquisa.

Células humanas são potencialmente infecciosas. Portanto, os experimentos são realizados estritamente de acordo com as precauções e procedimentos necessários discutidos como administração de segurança e saúde ocupacional (OSHA) e equipamentos de proteção individual (EPI).
1. Isolamento de PBMCs de sangue inteiro
<ol><li>Colete todos os materiais necessários da Tabela 1 e leve-os à temperatura ambiente (RT). Quente RP10F a 37 °C. Ajuste a centrífuga para RT. Com exceção de centrífugas e contagem de células, execute todas as etapas usando células viáveis em um gabinete de segurança biológica.</li>
	<li>Obtenha sangue em cinco tubos de 10 mL (quantidade desejada) contendo anticoagulante. Armazene o sangue inteiro à temperatura ambiente (18\u201224 °C). Rotular tubos de separação de 50 mL com o número do sujeito da pesquisa humana para que a amostra de sangue seja processada.</li>
	<li>Transfira 10\u201215 mL de sangue em cada tubo de separação(s) com o número do sujeito correspondente. Diluir o sangue pelo menos 2 vezes com a solução de sal balanceada de Hank (HBSS). Não exceda 35 mL de sangue diluído por tubo.</li>
	<li>Cuidadosamente e lentamente suba o sangue com ~13 mL de média de densidade. Observe através do meio de densidade transparente na parte inferior do tubo, e pare de pipetar quando a pipeta estiver quase vazia (para evitar a liberação da bolha). Remova cuidadosamente a pipeta para evitar misturar o sangue e as camadas médias de densidade.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente os tubos de separação preenchidos para a centrífuga sem perturbar as camadas.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g por 30 min com o freio centrífuga desligado (desaceleração definida para zero). NOTA: Se a centrífuga exibir apenas rpm, consulte as especificações do rotor para estimar o equivalente a rpm para 500 x g.</li>
	<li>Remova cuidadosamente os tubos de separação da centrífuga sem perturbar as camadas. Observe a camada buffy, que foi formada entre as camadas médias de densidade e plasma.</li>
	<li>Pipeta de cima para remover e descartar a maior parte da fração de plasma superior, de modo que 10 mL permanece acima do casaco buffy. Coleça com cuidado e lentamente o casaco de buffy. Transfira os casacos buffy de dois tubos de separação para um novo tubo pré-rotulado e estéril de 50 mL, como mostrado na Figura 1.</li>
	<li>Diluir os PBMCs pelo menos 2 vezes com HBSS, trazendo o volume em cada novo tubo até 50 mL. Lembre-se de trocar o freio da centrífuga para cheio. PbMCs de pelota por centrifugação a 400 x g por 10 min. Remova o supernatante o máximo possível e bata na parte inferior do tubo para soltar a pelota.</li>
	<li>Para lise, os glóbulos vermelhos residuais (RBC) resuspenquem cada pelota de célula em 1\u20122 mL de tampão de lise de amônio-cloreto-potássio (ACK) por 10 mL de volume sanguíneo original. Incubar por exatamente 5 minutos. Pare prontamente a lise com um volume igual ou maior de HBSS e ajuste o volume para 50 mL. Centrifugar a 400 x g por 10 min.</li>
	<li>Remova o sobrenatante e toque na parte inferior do tubo para soltar a pelota celular. Células da piscina do mesmo doador. Traga volume de até 50 mL com HBSS. Centrifugar a 400 x g por 10 min.</li>
	<li>Remova o sobrenatante e toque na parte inferior do tubo para soltar a pelota celular. Resuspend células em 10 mL de meio RP10F quente, e tome uma alíquota para contagem de células viáveis usando azul trypan.</li>
	<li>Calcule o número total de células em cada amostra usando um hemótmetro.</li>
</ol>2. Purificação de células T CD4+CD45RO+ de PBMCs
NOTA: A purificação das células T CD4+CD45RO+ dos PBMCs é feita usando separação magnética comercialmente disponível (ver Tabela de materiais) com pequenas modificações. É preferível seguir o manual do kit para o tempo de incubação, pois cada kit comercial tem suas próprias instruções.
