Name: isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling
Uploaded: 2021-10-14T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÂ©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling at JoVE.com

Agradecemos a los pacientes y voluntarios que participaron en nuestra investigación.

Las células humanas son potencialmente infecciosas. Por lo tanto, los experimentos se realizan estrictamente de acuerdo con las precauciones y procedimientos requeridos discutidos como administración de seguridad y salud ocupacional (OSHA) y equipo de protección personal (PPE).
1. Aislamiento de PBMC de sangre total
<ol><li>Recoja todos los materiales necesarios de la Tabla 1 y llévelos a temperatura ambiente (RT). RP10F caliente a 37 °C. Ajuste la centrífuga a RT. A excepción de las centrifugaciones y el conteo de células, realice todos los pasos utilizando células viables en un gabinete de seguridad biológica.</li>
	<li>Obtener sangre en cinco tubos de 10 ml (cantidad deseada) que contengan anticoagulante. Conservar la sangre entera a temperatura ambiente (18-201224 °C). Etiquete los tubos de separación de 50 ml con el número de sujeto de investigación humano para la muestra de sangre que se procesará.</li>
	<li>Transfiera 10\u201215 ml de sangre a cada tubo de separación con el número de sujeto correspondiente. Diluya la sangre al menos 2 veces con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS). No exceda los 35 ml de sangre diluida por tubo.</li>
	<li>Cuidadosamente y lentamente subyace la sangre con ~ 13 ml de medio de densidad. Observe a través del medio de densidad transparente en la parte inferior del tubo y deje de pipetear cuando la pipeta esté casi vacía (para evitar la liberación de burbujas). Retire con cuidado la pipeta para evitar mezclar la sangre y las capas medias de densidad.</li>
	<li>Transfiera cuidadosamente los tubos de separación llenos a la centrífuga sin perturbar las capas.</li>
	<li>Centrífuga a 500 x g durante 30 min con el freno de la centrífuga apagado (deceleración ajustada a cero). NOTA: Si la centrífuga solo muestra rpm, consulte las especificaciones del rotor para estimar el equivalente de rpm para 500 x g.</li>
	<li>Retire con cuidado los tubos de separación de la centrífuga sin perturbar las capas. Observe la capa buffy, que se ha formado entre el medio de densidad y las capas de plasma.</li>
	<li>Pipete desde la parte superior para eliminar y desechar la mayor parte de la fracción plasmática superior, de modo que 10 ml permanezcan por encima de la capa buffy. Recoge con cuidado y lentamente el abrigo buffy. Transfiera las capas buffy de dos tubos de separación a un nuevo tubo de 50 ml preetiquetado y estéril, como se muestra en la Figura 1.</li>
	<li>Diluya los PBMC al menos 2 veces con HBSS, llevando el volumen en cada tubo nuevo hasta 50 ml. Recuerde cambiar el freno de la centrífuga al máximo. PbMC de pellets por centrifugación a 400 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante tanto como sea posible y golpee la parte inferior del tubo para aflojar el pellet.</li>
	<li>Para lisar los glóbulos rojos residuales (RBC), resuspenda cada gránulo celular en 1\u20122 mL de tampón de lisis de cloruro de amonio-potasio (ACK) por 10 mL de volumen sanguíneo original. Incubar durante exactamente 5 min. Detenga rápidamente la lisis con un volumen igual o mayor de HBSS y ajuste el volumen a 50 ml. Centrifugadora a 400 x g durante 10 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y golpee la parte inferior del tubo para aflojar la bolita celular. Agrupa las células del mismo donante. Lleve el volumen hasta 50 ml con HBSS. Centrifugadora a 400 x g durante 10 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y golpee la parte inferior del tubo para aflojar la bolita celular. Resuspenda las células en 10 ml de medio RP10F caliente y tome una alícuota para el conteo de células viables usando azul de tripano.</li>
	<li>Calcule el número total de células en cada muestra utilizando un hemocitómetro.</li>
</ol>2. Purificación de células T CD4+CD45RO+ de PBMCs
