Name: nuclei isolation from whole tissue using a detergent and enzyme-free method
Uploaded: 2020-06-24T14:00:00
Duration: 7 min
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Agradecemos a los miembros del laboratorio Dr. Sabine Costagliola y Singh por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS bajo la Subvención número 34772792 – MISU a S.P.S.

Todos los procedimientos presentados a continuación se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones y regulaciones éticas y de bienestar animal nacionales, que fueron aprobadas por el comité ético para el bienestar animal (CEBEA) de la Universidad Libre de Bruselas (protocolos 578N-579N).
1. Preparación antes de la disección de tejidos
<ol><li>Preparar una solución de Tricaína al 0,2% en PBS para eutanasiar el pez cebra. Enfríe la solución sobre hielo.</li>
	<li>Prepare un plato petri de 30 mm para picar el tejido.</li>
	<li>Preparar el hielo frío 1x PBS (10 ml por muestra de tejido).</li>
	<li>Enfríe la centrífuga a 4oC.</li>
	<li>Para el aislamiento de núcleos, utilice un kit de aislamiento de núcleos sin detergente (Tabla de materiales).</li>
	<li>Antes de iniciar el protocolo, pre-enfriar el buffer A y B proporcionado en el kit colocándolos en hielo durante al menos 30 minutos antes del aislamiento de los núcleos.</li>
	<li>Para manipular los núcleos aislados, cubra los reactivos plásticos como tubos y puntas de pipeta con una solución BSA al 5%. Para ello, prepare la solución disolviendo 2 g de BSA en 40 ml de PBS. Recubrimiento de artículos de plástico con 5% BSA reduce los núcleos pegados al plástico. Este paso mejora la recuperación de núcleos aislados.</li>
	<li>Recubrir las puntas de la pipeta pipeteando 5% solución BSA 2-3 veces. Seque al aire las puntas durante 2 horas. Prepare 10 puntas de plástico por muestra.</li>
	<li>Recubrir los tubos para la recolección de núcleos llenándolos con 5% de BSA. Invierta los tubos 3 veces para garantizar un recubrimiento eficiente. Retire la solución y seque al aire los tubos boca abajo en un papel de tejido limpio durante 2 horas. Por muestra, cubra un tubo de recogida proporcionado en el kit. Además, preparar tubos recubiertos de 1,5 ml para la recolección de núcleos después de FACS. NOTA: Las puntas de vidrio son una alternativa muy recomendable a las puntas de pipeta de plástico para minimizar la adherencia.</li>
</ol>2. Disección del cerebro de pez cebra
<ol><li>Para eutanasiar el pez cebra, preparar un plato petri de 90 mm con 25 ml de solución de Tricaine helada.</li>
	<li>Con cuidado, tome el pez cebra del tanque usando una red de pesca y colóquelo en el plato Petri.</li>
	<li>Eutanasia el pescado dejándolo en Tricaine durante 5 min.</li>
	<li>Decapita al animal con una cuchilla de afeitar afilada.</li>
	<li>Usando fórceps, abre suavemente el cráneo y elimina los tejidos blandos, la piel y los huesos del lado ventral y dorsal del cráneo.</li>
	<li>Transfiera suavemente el cerebro a un plato fresco de 30 mm que contenga PBS helado.</li>
	<li>Picar el cerebro en trozos pequeños usando una cuchilla de afeitar para facilitar la carga de la muestra en la columna de giro.</li>
</ol>3. Aislamiento de núcleos individuales
<ol><li>Transfiera el tejido picado al cartucho de filtro suministrado en el kit de aislamiento de núcleos y agregue 200 l de tampón frío A para sensibilizar el tejido. Moler el tejido utilizando la varilla de plástico proporcionada por el kit durante 2 minutos.</li>
	<li>Añadir 300 l de tampón en frío A e incubar el cartucho de filtro sobre hielo con la tapa abierta durante 10 min.</li>
	<li>Tapar el cartucho y resuspender el tejido invirtiendo el tubo 5 veces.</li>
	<li>Centrífuga a 16.000 g g para 30 s. En este paso, las células se rompen al pasar a través del filtro y se aplica la fuerza centrífuga de alta velocidad. El flujo a través contiene núcleos intactos, que pellet en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Deseche el filtro y resuspender el pellet por vórtice vigorosamente durante 10 s.</li>
	<li>Pellet los núcleos centrifugando la solución a 500 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante cuidadosamente ya que el pellet de núcleos es incoloro.</li>
	<li>Resuspender el pellet en 0,8 ml de tampón frío B y centrífuga a 600 x g durante 10 min. En este paso, los núcleos se separan de los desechos de membrana. El pellet incoloro obtenido contiene núcleos aislados.</li>