<ol><li>Lave a quantidade desejada de PBMCs em 10 mL de buffer de seleção. Centrifugar a 400 x g por 10 min. Remova o sobrenatante e bata na parte inferior do tubo para soltar a pelota.</li>
	<li>Diluir PBMCs para 5 x 107 células/mL no buffer de seleção e transferi-los para um tubo de fundo redondo de poliestireno (12 x 75 mm).</li>
	<li>Adicione 50 μL de coquetel de anticorpos por 1 mL de amostra e misture delicadamente. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.</li>
	<li>Imediatamente antes do uso, partículas magnéticas de vórtice por 30 segundos em alta velocidade. Adicione 50 μL de partículas magnéticas por 1 mL de amostra ao tubo contendo PBMCs e misture suavemente.</li>
	<li>Leve o volume até 2,5 mL com tampão de seleção e misture delicadamente. Coloque o tubo (sem tampa) no ímã e incubar na RT por 2,5 min.</li>
	<li>Pegue o ímã e, em movimento contínuo, inverta o ímã e o tubo para despejar a suspensão celular enriquecida em um novo tubo estéril.</li>
	<li>Para aumentar a recuperação, adicione 2,5 mL de tampão de seleção ao tubo restante no ímã, sem perturbar as contas imobilizadas. Mantenha no ímã por mais 2,5 min e repita o passo 2.6 para recuperar células adicionais.</li>
	<li>Tome uma alíquota para contagem de células viáveis usando azul trypan. Calcule o número total da célula usando um hemocitômetro ou contador celular.</li>
	<li>Confirme a pureza por citometria de fluxo (Figura 3).</li>
</ol>3. Ativação química
<ol><li>Ajuste as células T CD4+CD45RO+ para 5 x 106 células/mL com meio RP10F quente e distribua células em pratos de cultura do tamanho desejado. Células de descanso em uma incubadora umidificada de 37 °C 5% DE CO2 durante a noite.</li>
	<li>Células de pelota descansadas por centrifugação a 400 x g por 10 min. Remova o sobrenatante e toque na parte inferior do tubo para soltar a pelota celular.</li>
	<li>Ajuste a concentração celular para 5 x 106 células/mL com meio RP10F quente e distribua células 0,5\u20121 x 107 em cada uma das três estéreis tubos de tampa de parafuso. NOTA: Se houver células suficientes disponíveis, estimulações duplicadas ou pontos de tempo adicionais podem ser incluídos no projeto experimental.</li>
	<li>Estimule as células nos tubos 2 e 3 com PMA e A23187. Adicione PMA a 25 ng/mL e A23187 a 500 ng/mL e misture suavemente. Adicione um volume igual de sulfóxido de dimetil (DMSO) às células do tubo 1 que servirão como veículo (controle). Por exemplo, se usar 1 μL de PMA e 1 μL de A23187, em seguida, adicione 2 μL de DMSO ao tubo do veículo. Mantenha a concentração final de DMSO abaixo de 0,5% em todos os tubos.</li>
	<li>Solte as tampas dos tubos e retorne as células para a incubadora de 37 °C 5% DE CO2 por 2 h (tubo 2) e 6 h (tubos 1 e 3). No horário indicado, células centrífugas a 500 x g por 10 min.</li>
	<li>Antes da lise, descarte o máximo possível do sobrenante, sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Prontamente, lise as células, conforme orientado por instruções do kit de isolamento RNA comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Proceda com o isolamento do RNA ou congele o lise a -80 °C para processar posteriormente com amostras adicionais. NOTA: A pureza e integridade do RNA podem ser verificadas usando eletroforese microcapillary.</li>
	<li>Opcional: Para remover completamente todos os traços de DNA da amostra purificada de RNA, use o kit de limpeza de RNA (ver Tabela de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+and+therapy+of+cutaneous+T+cell+lymphoma.">Immunopathogenesis and therapy of cutaneous T cell lymphoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 798-812 (2005).</li><li>Wong, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+Insights+in+the+Pathogenesis+and+Therapy+of+Cutaneous+T-cell+lymphoma+(Mycosis+Fungoides+and+Sezary+Syndrome).">Evolving Insights in the Pathogenesis and Therapy of Cutaneous T-cell lymphoma (Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome).</a> British Journal of Haematology. 155 (2), 150-166 (2011).</li><li>Whittaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+insights+into+the+pathogenesis+of+cutaneous+T-cell+lymphomas+(CTCL).">Biological insights into the pathogenesis of cutaneous T-cell lymphomas (CTCL).</a> Seminars in oncology. 33 (3), 3-6 (2006).</li><li>Kallinich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+expression+on+neoplastic+and+reactive+T+cells+in+the+skin+at+different+stages+of+Mucosis+Fungoides.">Chemokine receptor expression on neoplastic and reactive T cells in the skin at different stages of Mucosis Fungoides.</a> Journal of Investigative Dermatology. 121 (5), 1045-1052 (2003).</li><li>Rodd, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+Emerging+Therapeutics+for+Cutaneous+T-Cell+Lymphoma:+Histone+Deacetylase+Inhibitors.">Current and Emerging Therapeutics for Cutaneous T-Cell Lymphoma: Histone Deacetylase Inhibitors.</a> Lymphoma. 2012, 1-10 (2012).</li><li>Olsen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisions+to+the+staging+and+classification+of+mycosis+fungoides+and+Sezary+syndrome:+a+proposal+of+the+International+Society+for+Cutaneous+Lymphomas+(ISCL)+and+the+cutaneous+lymphoma+task+force+of+the+European+Organization+of+Research+and+Treatment+of+Cancer+(EORTC).">Revisions to the staging and classification of mycosis fungoides and Sezary syndrome: a proposal of the International Society for Cutaneous Lymphomas (ISCL) and the cutaneous lymphoma task force of the European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC).</a> Blood. 110, 1713-1722 (2007).</li><li>Hameetman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPHA4+is+overexpressed+but+not+functionally+active+in+S&#233;zary+syndrome.">EPHA4 is overexpressed but not functionally active in S&#233;zary syndrome.</a> Oncotarget. 6 (31), 31868-31876 (2015).</li><li>Willemze, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO-EORTC+classification+for+cutaneous+lymphomas.">WHO-EORTC classification for cutaneous lymphomas.