NOTA: La purificación de las células T CD4 + CD45RO + de PBMC se realiza mediante el uso de separación magnética disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) con modificaciones menores. Se prefiere seguir el manual del kit para el tiempo de incubación, ya que cada kit comercial tiene sus propias instrucciones.
<ol><li>Lave la cantidad deseada de PBMC en 10 ml de tampón de selección. Centrifugadora a 400 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y golpee la parte inferior del tubo para aflojar el pellet.</li>
	<li>Diluya los PBMC a 5 x 107 celdas/ml en tampón de selección y transfiéralos a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml (12 x 75 mm).</li>
	<li>Añadir 50 μL de cóctel de anticuerpos por 1 ml de muestra y mezclar suavemente. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Inmediatamente antes de su uso, vórtice partículas magnéticas durante 30 segundos a alta velocidad. Añadir 50 μL de partículas magnéticas por 1 ml de muestra al tubo que contiene PBMC y mezclar suavemente.</li>
	<li>Lleve el volumen hasta 2,5 ml con el búfer de selección y mezcle suavemente. Coloque el tubo (sin tapa) en el imán e incube en RT durante 2,5 min.</li>
	<li>Tome el imán y, en un movimiento continuo, invierta el imán y el tubo para verter la suspensión celular enriquecida en un nuevo tubo estéril.</li>
	<li>Para aumentar la recuperación, agregue 2,5 ml de tampón de selección al tubo que queda en el imán, sin perturbar las perlas inmovilizadas. Manténgalo en el imán durante otros 2,5 minutos y repita el paso 2,6 para recuperar células adicionales.</li>
	<li>Tome una alícuota para el conteo de células viables usando azul de tripano. Calcule el número total de células utilizando un hemocitómetro o un contador de células.</li>
	<li>Confirmar la pureza por citometría de flujo (Figura 3).</li>
</ol>3. Activación química
<ol><li>Ajuste las células T CD4+CD45RO+ a 5 x 106 células/ml con medio RP10F caliente y distribuya las células en platos de cultivo del tamaño deseado. Descansar las células en una incubadora humidificada de 37 °C 5% CO2 durante la noche.</li>
	<li>Células reposadas en pellet por centrifugación a 400 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y golpee la parte inferior del tubo para aflojar la bolita celular.</li>
	<li>Ajuste la concentración celular a 5 x 106 celdas/ml con medio RP10F caliente y distribuya 0.5\u20121 x 107 celdas en cada uno de los tres tubos estériles de tapón de rosca. NOTA: Si hay suficientes células disponibles, se pueden incluir estimulaciones duplicadas o puntos de tiempo adicionales en el diseño experimental.</li>
	<li>Estimular células en tubos 2 y 3 con PMA y A23187. Agregue PMA a 25 ng/mL y A23187 a 500 ng/mL y mezcle suavemente. Agregue un volumen igual de dimetilsulfóxido (DMSO) a las células en el tubo 1 que servirá como vehículo (control). Por ejemplo, si usa 1 μL de PMA y 1 μL de A23187, agregue 2 μL de DMSO al tubo del vehículo. Mantenga la concentración final de DMSO por debajo del 0,5% en todos los tubos.</li>
	<li>Afloje las tapas de los tubos y devuelva las células a la incubadora de 37 °C 5% CO2 durante 2 h (tubo 2) y 6 h (tubos 1 y 3). A la hora indicada, centrífuga las células a 500 x g durante 10 min.</li>
	<li>Antes de la lisis, deseche la mayor cantidad posible del sobrenadante, sin perturbar la bolita celular.</li>
	<li>Lisar rápidamente las células, según las instrucciones del kit de aislamiento de ARN disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales). Proceda con el aislamiento de ARN o congele el lisado a -80 ° C para procesarlo más tarde con muestras adicionales. NOTA: La pureza e integridad del ARN pueden verificarse mediante electroforesis microcapilar.</li>
	<li>Opcional: Para eliminar completamente todos los rastros de ADN de la muestra de ARN purificado, use el kit de limpieza de ARN (consulte la Tabla de materiales), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.
Divulgación ética: Este protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas (UAMS, Little Rock, AR) Los datos de microarrays presentados en este estudio se realizaron sobre las muestras reclutadas bajo un protocolo de investigación aprobado por el IRB del Hospital Henry Ford (Detroit, MI).