	<li>Resuspender los núcleos aislados en 500 l de PBS con 5% de BSA. Mantenga la suspensión de los núcleos sobre hielo para realizar el FACS después de la cuantificación.</li>
</ol>4. Visualización de la morfología de los núcleos
<ol><li>Confirme la morfología nuclear mediante la tinción de Hoechst. Para ello, retire 100 ml de suspensión de núcleos individuales en un tubo nuevo utilizando puntas recubiertas de BSA. Para manchar los núcleos, añada 0,1 l de Hoechst (1 mg/ml). Atratice suavemente el tubo.</li>
	<li>Transfiera la suspensión de los núcleos a la placa inferior de vidrio para obtener imágenes.</li>
	<li>Imagen de los núcleos utilizando un microscopio de fluorescencia con ajustes de excitación láser de longitud de onda de 405 nm (Violeta).</li>
</ol>5. Enriquecimiento de núcleos basado en FACS
<ol><li>Antes de realizar FACS, filtre los núcleos utilizando un colador celular de 40 m en un tubo recubierto de BSA.</li>
	<li>Diluir la suspensión filtrada añadiendo PBS con 5% de BSA a un volumen final de 1.000 l.</li>
	<li>Etiquete dos tubos FACS de fondo redondo como "control" y "manchados". El tubo de "control" contendrá núcleos sin teñir, mientras que el tubo "manchado" tendrá núcleos manchados de Hoechst.</li>
	<li>Transfiera 250 l de la suspensión de los núcleos al tubo de "control" utilizando la punta de pipeta recubierta de BSA.</li>
	<li>Transfiera la solución restante de 750 l al tubo FACS etiquetado como "manchado" y añada 1 oL de tinte Hoechst para manchar los núcleos. Mezclar por vórtices lentos.</li>
	<li>Cargue la muestra de control no manchada en el clasificador de celdas. Registre 5000 eventos.</li>
	<li>Cargue las muestras manchadas y registre 5000 eventos.</li>
	<li>Dibuje puertas FACS que permitan la identificación de núcleos individuales. Los núcleos se pueden seleccionar comparando la señal de fluorescencia Hoechst entre el control y la muestra teñida.</li>
	<li>Ordene los núcleos positivos de Hoechst del tubo teñido en un nuevo tubo de 1,5 ml que contenga 50 l de PBS con 5% de BSA. NOTA: Los núcleos aislados se pueden recoger en un medio deseado de acuerdo con los requisitos de la aplicación posterior.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells.">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+characterization+of+ovine+mesenchymal+stem+cells.">Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells.</a> Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).</li><li>Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumour+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Bioarxiv. 683227, (2019).</li><li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types.">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> Plos One. 13 (12), 0209648 (2018).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Rajbhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+reveals+immune+cell-adipocyte+crosstalk+regulating+the+transcription+of+thermogenic+adipocytes.">Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Birnie, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Nuclei+from+Animal+Cells+in+Culture.">Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture.</a> Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).</li><li>Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+isolating+intact+mitochondria+and+nuclei+from+the+same+homogenate,+and+the+influence+of+mitochondrial+destruction+on+the+properties+of+cell+nuclei.">A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).</li><li>Hymer, W. C., Kuff, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Nuclei+From+Mammalian+Tissues+Through+the+Use+of+Triton+X-100.">Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100.</a> The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).</li><li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergents:+Triton+X-100,+Tween-20,+and+More.">Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More.</a> Materials and Methods. 3, (2013).</li><li>Sikorskaite, S., Rajam&#228;ki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+Optimised+methodology+for+isolation+of+nuclei+from+leaves+of+species+in+the+Solanaceae+and+Rosaceae+families.">Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families.</a> Plant Methods. 9 (1), 31 (2013).</li><li>Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Subcellular fractionation: a practical approach. , (1997).</li></ol>

Los autores no tienen conflicto de intereses. El pago por hacer el acceso abierto al artículo fue realizado por Invent Biotechnologies Inc., EE. UU.