</a> Blood. 105, 3768-3785 (2005).</li><li>Bradford, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+lymphoma+incidence+patterns+in+the+United+States:+a+population-based+study+of+3884+cases.">Cutaneous lymphoma incidence patterns in the United States: a population-based study of 3884 cases.</a> Blood. 113, 5064-5073 (2009).</li><li>Wilson, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age,+race,+sex,+stage,+and+incidence+of+cutaneous+lymphoma.">Age, race, sex, stage, and incidence of cutaneous lymphoma.</a> Clinical Lymphoma Myeloma and Leukemia. 12, 291-296 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+cutaneous+T+cell+lymphoma:+new+and+emerging+targets+and+treatment+options.">Management of cutaneous T cell lymphoma: new and emerging targets and treatment options.</a> Cancer Management and Research. 4, 75-89 (2012).</li><li>Korgavkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+incidence+trends+of+cutaneous+T-cell+lymphoma.">Changing incidence trends of cutaneous T-cell lymphoma.</a> Jama Dertmatology. 149 (11), 1295-1299 (2013).</li><li>Dulmage, B. O., Geskin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+gene+expression+profiling+of+cutaneous+T-cell+lymphoma.">Lessons learned from gene expression profiling of cutaneous T-cell lymphoma.</a> British Journal of Dermatology. 169 (6), 1188-1197 (2013).</li><li>Boonk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Immunophenotypic+and+Molecular+Biomarkers+for+S&#233;zary+Syndrome+Using+Standard+Operating+Procedures:+A+Multicenter+Study+of+59+Patients.">Evaluation of Immunophenotypic and Molecular Biomarkers for S&#233;zary Syndrome Using Standard Operating Procedures: A Multicenter Study of 59 Patients.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (7), 1364-1372 (2016).</li><li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+Lymphoma+International+Consortium+Study+of+Outcome+in+Advanced+Stages+of+Mycosis+Fungoides+and+S&#233;zary+Syndrome:+Effect+of+Specific+Prognostic+Markers+on+Survival+and+Development+of+a+Prognostic+Model.">Cutaneous Lymphoma International Consortium Study of Outcome in Advanced Stages of Mycosis Fungoides and S&#233;zary Syndrome: Effect of Specific Prognostic Markers on Survival and Development of a Prognostic Model.</a> Journal of Clinical Oncology. 10 (33), 3766-3773 (2015).</li><li>Benoit, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD164+identifies+CD4++T+cells+highly+expressing+genes+associated+with+malignancy+in+S&#233;zary+syndrome:+the+S&#233;zary+signature+genes,+FCRL3,+Tox,+and+miR-214.">CD164 identifies CD4+ T cells highly expressing genes associated with malignancy in S&#233;zary syndrome: the S&#233;zary signature genes, FCRL3, Tox, and miR-214.</a> Archives of Dermatological Research. 309, 11-19 (2017).</li><li>Dulmage, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarker+landscape+in+mycosis+fungoides+and+S&#233;zary+syndrome.">The biomarker landscape in mycosis fungoides and S&#233;zary syndrome.</a> Experimental Dermatology. 26 (8), 668-676 (2017).</li><li>Pick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mediation+of+Lymphokine+Action:+Mimicry+of+Migration+Inhibitory+Factor+(MIF)+Action+by+Phorbol+Myristate+Acetate+(PMA)+and+the+Ionophore+A23187.">Intracellular Mediation of Lymphokine Action: Mimicry of Migration Inhibitory Factor (MIF) Action by Phorbol Myristate Acetate (PMA) and the Ionophore A23187.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 94 (332), 378-394 (1979).</li><li>Chong, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+S&#233;zary+syndrome+PBMCs+poorly+express+immune+response+genes+up-regulated+in+stimulated+memory+T+cells.">Induced S&#233;zary syndrome PBMCs poorly express immune response genes up-regulated in stimulated memory T cells.</a> Journal of Dermatological Science. 60 (1), 8-20 (2010).</li><li>Fargnoli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+TCR+signaling+in+cutaneous+T+cell+lymphoma+is+associated+with+decreased+activities+of+Zap70,+Syk+and+membrane-associated+Csk.">Diminished TCR signaling in cutaneous T cell lymphoma is associated with decreased activities of Zap70, Syk and membrane-associated Csk.</a> Leukemia. 11, 1338-1346 (1997).</li><li>Hansen, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemic+T+cells+from+patients+with+cutaneous+T-cell+lymphoma+demonstrate+enhanced+activation+through+CDw60,+CD2,+and+CD28+relative+to+activation+through+the+T-cell+antigen+receptor+complex.">Leukemic T cells from patients with cutaneous T-cell lymphoma demonstrate enhanced activation through CDw60, CD2, and CD28 relative to activation through the T-cell antigen receptor complex.</a> Journal of Investigative Dermatology. , 667-673 (1993).</li><li>Chong, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Function+Abnormalities+in+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cell+Cytokine+Expression+Differentiates+Stages+of+Cutaneous+T-Cell+Lymphoma/Mycosis+Fungoides.">Immune Function Abnormalities in Peripheral Blood Mononuclear Cell Cytokine Expression Differentiates Stages of Cutaneous T-Cell Lymphoma/Mycosis Fungoides.</a> Clinical Cancer Research. 14 (3), 646-653 (2008).</li><li>Moerman-Herzog, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+S&#233;zary+syndrome+and+lymphocytic-variant+hypereosinophilic+syndrome+T+cells+reveals+common+and+divergent+genes.">Transcriptome analysis of S&#233;zary syndrome and lymphocytic-variant hypereosinophilic syndrome T cells reveals common and divergent genes.</a> Oncotarget. 10, 5052-5069 (2019).</li><li>Fanok, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dysregulated+Cytokine+Signaling+and+Bacterial+Triggers+in+the+Pathogenesis+of+Cutaneous+T-Cell+Lymphoma.">Role of Dysregulated Cytokine Signaling and Bacterial Triggers in the Pathogenesis of Cutaneous T-Cell Lymphoma.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138, 1116-1125 (2018).