Se han desarrollado varias formas de aislar los PBMC, y cada una tiene sus propias ventajas y limitaciones28. Recolectamos rutinariamente hasta 50 ml de sangre en cinco tubos de 10 ml que contienen anticoagulante. El volumen de sangre para el aislamiento de PBMC depende de varios factores, como la salud y la edad del sujeto de investigación y también de la experiencia del flebotomista. Un paso crítico del procedimiento en el protocolo es la formación del gradiente de paso. Una estratificación deficiente puede resultar en una falla parcial o completa de los PBMC para sedimentar en la interfaz. Preferimos el método de capas inferiores descrito aquí, ya que es fácil iniciar la capa inferior. Para dispensar completamente todo el medio de densidad debajo de la sangre, es fundamental usar una ayuda de pipeta sin fugas de aire. La contaminación de la fracción PBMC por tipos de células no deseados se puede minimizar mediante la recolección cuidadosa y consistente de la capa buffy, que debe realizarse de la misma manera para cada aislamiento. Si los PBMC no se fraccionan aún más, se debe evitar la recolección de diferentes cantidades del gradiente de densidad y las capas de plasma entre los aislamientos. La lisis de glóbulos rojos se realiza para minimizar el impacto potencial de la contaminación del ARN derivado de glóbulos rojos y reticulocitos en los análisis de expresión génica aguas abajo. La lisis hipotónica será inhibida por el exceso de tampón isotónico.
El aislamiento adicional del subconjunto de células T es importante para los estudios moleculares. Aquí describimos la selección posterior de células T CD4 + CD45RO + por selección negativa para eliminar los tipos de células no deseados. La selección negativa se basa en anticuerpos que reconocen marcadores específicos de la superficie celular para todas las células no deseadas. Las células recubiertas de anticuerpos se eliminan mediante perlas magnéticas. Este protocolo de selección elimina las células no deseadas al tiempo que permite que las células diana intactas y no estimuladas permanezcan flotando libremente, lo cual es esencial para estudiar la activación de genes. Sin embargo, se debe tener cuidado para evitar los grupos celulares, que reducen la pureza final de las células T CD4 + CD45RO + seleccionadas. El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) presente en el tampón de selección minimiza la aglomeración celular. El rendimiento de las células T depende de factores como el volumen inicial de la sangre, las variables del paciente, como el tratamiento que se administra al paciente y la etapa de la enfermedad en el momento de la recolección de la muestra. El tratamiento administrado a los pacientes también puede afectar la viabilidad celular. Además, la recolección de muestras antes de cualquier procedimiento, como la fotoféresis, también tiene un impacto positivo en la pureza de las células T CD4 + CD45RO +. Hemos observado que la recolección de muestras después del procedimiento de tratamiento de fotoféresis tiene un impacto negativo en el rendimiento de las células T CD4 + CD45RO +.
Los clones neoplásicos de células T de pacientes con SS expresan con mayor frecuencia marcadores de superficie consistentes con un fenotipo de células T CD4 maduroy de memoria 29,30. Sin embargo, la plasticidad fenotípica se ha observado ocasionalmente con respecto a marcadores de superficie incluyendo CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 y/o CD2631. Estudios previos también han demostrado la heterogeneidad en la expresión de CD45RO y CD45RA entre los pacientes con SS29, mientras que la mayoría de los casos de SS siguen siendo CD45RO+. Roelens et al.31 también mostraron que la SS puede exhibir heterogeneidad interindividual e intraindividual con subgrupos mixtos de población ingenua (TN), memoria central (MTC), memoria transicional (TTM), memoria efectora (TEM) y memoria efectora terminal (TEMRA). Sin embargo, sus resultados muestran claramente que la mayoría de las células SS tienen fenotipo TCM. Centramos nuestro estudio en el inmunofenotipo de superficie CD45RO+ más común en pacientes con SS, y confirmamos el fenotipo por citometría de flujo. En la planificación de estudios de subconjuntos de células T en pacientes, es importante considerar la heterogeneidad fenotípica de la enfermedad que se está estudiando, por lo que la estrategia de purificación puede ajustarse según sea necesario para obtener la población de células T deseada para el análisis.
Hay varias maneras de estimular las células T y los PBMC para examinar la expresión génica funcional. Preferimos la activación química (PMA + ionóforo A23187), ya que nos interesa la regulación génica en el núcleo. La activación química es una mejor opción para este propósito porque actúa como un activador amplio y es más uniforme en comparación con la estimulación específica del antígeno. PMA es un pequeño compuesto orgánico que se difunde a través de la membrana celular en el citoplasma, y activa directamente la proteína quinasa C. A23187 permite que el calcio pase a través de las membranas. Estos compuestos evitan los receptores de superficie y juntos imitan los efectos de la ligadura del receptor de células T con coestimulación mediada por CD28. Los productos químicos activan varias vías de señalización intracelular, lo que resulta en la activación del factor de transcripción nuclear y la regulación ascendente de los genes de citoquinas que son accesibles para la activación de la transcripción. Aunque la activación química y la ligadura CD3CD28 producen perfiles de expresión génica global sorprendentemente similares en células normales32, la activación química con PMA + A23187 es una buena opción ya que las células T SS pueden perder la expresión de los receptores de superficie, incluidos los componentes TCR33. Chong et al.22 compararon la activación de genes de citoquinas entre PMA/A23187 con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en PBMC de pacientes normales, tempranos de MF/CTCL y tardíos de MF/CTCL. Informaron que PMA / A23187 causó una activación más rápida e intensa del gen IL-2 en comparación con la estimulación anti-CD3 / CD28. Además, demostraron que la cinética de activación más lenta con los anticuerpos anti-CD3 / CD28 es potencialmente de reticulación y señalización de membrana necesaria para la estimulación. Además, las tendencias en la expresión de citoquinas entre las diferentes poblaciones celulares estudiadas se conservaron con PMA/A23187. Dado que estamos interesados en la activación de la expresión génica, la estimulación química es un enfoque ideal porque actúa como un activador amplio y es más consistente en comparación con la estimulación específica del antígeno. La ligadura CD3/CD28 es ideal para investigar vías importantes en la transducción de señales basada en membranas. Además, la activación química es menos costosa y no requiere equipo especial. En el estudio actual, PMA + A23187 activó significativamente los genes de citoquinas en las células T ND pero no en las células T SS, lo que sugiere que las células T SS tienen deficiencias funcionales aguas abajo del TCR.
En resumen, este protocolo proporciona células T fenotípicamente puras a partir de sangre preciosa derivada del paciente, y un método para evaluar los cambios en todo el genoma en la expresión génica funcional. Demostramos que el perfil transcriptómico de las células T SS en comparación con las células T CD45RO + normales revelan profundas diferencias en la activación de genes en células T humanas frescas de pacientes con CTCL. Estos estudios ayudarán al desarrollo de biomarcadores de diagnóstico y estrategias terapéuticas dirigidas a nuevos marcadores en CTCL. Además, esta estrategia y protocolo en el estudio de las células T humanas primarias puede ser valiosa para adaptarse a los estudios de otras enfermedades mediadas por células T.