El perfilado del transcriptoma y el epigenoma con una resolución monocélula ha revolucionado el estudio de los sistemas biológicos. Los estudios a la resolución de una sola célula para un tejido sólido dependen de la disociación del órgano en células individuales o núcleos. La disociación es un procedimiento destructivo que puede introducir artefactos técnicos, que pueden impedir el desarrollo de una representación precisa del sistema5,,6. Por ejemplo, la disociación enzimática puede dañar las células con morfologías complejas, como neuronas o podocitos, y puede inducir la expresión de los genes de respuesta de estrés y choque térmico7,,12. Además, el uso de detergente durante la disociación puede romper la membrana nuclear y conducir a la agregación23,,25. Por lo tanto, la optimización de la disociación para obtener una suspensión de una sola célula o núcleos de la más alta calidad es primordial para el éxito de los experimentos de perfilado de alto rendimiento.
Aquí, demostramos un método de aislamiento de detergente y núcleos libres de enzimas que permite la extracción de núcleos intactos del cerebro de pez cebra en menos de 20 minutos. El protocolo produce núcleos con morfología típica e integridad robusta(Figura 2). A partir de un solo cerebro de pez cebra con un peso de 6 mg, el protocolo produce un total de 60.000 núcleos determinados por un recuento de hemocitoómetros. Los núcleos aislados se pueden utilizar para múltiples aplicaciones aguas abajo, incluyendo snRNA-seq, ATAC-seq e inmunostaining. Los núcleos aislados pueden incluir contaminación cruzada de fracciones citoplasmáticas, particularmente de componentes de retículo endoplasmático y mitocondrias. Para experimentos de perfilado de alto rendimiento, se recomienda encarecidamente el aclaramiento de desechos celulares, particularmente las mitocondrias. La citometría de flujo (Figura 3) proporciona una opción viable para la purificación de núcleos. Alternativamente, el gradiente de sacarosa también se puede utilizar para la eliminación de escombros.
El protocolo se ha probado en la glándula tiroides del ratón (datos no mostrados) y proporciona resultados similares al tejido cerebral del pez cebra. En general, el protocolo proporciona un método robusto, reproducible y universal para la preparación de la suspensión de un solo núcleo, lo que ayuda a simplificar la logística para experimentos de generación de perfiles de alto rendimiento.

El ARN-seq de una sola célula (scRNA-Seq) y el ATAC-seq son herramientas versátiles para estudiar sistemas biológicos complejos con resolución de una sola célula. Se utilizan ampliamente para definir subtipos y estados celulares, redes genéticas y para evaluar la heterogeneidad celular. Un requisito previo para realizar scRNA-seq es la preparación de una suspensión de una sola célula por disociación tisular. Debido a la variación en la composición de la matriz extracelular y las propiedades mecánicas, los tejidos individuales requieren la optimización del protocolo de disociación para la preparación de la suspensión de una sola célula.