</li><li>Su, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+expression+of+T-plastin+in+Sezary+cells.">Aberrant expression of T-plastin in Sezary cells.</a> Cancer Research. 63, 7122-7127 (2003).</li><li>van Doorn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+expression+of+the+tyrosine+kinase+receptor+EphA4+and+the+transcription+factor+twist+in+Sezary+syndrome+identified+by+gene+expression+analysis.">Aberrant expression of the tyrosine kinase receptor EphA4 and the transcription factor twist in Sezary syndrome identified by gene expression analysis.</a> Cancer Research. 64, 5578-5586 (2004).</li><li>Booken, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sezary+syndrome+is+a+unique+cutaneous+T-cell+lymphoma+as+identified+by+an+expanded+gene+signature+including+diagnostic+marker+molecules+CDO1+and+DNM3.">Sezary syndrome is a unique cutaneous T-cell lymphoma as identified by an expanded gene signature including diagnostic marker molecules CDO1 and DNM3.</a> Leukemia. 22, 393-399 (2008).</li><li>Dagur, P. K., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+,+storage,+and+preparation+of+human+blood+cells.">Collection , storage, and preparation of human blood cells.</a> Current Protocol Cytometry. 73, 1-16 (2016).</li><li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Circulating+CD4++Memory+T-cell+Subsets+in+Erythrodermic+Patients:+CD27+Analysis+Can+Help+to+Distinguish+Cutaneous+T-cell+Lymphomas+From+Inflammatory+Erythroderma.">Heterogeneity of Circulating CD4+ Memory T-cell Subsets in Erythrodermic Patients: CD27 Analysis Can Help to Distinguish Cutaneous T-cell Lymphomas From Inflammatory Erythroderma.</a> Dermatology. 216 (3), 213-221 (2008).</li><li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S&#233;zary+syndrome+and+mycosis+fungoides+arise+from+distinct+T-cell+subsets:+a+biologic+rationale+for+their+distinct+clinical+behaviors.">S&#233;zary syndrome and mycosis fungoides arise from distinct T-cell subsets: a biologic rationale for their distinct clinical behaviors.</a> Blood. 116 (5), 767-771 (2010).</li><li>Roelens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+and+skin-derived+Sezary+cells:+clonal+but+with+phenotypic+plasticity.">Circulating and skin-derived Sezary cells: clonal but with phenotypic plasticity.</a> Blood. 130 (12), 1468-1471 (2017).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+expression+programs+and+the+integration+of+the+CD28+costimulatory+signal+in+T+cell+activation.">Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11796-11801 (2002).</li><li>Fuji, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+therapies+and+immunological+findings+in+cutaneous+T-cell+lymphoma.">New therapies and immunological findings in cutaneous T-cell lymphoma.</a> Frontiers in Oncology. 8, 12-28 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.
Divulgação Ética: Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) da Universidade de Arkansas for Medical Sciences (UAMS, Little Rock, AR) Os dados de microarray apresentados neste estudo foram feitos nas amostras recrutadas sob um protocolo de pesquisa aprovado pelo IRB do Hospital Henry Ford (Detroit, MI).

Várias formas de isolar os PBMCs foram desenvolvidas, e cada uma tem suas próprias vantagens e limitações28. Coletamos rotineiramente até 50 mL de sangue em cinco tubos de 10 mL contendo anticoagulante. O volume do sangue para o isolamento do PBMC depende de diversos fatores, como saúde e idade do sujeito da pesquisa e também da expertise flebotomista. Uma etapa processual crítica no protocolo é a formação do gradiente de passo. A camada ruim pode resultar em falha parcial ou completa dos PBMCs nos sedimentos na interface. Preferimos o método de subcamagem descrito aqui, pois é fácil iniciar a camada inferior. Para dispensar completamente todo o meio de densidade abaixo do sangue, é fundamental usar um auxílio pipeta sem vazamentos de ar. A contaminação da fração PBMC por tipos de células indesejadas pode ser minimizada pela coleta cuidadosa e consistente da camada buffy, que deve ser realizada da mesma forma para cada isolamento. Se os PBMCs não serão ainda mais fracionados, a coleta de diferentes quantidades do gradiente de densidade e camadas plasmáticas entre os isolamentos deve ser evitada. A lise RBC é realizada para minimizar o impacto potencial da contaminação do RNA derivado de RBC e reticulocito nas análises de expressão genética a jusante. A hipotônica será inibida pelo excesso de tampão isotônico.
O isolamento adicional do subconjunto de células T é importante para estudos moleculares. Aqui descrevemos a seleção subsequente de células T CD4+CD45RO+ por seleção negativa para remover tipos de células indesejadas. A seleção negativa baseia-se em anticorpos que reconhecem marcadores de superfície celular específicos para todas as células indesejadas. As células revestidas de anticorpos são então removidas por contas magnéticas. Este protocolo de seleção remove células indesejadas, permitindo que células-alvo intocadas e não estimuladas permaneçam livres flutuantes, o que é essencial para estudar a ativação genética. No entanto, deve-se tomar cuidado para evitar aglomerados celulares, que reduzem a pureza final das células T CD4+ selecionadas. O ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) presente no tampão de seleção minimiza a aglomeração celular. O rendimento das células T depende de fatores como o volume inicial do sangue, variáveis do paciente, como o tratamento que está sendo administrado ao paciente e o estágio da doença no momento da coleta amostral. O tratamento dado aos pacientes também pode afetar a viabilidade celular. Além disso, a coleta de amostras antes de qualquer procedimento, como fotoferese, também tem impacto positivo na pureza das células CD4+CD45RO+ T. Observamos que a coleta de amostras após o procedimento de tratamento da fotoferese tem impacto negativo no rendimento das células T CD4+CD45RO+.