El linfoma cutáneo de células T (CTCL), que incluye los subtipos más comunes de micosis fungoide (MF) y síndrome de Sézary (SS), es un grupo heterogéneo de enfermedades derivadas de la transformación y proliferación incontrolada de células T maduras de la piel 1,2. Las células T neoplásicas tienen un CD4+CD45RO+ maduro, fenotipode memoria 3, y expresan marcadores de adhesión de homing cutáneo, aumentando el epidermotropismo4, que se manifiesta como una erupción particularmente en la enfermedad temprana. El curso clínico de la MF es a menudo indolente cuando se está bajo la atención administrada de rutina, pero un subconjunto de pacientes puede progresar a una enfermedad más avanzada. En estos casos de MF, las lesiones cutáneas crecen y se engrosan en tumores grandes, y las células T neoplásicas pueden diseminarse a los ganglios linfáticos y los órganos viscerales. Por el contrario, la SS es una variante leucémica más agresiva de CTCL5, caracterizada por una tríada de síntomas: eritrodermia generalizada (definida como que afecta al >80% del área total de la superficie corporal), linfadenopatía y presencia de más de 1000/mm3 células T atípicas clonales circulantes con núcleos cerebrásicos, las llamadas células de Sézary 6,7 . El pronóstico para los pacientes con SS es significativamente peor que el de MF. La SS es rara con una tasa de incidencia de 0,1/100.000, y representa aproximadamente el 3% del total de casos de CTCL 8,9. CTCL generalmente se presenta en adultos mayores con una edad promedio de aproximadamente 60 años10. La tasa de incidencia de CTCL había ido en aumento y, aunque la causa no está clara, la tasa se ha estabilizado desde 199811,12.
La patogénesis molecular de las SS sigue sin estar clara. Los estudios genéticos, epigenéticos y de expresión génica han producido una gran cantidad de datos novedosos, sin embargo, sigue habiendo hallazgos inconsistentes, principalmente debido a las pequeñas cohortes de pacientes estudiadas2, así como a las diferencias en el diseño experimental y las poblacionesde control 13,14. La mejora de la caracterización genómica y transcriptómica puede arrojar luz tanto sobre los mecanismos de la enfermedad como sobre las dianas terapéuticas previamente inexploradas. Por lo tanto, se necesitan más estudios de una población de pacientes más grande para comprender mejor esta neoplasia maligna heterogénea. Los paneles de biomarcadores que son altamente sensibles y específicos en una cohorte de SS se han desempeñado de manera menos uniforme en otras cohortes15, lo que representa un serio obstáculo en el desarrollo de biomarcadores diagnósticos y pronósticos confiables para SS16. Los biomarcadores diagnósticos ideales estarán consistentemente y altamente sobreexpresados en las células T malignas, mientras que estarán ausentes o casi ausentes en las células T normales17. El descubrimiento de biomarcadores específicos de la enfermedad es importante para el avance de los protocolos diagnósticos y terapéuticos para la SS.
Los datos transcriptómicos de alta calidad para las células T malignas y normales requieren un enfoque eficiente y confiable para la preparación de muestras. Aquí, discutiremos una estrategia detallada pero simple para obtener muestras de ARN de poblaciones de células T relevantes para las SS. Discutiremos el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre total, la selección magnética negativa de poblaciones de células T CD4 + CD45RO + relevantes para la enfermedad, la activación química para revelar diferencias en las respuestas funcionales y la preparación de ARN para el perfil transcriptómico. En el protocolo actual, la activación química se ha realizado utilizando acetato de miristato de forbol (PMA) e ionóforo de calcio (A23187)18,19, porque estudios previos han demostrado una señalización defectuosa del receptor de células T en CTCL, y la estimulación con PMA/A23187 evita el receptor de células T20,21. Además, PMA/A23187 permite una activación proximal más directa de las señales nucleares necesarias para la activación del gen de las citoquinas. Finalmente, la estimulación de las células T proporciona un nivel adicional de comprensión de la regulación de la expresión génica que no se podría obtener de las células T en reposo donde el cambio dinámico está ausente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:706px;" width="706">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:269px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1000 ul Pipet tips</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10017-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">15 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">25 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">5 ml Disposable Plastic Pipette</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">170355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">50 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">A23187 ionophore</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMSO</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650-5x5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit</td>
			<td style="width:151px;">StemCell</td>
			<td style="width:119px;">19157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FBS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HBSS</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">P184-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-072-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:151px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">10378-23-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">phorbol12-myristate13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td>
			<td style="width:151px;">RAININ</td>
			<td style="width:119px;">17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:151px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rneasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:151px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:151px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">T-25 Flask</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells and cd4+ t cells from s&#233;zary syndrome patients for transcriptomic profiling