La disociación de los tejidos en células individuales suele implicar el tratamiento con enzimas digestivas, incluyendo colagenasa, dispase o tripsina, a 37 oC1,2,3,4. Dado que la maquinaria transcripcional permanece activa a 37oC, la disociación enzimática puede introducir artefactos de expresión de ARNm y ruido5,,6. En particular, la incubación prolongada puede inducir genes sensibles al estrés y respuesta de choque térmico de una manera no uniforme, lo que conduce a una variabilidad técnica en el experimento7.
Otro inconveniente de generar una suspensión de una sola célula es la dificultad para obtener tipos de células viables e intactos con morfologías complejas. En particular, las neuronas, adipocitos y podocitos son un reto para aislar8,9,10,11. Por ejemplo, Wu y sus colegas demostraron la ausencia de podocitos glomerulares en los perfiles de SCRNA de un riñón de ratón adulto12. Observaciones no óptimas similares se han realizado con respecto a la recuperación de neuronas interconectadas del tejido cerebral8,13,14. En resumen, los protocolos de disociación pueden introducir sesgo de detección hacia tipos de células más fáciles de disociar, lo que conduce a una tergiversación de la arquitectura celular del órgano.
Para superar el ruido técnico y el sesgo introducido durante la preparación de la muestra en scRNA-Seq., el aislamiento y el perfilado del núcleo proporciona una alternativa atractiva. Como la morfología nuclear es similar entre los diferentes tipos de células, el aislamiento de los núcleos elude el problema de aislar las células intactas y viables con morfologías complejas. Por ejemplo, Wu y sus colegas demostraron un perfil exitoso de podocitos glomerulares con el ARN-Seq. (snRNA-Seq. de un riñón de ratón adulto, que faltaba en scRNA-Seq12. Intrigantemente, los estudios comparativos entre el ARN-seq de una célula y el RNA-seq de un solo núcleo han sugerido una disminución en la inducción de los genes de respuesta al estrés y al choque térmico con arn ARN-Seq12. Los estudios sugieren además una alta correlación entre los genes detectados por los dos métodos. Sin embargo, un estudio reciente sobre la microglia humana no detectó la activación genética en la enfermedad de Alzheimer15. Por lo tanto, en ciertos contextos, snRNA-Seq es una alternativa adecuada para scRNA-Seq16,17. Además, el aislamiento nuclear se puede utilizar para ATAC-Seq de una sola célula, proporcionando información sobre las regiones de cromatina abierta dentro de células individuales.
El protocolo para el aislamiento de núcleos implica tres pasos principales: i) la lelisis a base de detergente de la membrana celular para liberar el núcleo; ii) homogeneización del tejido utilizando un homogeneizador Dounce; y iii) enriquecimiento de núcleos y eliminación de residuos celulares utilizando centrifugación de gradiente o citometría de flujo18,19,20,21,22. Entre esto, los dos primeros pasos dependen del tipo de tejido y necesitan ser optimizados empíricamente. El detergente suave conduce a la ruptura parcial de la membrana celular y a la recuperación ineficiente de los núcleos del tejido23. Por otro lado, el alto nivel de detergente y la homogeneización dura conduce a la ruptura de la membrana nuclear y su pérdida24,25. Los núcleos rotos tienden aún más a agruparse y formar agregados, que si no se eliminan pueden conducir a artefactos en el experimento de generación de perfiles aguas abajo.