Clones de células T neoplásticas de pacientes com SS expressam mais frequentemente marcadores de superfície consistentes com um fenótipo de células CD4 T maduro29,30. No entanto, a plasticidade fenotípica tem sido ocasionalmente observada em relação aos marcadores de superfície, incluindo CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 e/ou CD2631. Estudos anteriores também mostraram a heterogeneidade na expressão CD45RO e CD45RA entre os pacientes da SS29, enquanto a maioria dos casos de SS ainda são CD45RO+. Roelens et al.31 também mostraram que a SS pode exibir heterogeneidade interindividual e intraindividual com população mista de ingenuidade (TN), memória central (TCM), memória transitória (TTM), memória effectora (TEM) e subconjuntos de memória efeito terminal (TEMRA). No entanto, seus resultados mostram claramente que a maioria das células SS tem fenótipo TCM. Focamos nosso estudo no imunofenótipo de superfície CD45RO+ mais comum em pacientes com SS, e confirmamos o fenótipo por citometria de fluxo. No planejamento de estudos de subconjuntos de células T em pacientes, é importante considerar a heterogeneidade fenotípica da doença que está sendo estudada, e a estratégia de purificação pode, portanto, ser ajustada conforme necessário para obter a população celular T desejada para análise.
Existem várias maneiras de estimular células T e PBMCs para examinar a expressão genética funcional. Preferimos ativação química (PMA + A23187 ionophore), pois estamos interessados na regulação genética no núcleo. A ativação química é a melhor opção para este fim, pois atua como um ativador amplo e é mais uniforme em comparação com a estimulação específica de antígeno. O PMA é um pequeno composto orgânico que se difunde através da membrana celular para o citoplasma, e ativa diretamente a proteína quinase C. A23187 permite que o cálcio passe através de membranas. Esses compostos contornam receptores superficiais, e juntos imitam os efeitos da ligação do receptor de células T com co-estimulação mediada por CD28. Os produtos químicos ativam várias vias de sinalização intracelulares, resultando em ativação do fator de transcrição nuclear e regulação de genes citocinas que são acessíveis à ativação da transcrição. Embora a ativação química e a ligadura CD3CD28 produzam perfis de expressão genética global surpreendentemente semelhantes em células normais32, a ativação química com PMA + A23187 é uma boa escolha, uma vez que as células SS T podem perder a expressão de receptores superficiais, incluindo componentes TCR33. Chong et al.22 compararam a ativação de genes citocinas entre os anticorpos PMA/A23187 a anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 em PBMCs de pacientes normais, precoces de MF/CTCL e pacientes com MF/CTCL tardios. Eles relataram que o PMA/A23187 causou uma ativação mais rápida e intensa do gene IL-2 em comparação com a estimulação anti-CD3/CD28. Além disso, eles mostraram que a cinética de ativação mais lenta com anticorpos anti-CD3/CD28 é potencialmente de ligação cruzada e sinalização de membrana necessária para estimulação. Além disso, as tendências de expressão das citocinas entre as diferentes populações celulares estudadas foram preservadas com PMA/A23187. Uma vez que estamos interessados na ativação da expressão genética, a estimulação química é uma abordagem ideal porque age como um ativador amplo e é mais consistente em comparação com a estimulação específica de antígeno. A ligadura CD3/CD28 é ideal para investigar caminhos importantes na transdução de sinal à base de membrana. Além disso, a ativação química é menos cara e não requer equipamentos especiais. No presente estudo, PMA + A23187 ativou significativamente genes de citocina em células ND, mas não SS T, sugerindo que as células SS T têm deficiências funcionais a jusante do TCR.
Em resumo, este protocolo fornece células T fenotipicamente puras a partir de sangue precioso derivado do paciente, e um método para avaliar mudanças em todo o genoma na expressão genética funcional. Demonstramos que o perfil transcriômico das células SS T em comparação com as células T CD45RO+ normais revelam profundas diferenças na ativação genética em células T humanas frescas de pacientes com CTCL. Esses estudos auxiliarão no desenvolvimento de biomarcadores diagnósticos e estratégias terapêuticas voltadas para novos marcadores na CTCL. Além disso, essa estratégia e protocolo no estudo das células T humanas primárias pode ser valioso na adaptação aos estudos de outras doenças mediadas por células T.

Linfoma cutâneo de células T (CTCL), incluindo os subtipos mais comuns mycosis fungoides (MF) e síndrome de Sézary (SS), é um grupo heterogêneo de doenças derivadas da transformação e proliferação descontrolada de células T maduras 1,2. As células T neoplásicas têm um CD4+CD45RO+maduro, fenotipode memória 3, e expressam marcadores de adesão à pele, aumentando o epidermotropismo4, que se manifesta como uma erupção cutânea particularmente em doenças precoces. O curso clínico de MF é muitas vezes indolente quando sob cuidados gerenciados de rotina, mas um subconjunto de pacientes pode progredir para uma doença mais avançada. Nestes casos de MF, as lesões cutâneas crescem e engrossam em tumores grandes, e as células T neoplásicas podem se disseminar para linfonodos e órgãos viscerais. Em contraste, SS é uma variante mais agressiva e leucêmica da CTCL5, caracterizada por uma tríade de sintomas: erithrodermia generalizada (definida como afetando >80% da área total da superfície corporal), linfadonopatia, e presença de mais de 1000/mm3 células T cancerígenas clonais com núcleos de céeblicas, as chamadas células Sézary 6,7 . O prognóstico para pacientes com SS é significativamente pior do que o MF. A SS é rara com uma taxa de incidência de 0,1/100.000, e representa aproximadamente 3% do total de casos de CCCL 8,9. A CTCL normalmente se apresenta em idosos com idade mediana de cerca de 60 anos10 anos. A taxa de incidência da CTCL vinha aumentando e, embora a causa não esteja clara, a taxa se estabilizou desde 199811,12.