Los linfomas cutáneos de células T (CTCL) se derivan de la transformación y proliferación incontrolada de células T maduras que albergan la piel, y la micosis fungoide (MF) y el síndrome de Sézary (SS) representan los subtipos más comunes. A pesar de una serie de estudios sobre la caracterización de la expresión génica, las alteraciones genéticas y las anomalías epigenéticas de CTCL, la patogénesis molecular de MF / SS sigue sin estar clara. MF se refiere al CTCL más común con un predominio de la piel, y generalmente se limita a la piel, mientras que SS es una variante leucémica agresiva de CTCL con una participación generalizada de la piel y se caracteriza por una distribución neoplásica que involucra principalmente sangre, piel y ganglios linfáticos. Centrándose en la práctica clínica, la identificación de biomarcadores de expresión génica tiene un enorme potencial para mejorar el diagnóstico y el tratamiento de MF / SS. De hecho, estudios transcriptómicos recientes han identificado posibles biomarcadores de diagnóstico a partir de diferencias en la expresión génica entre las células T normales y malignas, lo que puede mejorar nuestra comprensión de la biología de las SS y revelar posibles objetivos terapéuticos. Este manuscrito describe un protocolo reproducible detallado para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre entera fresca de pacientes diagnosticados con SS, selección de células T de memoria CD4 + (células T CD4 + CD45RO +), estimulación química y preparación de ARN adecuado para el perfil transcriptómico para descubrir nuevos marcadores moleculares pronósticos para obtener información adicional en la etiología de la enfermedad. La estimulación utilizando agonistas químicos para activar la regulación nuclear proporciona una evaluación más específica de las vías importantes en la regulación dinámica de la transcripción y la expresión génica y elimina los defectos de confusión que pueden surgir de los defectos de señalización aguas arriba que surgen de la pérdida de antígeno TCR en la membrana celular. Los datos obtenidos de la comparación del transcriptoma de células T SS no estimuladas con estimuladas desenmascaran los defectos funcionales de expresión génica reguladora no evidentes a partir del análisis de células no estimuladas inactivas. Además, el método descrito a partir de este enfoque se puede adaptar para estudiar los defectos de expresión génica de las células T en otras enfermedades inmunes de las células T.