Para evitar los problemas relacionados con la optimización del detergente para el aislamiento de núcleos, introducimos un protocolo para aislar los núcleos intactos de muestras frescas utilizando un método sin detergente y basado en columnas de espín. El protocolo produce núcleos de todo el órgano en 20 minutos, lo que limita la inducción de la transcripción artefacto. Los núcleos aislados se pueden enriquecer con FACS para ARN-Seq. y ATAC-seq de un solo núcleo, proporcionando un método simple y universal que permite un perfilado de alto rendimiento robusto y reproducible.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>90604-29-8</td>
			<td>Albumin fraction V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-14C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (5 mL )</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Polystyrene round bottom test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle (250 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>215-1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottomed dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD3510-100</td>
			<td>Fluorodish 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette socket</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>388.1</td>
			<td>Pipetting aid pi-pump 2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst staining dye solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228551</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit</td>
			<td>Invent Biotechnologies</td>
			<td>NI-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (30 mm)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>11333704</td>
			<td>Pyrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (90 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>758-10178-CS</td>
			<td>Gosselin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079</td>
			<td>10 &#956;L, 200 &#956;L, 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td>Pipetman</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>7981809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
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			<td>Vortex machine</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
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nuclei isolation from whole tissue using a detergent and enzyme-free method

El perfilado de transcriptoma y epigenoma de alto rendimiento requiere la preparación de una sola célula o una sola suspensión de núcleos. La preparación de la suspensión con células o núcleos intactos implica disociación y permeabilización, pasos que pueden introducir ruido no deseado y daños indeseables. Particularmente, ciertos tipos de células como las neuronas son difíciles de disociar en células individuales. Además, la permeabilización de la membrana celular para liberar núcleos requiere optimización por ensayo y error, que puede ser lento, laborioso y financieramente inviable. Para mejorar la robustez y reproducibilidad de la preparación de muestras para la secuenciación de alto rendimiento, describimos un método de aislamiento rápido basado en columnas y enzimas libres de detergentes. El protocolo permite un aislamiento eficiente de los núcleos de todo el cerebro de pez cebra en 20 minutos. Los núcleos aislados muestran morfología nuclear intacta y baja propensión a agregar. Además, la citometría de flujo permite el enriquecimiento de núcleos y el aclaramiento de desechos celulares para su aplicación posterior. El protocolo, que debe funcionar en tejidos blandos y células cultivadas, proporciona un método simple y accesible para la preparación de muestras que se puede utilizar para la elaboración de perfiles de alto rendimiento, simplificando los pasos necesarios para experimentos exitosos de ARN-seq y ATAC-seq de un solo núcleo.

--El protocolo descrito anteriormente se utilizó para generar la suspensión de un solo núcleo directamente a partir del tejido cerebral del pez cebra. El aislamiento normalmente requiere 20 minutos y evitar el uso de detergente o enzima digestiva. En la Figura 1,que se puede imprimir para que se utilice como orientación, se proporciona un esquema que resume los pasos individuales del protocolo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del método basado en columnas giratorias sin detergente para el aislamiento de núcleos. Representación gráfica de los pasos individuales realizados durante la extracción de núcleos a partir de tejido cerebral de pez cebra fresco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Visualización de la morfología nuclear