A patogênese molecular da SS ainda não está clara. Estudos genéticos, epigenéticos e de expressão genética produziram uma riqueza de novos dados, porém permanecem achados inconsistentes, principalmente devido às pequenas coortes de pacientes estudadas2, bem como diferenças no design experimental e nas populaçõesde controle 13,14. Uma caracterização genômica e transcriômica melhorada pode lançar luz sobre mecanismos da doença e alvos terapêuticos inexplorados anteriormente. Portanto, mais estudos de uma população maior de pacientes são necessários para entender melhor essa malignidade heterogênea. Os painéis biomarcadores altamente sensíveis e específicos em uma coorte de SS têm tido desempenho menos uniforme em outras coortes15, o que representa um sério obstáculo no desenvolvimento de biomarcadores diagnósticos e prognósticos confiáveis para ss16. Os biomarcadores diagnósticos ideais serão consistentemente e altamente expressos em células T malignas, enquanto ausentes ou quase ausentes em células T normais17. A descoberta de biomarcadores específicos para doenças é importante para o avanço dos protocolos diagnósticos e terapêuticos para a SS.
Dados transcriômicos de alta qualidade para células T malignas e normais requer uma abordagem eficiente e confiável para a preparação da amostra. Aqui, discutiremos uma estratégia detalhada, mas simples, para obter amostras de RNA de populações de células T relevantes para as SS. Discutiremos o isolamento das células mononucleares sanguíneos periféricos (PBMC) do sangue inteiro, seleção magnética negativa de populações de células T CD4+CD45RO+ relevantes para doenças, ativação química para revelar diferenças nas respostas funcionais e preparação do RNA para perfil transcriômico. No protocolo atual, a ativação química tem sido realizada utilizando acetato de mico-contágio phorbol (PMA) e ionóforo de cálcio (A23187)18,19, pois estudos anteriores mostraram sinalização defeituosa do receptor de células T na CTCL, e a estimulação com PMA/A23187 contorna o receptor de células T20,21. Além disso, o PMA/A23187 permite uma ativação proximal mais direta dos sinais nucleares necessários para a ativação genética citocina. Finalmente, a estimulação das células T fornece um nível adicional de discernimento sobre a regulação da expressão genética que não poderia ser obtida a partir de células T em repouso onde a mudança dinâmica está ausente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:706px;" width="706">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:269px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1000 ul Pipet tips</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10017-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">15 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">25 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">5 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">50 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">A23187 ionophore</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMSO</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650-5x5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit</td>
			<td style="width:151px;">StemCell</td>
			<td style="width:119px;">19157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FBS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HBSS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">P184-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-072-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:151px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">10378-23-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">phorbol12-myristate13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:151px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rneasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:151px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">T-25 Flask</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling

Linfomas cutâneos de células T (CTCL) são derivados da transformação e proliferação descontrolada de células T maduras, e os fungoides de micose (MF) e a síndrome de Sézary (SS) representam os subtipos mais comuns. Apesar de uma série de estudos sobre a caracterização da expressão genética, alterações genéticas e anormalidades epigenéticas da TCS, a patogênese molecular de MF/SS permanece incerta. MF refere-se à CTCL mais comum com predominância da pele, e geralmente é limitada à pele, enquanto ss é uma variante leucêmica agressiva de CTCL com envolvimento generalizado da pele e é caracterizada pela distribuição neoplásica principalmente envolvendo sangue, pele e linfonodo. Com foco na prática clínica, a identificação de biomarcadores de expressão genética tem enorme potencial para melhorar o diagnóstico e o tratamento do MF/SS. De fato, estudos transcriômicos recentes identificaram potenciais biomarcadores diagnósticos a partir de diferenças na expressão genética entre células T normais e malignas, o que pode melhorar nossa compreensão da biologia das SS, e revelar potenciais alvos terapêuticos. Este manuscrito descreve um protocolo reprodutível detalhado para o isolamento de células mononucleares de sangue periféricos de sangue fresco de pacientes diagnosticados com SS, seleção de células T de memória CD4+CD45RO+), estimulação química e preparação de RNA adequado para perfil transcriômico para descobrir novos marcadores moleculares prognósticos para obter uma visão adicional sobre a etiologia da doença. A estimulação usando agonista químico para ativar a regulação nuclear fornece uma avaliação mais específica para caminhos importantes na regulação dinâmica da transcrição e expressão genética e elimina defeitos confusos que podem surgir de defeitos de sinalização a montante decorrentes da perda de antígeno TCR na membrana celular. Os dados obtidos a partir da comparação do transcriptome de células SS T não estimuladas para células SS T estimuladas desmascaram defeitos de expressão genética reguladora funcional não evidentes a partir da análise de células quiescentes não estimuladas. Além disso, o método descrito a partir dessa abordagem pode ser adaptado para estudar defeitos de expressão genética de células T em outras doenças imunológicas de células T.