Este protocolo incluye procedimientos para el aislamiento de PBMC de sangre SS, purificación de células T CD4 + CD45RO + por selección negativa, estimulación de células T purificadas y aislamiento de ARN total para perfiles transcriptómicos. La Figura 1 describe el proceso de aislamiento de PBMC de sangre total. Tenga en cuenta que el rendimiento total de los PBMC SS variará con el volumen sanguíneo inicial y la carga tumoral circulante de cada paciente. En nuestro laboratorio, el rendimiento promedio de los PBMC SS fue de 4,6 × 106 células/ml de sangre total (1,85 × 106 – 3,25 x 107 células/ml para 7 SS). La viabilidad media de los PBMC aislados fue del 95%: 95%. La Figura 2 muestra la alta pureza y viabilidad de las células T de memoria CD4+CD45RO+ seleccionadas. El rendimiento promedio de las células T CD4 + CD45RO + de los PBMC SS fue del 75% (75,6% – 84%), en comparación con el 15,9% (3% – 30%) de los PBMC de donantes normales (ND) obtenidos de las cámaras del sistema de leucorreducción (LRS). La viabilidad y pureza de las células T CD4+CD45RO+ obtenidas por este protocolo de selección negativa ha sido consistentemente alta (Figura 3).
Previamente combinamos el protocolo de activación anterior con microarrays para estudiar los cambios funcionales en los transcriptomas de las células T SS y ND, y hemos demostrado que las células T de memoria SS y los PBMC SS expresan mal las citoquinas y otros genes de respuesta inmune en comparación con las células T ND y pbMC 19,22,23. La Figura 4 muestra la activación robusta de varios genes de citoquinas, incluyendo IL4, IL 10, IL13 e IL22 en células T ND, pero no en células T SS. Este defecto en la expresión génica funcional en las células T SS ha sido confirmado desde entonces por otros grupos24. Además, muchos genes que normalmente no se expresan en las células T ND están altamente expresados en las células T SS, tanto en reposo como después de la estimulación (Figura 4). Estos incluyen los genes biomarcadores SS previamente descritos DNM3, PLS3, TOX y TWIST1 25,26,27, así como ANK1 y SGCE, que fueron reportados por primera vez por nuestro grupo. Estos biomarcadores positivos están altamente expresados en SS, pero no en ND, y evitan las trampas técnicas asociadas con los biomarcadores negativos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2.jpg"> Figura 1: Aislamiento de PBMC de sangre total. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig2.jpg"> Figura 2: Selección negativa de células T de memoria CD4+ de PBMC aislados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig3.jpg"> Figura 3: La pureza de las células T CD4+CD45RO+ se confirmó mediante citometría de flujo. Los linfocitos fueron cerrados por dispersión de luz (A), los linfocitos vivos excluyeron el colorante de viabilidad eFluor780 (B) y (C) representa donantes normales no seleccionados (ND). La selección negativa resultó en poblaciones casi puras de células T CD45RO + en pacientes con ND (D) y SS (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig4.jpg"> Figura 4: Expresión génica diferencial en células T de memoria CD4+CD45RO+ en reposo y activadas de SS y ND. La puntuación z de expresión génica está representada por una escala de colores de rojo (alta expresión) a verde (baja expresión). Las barras de colores en la parte superior del mapa de calor representan tratamientos celulares: simulado / vehículo tratado (rojo), 2 h estimulado (azul) y 6 h estimulado (amarillo). Varios genes biomarcadores de SS están altamente expresados y los genes de citoquinas se expresan mal en las células T SS en comparación con las células T ND. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Reactivos</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Densidad Media</td>
			<td>Medio de separación de linfocitos, Ficoll-Hypaque, o medio de densidad equivalente con densidad = 1.077-1.080g/ml a 20oC.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td>1x Solución salina equilibrada de Hank, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP10F</td>
			<td>RPMI 1640 medio, suero fetal bovino inactivado al 10 % por calor (FBS), 1x solución de penicilina-estreptomicina, pH 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón de lisis ACK</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, Sin necesidad de ajustar el pH. Debe ser ~ 7.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Búfer de selección</td>
			<td>1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>forbol12-miristato13-acetato (PMA)</td>
			<td>50 μg/ml en DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>A23187 ionóforo</td>
			<td>500 μg/ml en DMSO</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Reactivos.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÂ©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling at JoVE.com