Para la confirmación cualitativa de la morfología nuclear, los núcleos aislados se tiñeron con Hoechst y se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia. Los núcleos aparecieron intactos, redondos y bien separados(Figura 2). Es importante destacar que la agregación nuclear, un signo de ruptura de la membrana nuclear, estaba ausente.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig02.jpg"> Figura 2: Aislamiento de núcleos únicos del cerebro de pez cebra. Imagen de microscopía de fluorescencia de núcleos manchados de Hoechst demostrando su morfología intacta. Barra de escala: 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Enriquecimiento basado en FACS de los núcleos intactos
El enriquecimiento de núcleos aislados y la eliminación de desechos celulares se realizó mediante citometría de flujo mediante el gating en presencia de una señal de fluorescencia Hoechst. La señal Hoechst se detectó al excitar con violeta, 405 nm, láser (Violeta brillante 421 – BV421). Los núcleos sin mancha mostraban fluorescencia de fondo (Figura 3A, Figura complementaria 1A), mientras que los núcleos manchados mostraban una fuerte señal fluorescente ( Figura3B, Figura complementaria 1B). Como se ilustra en la Figura 3C,los núcleos no manchados y teñidos de Hoechst estaban bien segregados en el canal violeta.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig03.jpg"> Figura 3: Los núcleos aislados muestran una señal fluorescente Hoechst fuerte y específica en la citometría de flujo. Gráficas de histograma para suspensión de núcleos individuales que muestran la distribución de la tinción Hoechst. Hoechst se excita por violeta, 405 nm, láser (Brillante Violeta 421 – BV421). La muestra no manchada (A) muestra la señal en el rango de 100-103, mientras que los núcleos manchados de Hoechst (B) emiten señal en el rango 103-105. Una superposición de intensidad de fluorescencia emitida por muestras no mantenidas (grises) y manchadas (azul) (C) demuestra una clara separación entre las dos poblaciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471supfig01v2.jpg"> Figura complementaria 1: Estrategia de medición de la citometría de flujo para núcleos aislados. Gráficas de flujo representativas para la suspensión aislada de núcleos. Los núcleos aislados se analizaron utilizando la dispersión hacia adelante y el láser violeta BV421, que excita a Hoechst a 405 nm. La muestra no mantenida (A) mostró la señal BV421 en el rango 100-103. De 13130 eventos, se detectaron 141 eventos como núcleos únicos basados en FSC-A (1,07% del total) y 0 eventos para núcleos no manchados basados en la señal BV421 (0% del total). Los núcleos manchados Hoechst (B) mostraron la señal BV421 en el rango 103-105. De los 50000 eventos, se detectaron 2418 eventos como núcleos únicos basados en FSC-A (4,84% del total) y 2414 eventos para núcleos positivos de Hoechst basados en la señal BV421 (4,83% del total). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471supfig01.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>

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Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

El aislamiento de núcleos individuales se basa en la disociación y la permeabilización basada en detergente de la membrana celular, pasos que necesitan optimización y son propensos a introducir artefactos técnicos. Demostramos un protocolo libre de detergente y enzimas para el aislamiento rápido de núcleos intactos directamente de todo el tejido, produciendo núcleos adecuados para ARN-seq de un solo núcleo (snRNA-Seq) o ATAC-seq.

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

La preparación de una sola célula o una sola suspensión de núcleos es un paso crítico para el perfilado de transcriptoma y epigenoma de alto rendimiento. Nuestro protocolo proporciona un método simple, reproducible y universal para el aislamiento de núcleos únicos. A diferencia de otros métodos que requieren detergente para el aislamiento de núcleos, nuestro protocolo está basado en columnas, que es detergente y libre de enzimas.Permite el aislamiento de núcleos en menos de 30 minutos. Nuestro protocolo simplifica el aislamiento de los núcleos. Proporciona un método robusto para preparar la suspensión de un solo núcleo a partir de tejidos difíciles de disociar.Para empezar, pre-enfríe el tampón A y B de un kit de aislamiento de núcleos libre de detergente colocándolos sobre hielo durante al menos 30 minutos. Recubrir tubos y puntas de pipeta con solución 5%BSA, lo que mejorará la recuperación de los núcleos. Para cubrir las puntas de la pipeta, pipetee la solución 5%BSA de dos a tres veces y séquelas al aire durante dos horas.Para recubrir los tubos, llénelos