Este protocolo inclui procedimentos para o isolamento de PBMCs do sangue SS, purificação de células T CD4+CD45RO+ por seleção negativa, estimulação de células T purificadas e isolamento do RNA total para perfil transcriômico. A Figura 1 descreve o processo de isolamento do PBMC de sangue inteiro. Observe que o rendimento total dos PBMCs de SS variará com o volume sanguíneo inicial e a carga tumoral circulante de cada paciente. Em nosso laboratório, o rendimento médio dos PBMCs SS foi de 4,6 × 106 células/mL de sangue inteiro (1,85 × 106 – 3,25 x 107 células/mL para 7 SS). A viabilidade média de PBMCs isolados foi de 95\u201299%. A Figura 2 mostra alta pureza e viabilidade das células T de memória CD4+CD45RO+ selecionadas. O rendimento médio das células T CD4+CD45RO+ de PBMCs SS foi de 75% (75,6% – 84%), em comparação com 15,9% (3% – 30%) de PBMCs de doadores normais (ND) obtidos a partir de câmaras do Sistema de Leucoreduction (LRS). A viabilidade e pureza das células T CD4+CD45RO+ obtidas por este protocolo de seleção negativa tem sido consistentemente alta (Figura 3).
Anteriormente, combinamos o protocolo de ativação acima com microarrays para estudar as mudanças funcionais nos transcritos das células SS e ND T, e demonstramos que as células T de memória SS e os PBMCs de SS expressam mal citocinas e outros genes de resposta imune em comparação com células ND T e PBMCs 19,22,23. A Figura 4 mostra a ativação robusta de vários genes de citocinas, incluindo IL4, IL 10, IL13 e IL22 em células ND T, mas não em células SS T. Este defeito na expressão genética funcional nas células SS T foi confirmado por outros grupos24. Além disso, muitos genes não normalmente expressos em células ND T são altamente expressos em células SS T, tanto em repouso quanto em estimulação seguinte (Figura 4). Estes incluem os genes biomarcadores SS descritos anteriormente DNM3, PLS3, TOX e TWIST1 25,26,27, bem como ANK1 e SGCE, que foram relatados pela primeira vez pelo nosso grupo. Esses biomarcadores positivos são altamente expressos em SS, mas não em ND, e evitam armadilhas técnicas associadas a biomarcadores negativos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2.jpg"> Figura 1: isolamento PBMC de sangue inteiro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig2.jpg"> Figura 2: Seleção negativa de células T de memória CD4+ de PBMCs isolados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig3.jpg"> Figura 3: A pureza das células CD4+CD45RO+ T foi confirmada por citometria de fluxo. Os linfócitos foram fechados por dispersão de luz (A), linfócitos vivos excluídos eFluor780 de diluição (B) e (C) representa doadores normais não selecionados (ND). A seleção negativa resultou em populações quase puras de células T CD45RO+ em pacientes com ND (D) e SS (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig4.jpg"> Figura 4: Expressão genética diferencial em repouso e ativação de células T de memória CD4+CD45RO+ de SS e ND. A expressão genética z-score é representada por uma escala de cores de vermelho (alta expressão) a verde (baixa expressão). As barras coloridas no topo do mapa de calor representam tratamentos celulares: simulação/veículo tratado (vermelho), 2h estimulado (azul) e 6h estimulado (amarelo). Vários genes biomarcadores SS são altamente expressos e os genes de citocina são mal expressos em células SS T em comparação com as células ND T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Reagentes</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio de Densidade</td>
			<td>Meio de separação linfócito, Ficoll-Hypaque, ou meio de densidade equivalente com densidade = 1,077-1,080g/ml a 20oC.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td>1x Solução de sal balanceada da Hank, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP10F</td>
			<td>RPMI 1640 médio, 10 % de soro bovino fetal inativado (FBS), 1x solução penicilina-estreptomicina, pH 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão de lise ACK</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Não há necessidade de ajustar pH. Deve ser ~ 7.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão de seleção</td>
			<td>1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>phorbol12-myristate13-acetato (PMA)</td>
			<td>50 μg/ml em DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>A23187 ionóforo</td>
			<td>500 μg/ml em DMSO</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Reagentes.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÂ©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling at JoVE.com

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Apresentamos um protocolo simples para o isolamento de células mononucleares de sangue periférico de sangue inteiro obtidos de pacientes diagnosticados com Síndrome de Sézary, seguido pela seleção de células T CD4+, sua estimulação com phorbol12-myristate13-acetato e ionóforo A23187, e preparação de RNA para perfil transcriômico.

Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Este protocolo nos permite a capacidade de isolar linfócitos células T de pacientes com a doença para estudos, o defeito molecular e defeito imunológico. Este método nos permite isolar células viáveis, células com anormalidades da doença para purificação de RNA, DNA e proteína desses pacientes e que nos permite caracterizar defeitos moleculares para entender anormalidades de caminhos que são importantes na patogênese. Este método é valioso para o isolamento do sangue periférico que pode ser ainda mais fracionado para estudar células sanguíneas em estados normais, bem como células sanguíneas de doenças com anormalidades imunológicas.Demonstrando este procedimento estará Alanna, que é pesquisadora de medicina do meu laboratório. Após obter uma amostra de sangue periférica em cinco tubos de 10 mililitros contendo anticoagulant, transfira de 10 a 15 mililitros de sangue em tubos de separação de 50 mililitros rotulados com o número do sujeito e diluir as amostras pelo menos duas vezes, mas para não mais do que 35 mililitros por tubo com HBSS. Cuidadosamente e lentamente suba o sangue com aproximadamente 13 mililitros de densidade média por tubo, parando a pipetação quando a pipeta está quase vazia para evitar bolhas.Remova a pipeta lentamente para evitar misturar as camadas médias de sangue e densidade e transfira cuidadosamente os tubos de separação preenchidos para a centrífuga sem perturbar as camadas. Depois de separar as células por centrifugação, remova todos, exceto os últimos 10 mililitros do plasma contendo camada superior, antes de coletar cuidadosamente e lentamente a camada buffy. Acumule a camada buffy entre dois tubos de separação em um único tubo de 50 mililitros e diluir o PBMC pelo menos duas vezes com HBSS fresco para um total de 50 mililitros por tubo.Quando todas as camadas de buffy tiverem sido coletadas, pelota as células por centrifugação e remova o máximo possível do supernatante de cada tubo. Bata no fundo do tubo para soltar a pelota e resuspenque as pelotas em um a dois mililitros de tampão de lise ACK por volume original de amostra de sangue de 10 mililitros por tubo. Após exatamente cinco minutos, pare a lise em cada tubo com um volume igual ou maior de HBSS e ajuste cada volume para 50 mililitros.Após a centrifugação, descarte o supernadante, acumule as células do mesmo doador e traga volume de até 50 mililitros com HBSS fresco para outra centrifugação. Em seguida, resuspende as células em 10 mililitros de 37 graus Celsius RP 10F médio para contagem. Para purificação de células CD4+CD45RO+T, gire as células e dilua o PBMC para cinco vezes 10 para a sétima célula por mililitro de concentração de buffer de seleção.Transfira as células para um tubo de poliestireno fundo redondo de cinco mililitros e adicione 50 microliters de coquetel de anticorpos por um mililitro de amostra com mistura suave. Após cinco minutos à temperatura ambiente, partículas magnéticas de vórtice em alta velocidade por 30 segundos antes de adicionar 50 microliters de partículas magnéticas por um mililitro de amostra ao tubo com mistura suave. Leve o volume para 2,5 mililitros com tampão de seleção fresco e mistura suave e coloque o tubo em um ímã por 2,5 minutos.No final da incubação, pegue o ímã e inverta o tubo em um movimento contínuo para decantar a suspensão celular enriquecida em um novo tubo estéril. Para aumentar a recuperação celular, adicione 2,5 mililitros de tampão de seleção ao tubo sem perturbar as contas imobilizadas para outra incubação de 2,5 minutos no ímã e adicione a lavagem ao tubo de coleta, em seguida, conte o número de células viáveis usando um hemócito e confirme a pureza celular por citometria de fluxo. Para ativar as células, ajuste as células CD4+CD45RO+T para cinco vezes 10 a sexta células por mililitro de 37 graus Celsius RP 10F de média concentração e semee as células em pratos de cultura de tamanho adequado.Coloque as células em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono durante a noite. Na manhã seguinte, colete as células descansadas por centrifugação e resuspense a pelota em cinco vezes 10 a sexta células por mililitro de 37 graus Celsius RP 10F de concentração média. Divida a suspensão em cinco a dez vezes 10 para a sexta célula aliquots em cada um dos três tubos de tampa de parafuso estéril e estimule as células no tubo dois com PMA e tubo três com A23187 e mistura suave.Adicione um volume igual de sulfóxido de dimetil ao primeiro tubo para servir como controle do veículo e coloque os tubos com as tampas soltas na incubadora para o período de ativação adequado. No final da incubação, colete as células por centrifugação e descarte o máximo possível do supernatante sem perturbar a pelota celular. Em seguida, lise as células como orientado por um kit de isolamento RNA comercialmente disponível e isole o RNA de acordo com as instruções do fabricante.A viabilidade e pureza das células CD4+CD45RO+T obtidas por este protocolo de seleção negativa é consistentemente alta. O rendimento de células CD4+CD45RO+T obtidas a partir de câmaras do sistema de leucoreduction de SS PBMCs é tipicamente de cerca de 75% em comparação com cerca de 16% de PBMCs de doadores normais. Células T de memória SS e SS PBMCs mal expressas citocinas e outros genes de resposta imune em comparação com células de células T e PBMCs doadores normais.Além disso, muitos genes normalmente não expressos em células T doadoras normais são altamente expressos em células T SS tanto em repouso quanto seguindo a estimulação. Uma boa técnica estéril e uma rotina consistente são realmente importantes para o sucesso desta técnica. Também é muito importante enquanto você está colocando o Ficoll que você usa uma pipeta automática com controle fino e você realmente presta atenção na velocidade que você está estabelecendo o Ficoll.As células isoladas usando este método serão viáveis e podem ser utilizadas para estudos de toxicidade, estudos bioquímicos moleculares para caracterização de vias de transdução de sinal, citometria de fluxo e estudos de expressão genética. O método pode ser utilizado para isolar células de pacientes com doença, para doenças inflamatórias, e também outras doenças, como cânceres para estudos diretos. Exemplos dessas doenças incluem psoríase e dermatite atópica.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Pesquisa do câncer

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Mapeando as Relações Estrutura-Função de Fatores de Transcrição Oncogênica Desordenados usando análise transcriômica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Expansão e enriquecimento de células T Gama-Delta (γδ) do produto humano aferido

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Engenharia de Mutações de Ganho de Função Heterozigotas Oncogênicas em Células-Tronco Hematopoiéticas Humanas e Progenitoras

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...