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Presentamos un protocolo sencillo para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre total obtenida de pacientes diagnosticados con Síndrome de Sézary, seguido de selección de linfocitos T CD4+, su estimulación con forbol12-miristato13-acetato e ionóforo A23187, y preparación de ARN para el perfil transcriptómico.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana y células T CD4 + de pacientes con síndrome de Sézary para perfiles transcriptómicos

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Este protocolo nos permite la capacidad de aislar linfocitos T de pacientes con la enfermedad para estudios, el defecto molecular y el defecto inmunológico. Este método nos permite aislar células viables, células con las anomalías de la enfermedad para la purificación del ARN, ADN y proteínas de estos pacientes y que nos permite caracterizar defectos moleculares para comprender las anomalías de las vías que son importantes en la patogénesis. Este método es valioso para el aislamiento de sangre periférica que se puede fraccionar aún más para estudiar las células sanguíneas en estados normales, así como las células sanguíneas de enfermedades con anomalías inmunes.Demostrando este procedimiento estará Alanna, quien es una estudiante de medicina investigadora de mi laboratorio. Después de obtener una muestra de sangre periférica en cinco tubos de 10 mililitros que contienen anticoagulante, transfiera de 10 a 15 mililitros de sangre a tubos de separación de 50 mililitros marcados con el número de sujeto y diluya las muestras al menos dos veces, pero a no más de 35 mililitros por tubo con HBSS. Cuidadosamente y lentamente subyace la sangre con aproximadamente 13 mililitros de medio de densidad por tubo, deteniendo el pipeteo cuando la pipeta está casi vacía para evitar burbujas.Retire la pipeta lentamente para evitar mezclar las capas de sangre y medio de densidad y transfiera cuidadosamente los tubos de separación llenos a la centrífuga sin perturbar las capas. Después de separar las células por centrifugación, retire todos menos los últimos 10 mililitros del plasma que contiene la capa superior, antes de recoger cuidadosa y lentamente la capa buffy. Agrupe la capa buffy de entre dos tubos de separación en un solo tubo estéril de 50 mililitros etiquetado y diluya el PBMC al menos dos veces con HBSS fresco a un total de 50 mililitros por tubo.Cuando se hayan recogido todas las capas de buffy, peine las células por centrifugación y retire la mayor cantidad posible del sobrenadante de cada tubo. Golpee el fondo del tubo para aflojar el gránulo y vuelva a suspender los gránulos en uno o dos mililitros de tampón de lisis ACK por volumen de muestra de sangre original de 10 mililitros por tubo. Después de exactamente cinco minutos, detenga la lisis en cada tubo con un volumen igual o mayor de HBSS y ajuste cada volumen a 50 mililitros.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, agrupe las células del mismo donante y lleve el volumen hasta 50 mililitros con HBSS fresco para otra centrifugación. Luego vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio RP 10F de 37 grados Celsius para contar. Para la purificación de células T CD4 +CD45RO +, gire hacia abajo las células y diluya el PBMC a cinco veces 10 a la séptima célula por mililitro de concentración tampón de selección.Transfiera las células a un tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros y agregue 50 microlitros de cóctel de anticuerpos por cada mililitro de muestra con una mezcla suave. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, vórtice partículas magnéticas a alta velocidad durante 30 segundos antes de agregar 50 microlitros de partículas magnéticas por un mililitro de muestra al tubo con una mezcla suave. Lleve el volumen a 2,5 mililitros con un tampón de selección fresco y una mezcla suave y coloque el tubo sobre un imán durante 2,5 minutos.Al final de la incubación, recoja el imán e invierta el tubo en un movimiento continuo para decantar la suspensión celular enriquecida en un nuevo tubo estéril. Para aumentar la recuperación celular, agregue 2.5 mililitros de tampón de selección al tubo sin perturbar las perlas inmovilizadas para otra incubación de 2.5 minutos en el imán y agregue el lavado al tubo de recolección, luego cuente el número de células viables usando un hemocitómetro y confirme la pureza de la célula por citometría de flujo. Para activar las células, ajuste las células T CD4 + CD45RO + a cinco veces 10 a las sextas células por mililitro de concentración media de 37 grados Celsius RP 10F y sembra las células en platos de cultivo del tamaño adecuado.Descanse las células en una incubadora humidificada de 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante la noche. A la mañana siguiente, recoja las células descansadas por centrifugación y resuspenda el pellet a una concentración media de cinco veces 10 a la sexta célula por mililitro de 37 grados Celsius RP 10F. Divida la suspensión en cinco a 10 veces alícuotas de 10 a la sexta celda en cada uno de los tres tubos de tapón de rosca estériles y estimule las células en el tubo dos con PMA y el tubo tres con A23187 y mezcla suave.Agregue un volumen igual de dimetilsulfóxido al primer tubo para que sirva como control del vehículo y coloque los tubos con las tapas aflojadas en la incubadora durante el período de activación apropiado. Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación y deseche la mayor cantidad posible del sobrenadante sin alterar el gránulo celular. Luego, lisa las células según las indicaciones de un kit de aislamiento de ARN disponible comercialmente y aísle el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.La viabilidad y pureza de las células T CD4+CD45RO+obtenidas por este protocolo de selección negativa es consistentemente alta. El rendimiento de las células T CD4+CD45RO+obtenidas de las cámaras del sistema de leucorreducción de los PBMC de la SS suele ser de alrededor del 75% en comparación con aproximadamente el 16% de las PBMC de donantes normales. Las células T de memoria SS y las PBMC de la SS expresaron mal las citoquinas y otros genes de respuesta inmune en comparación con las células de las células T y pbMC de donantes normales.Además, muchos genes que normalmente no se expresan en las células T de donantes normales se expresan altamente en las células T SS tanto en reposo como después de la estimulación. Una buena técnica estéril y una rutina consistente son realmente importantes para el éxito de esta técnica. También es muy importante mientras superpones el Ficoll que uses una pipeta automática con un control fino y que realmente prestes atención a la velocidad a la que estás colocando el Ficoll.Las células aisladas utilizando este método serán viables y se pueden utilizar para estudios de toxicidad, estudios bioquímicos moleculares para la caracterización de vías de transducción de señales, citometría de flujo y estudios de expresión génica. El método se puede utilizar para aislar células de pacientes con enfermedad, para enfermedades inflamatorias y también otras enfermedades como el cáncer para estudios directos. Ejemplos de estas enfermedades incluyen psoriasis y dermatitis atópica.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Captura y Liberación de viables células tumorales circulantes de la sangre

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelado de Osteosarcoma usando las células de vástago de Pluripotent inducido derivados del paciente el síndrome de Li-Fraumeni

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido de la pulpa y cocultivo con células de cáncer para estudiar sus interacciones

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

Un modelo de xenoinjerto humanizado de sangre periférica humana (PBMC) para la investigación de inmunooncología traslacional (I-O)

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Uso de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la generación de células T específicas de antígenos tumorales

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Mapeo de las relaciones estructura-función de los factores de transcripción oncogénicos desordenados utilizando el análisis transcriptómico

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Expansión y enriquecimiento de células T gamma-delta (γδ) a partir de productos humanos aféridos

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

Un método automatizado de puntuación microscópica para el ensayo de focos γ-H2AX en linfocitos de sangre periférica humana

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

La implantación ortotópica de células cancerosas derivadas de pacientes en ratones recapitula el cáncer colorrectal avanzado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...