con BSA e inviertalos tres veces. Retire la solución y seque al aire los tubos boca abajo en un papel de tejido limpio durante dos horas. Recubrir un tubo de recogida y un tubo de 1,5 mililitros por muestra.Utilice fórceps para abrir suavemente el cráneo y eliminar los tejidos blandos, la piel y los huesos de los lados ventral y dorsal del cráneo. Luego transfiera suavemente el cerebro a un plato de 30 milímetros que contenga PBS helado y picar el cerebro en trozos pequeños usando una cuchilla de afeitar. Para aislar núcleos individuales, transfiera el tejido picado al cartucho de filtro suministrado en el kit de aislamiento de núcleos y elimine el exceso de solución y agregue 200 microlitros de tampón frío A.Grind el tejido con una varilla de plástico durante dos minutos.Agregue 300 microlitros de tampón frío A al cartucho del filtro e inci injeguelo con la tapa abierta durante 10 minutos. A continuación, tapone el cartucho y resuspender el tejido invirtiendo el tubo cinco veces. Centrifugar el tubo de muestra a 16.000 veces g durante 30 segundos para romper las células.El flujo a través contiene núcleos intactos, que forman un pellet incoloro en la parte inferior del tubo. Deseche el filtro y luego resuspender el pellet por vórtice vigorosamente durante 10 segundos. Pele el núcleo de nuevo centrifugando la solución a 500 veces g durante tres minutos.A continuación, deseche cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender el pellet en 0,8 mililitros de tampón frío B pipeteando de dos a tres veces y centrifugar los núcleos a 600 veces g durante 10 minutos, lo que los separará de los desechos de la membrana. Deseche cuidadosamente el sobrenadante.Resuspender los núcleos aislados en 500 microlitros de PBS con 5%BSA y mantener la suspensión sobre hielo hasta FACS. Para confirmar la morfología nuclear con tinción HEX, transfiera 100 microlitros de la suspensión de núcleos individuales a un tubo nuevo utilizando las puntas recubiertas de BSA. Manche los núcleos añadiendo 0,1 microlitrotro de HEX y vórtice suavemente el tubo.Transfiera la suspensión de núcleos a una placa inferior de vidrio y la imagen de los núcleos utilizando un microscopio de fluorescencia con un ajuste de excitación láser de 405 nanómetros. Antes de realizar FACS, filtre los núcleos con un colador celular de 40 micrómetros en un tubo recubierto de BSA. Diluir la suspensión filtrada añadiendo PBS con 5%BSA a un volumen final de 1.000 microlitros.Etiqueta dos tubos FACS inferiores redondos como control y teñidos y transfieren 250 microlitros de la suspensión de núcleos al tubo de control utilizando una punta de pipeta recubierta de BSA. Transfiera los 750 microlitros restantes de la solución al tubo FACS etiquetado como teñido y agregue un microlitros de tinte HEX para manchar los núcleos. A continuación, mezclarlo por vórtice lento.Cargue el ejemplo de control no detenido en el clasificador de celdas y registre 5.000 eventos. A continuación, cargue la muestra manchada y registre 5.000 eventos. Dibuje puertas FACS para la identificación de núcleos individuales.Los núcleos se pueden seleccionar comparando la señal fluorescente HEX entre las muestras de control y manchadas. A continuación, clasifúle núcleos positivos HEX del tubo teñido en un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga 50 microlitros de PBS con 5%BSA. Este protocolo se utilizó para generar la suspensión de un solo núcleo directamente a partir del tejido cerebral del pez cebra.Los núcleos aislados se teñiron con HEX y se visualizaron con microscopía de fluorescencia. Aparecieron intactos, redondos y bien separados. Es importante destacar que la agregación nuclear estaba ausente.El enriquecimiento de núcleos aislados se realizó con citometría de flujo mediante el gating en la presencia de una señal fluorescente HEX. Los núcleos sin mancha mostraban fluorescencia de fondo mientras que los núcleos manchados mostraban una fuerte señal de fluorescencia. Los núcleos sin manchar y manchados estaban bien segregados en el canal violeta.Al intentar este protocolo, es importante recordar que los núcleos individuales tienden a pegarse en un material plástico. Para evitar la posible pérdida de núcleos y aumentar la eficiencia, se recomienda el recubrimiento básico del material plástico. La suspensión aislada de núcleos individuales se puede utilizar aún más para el ARN de núcleos individuales Esta técnica aclara la heterogeneidad celular en sistemas biológicos complejos y ayuda a definir subtipos celulares y redes génicas.El uso de un método libre de enzimas y detergente registra el ruido técnico y el sesgo introducidos durante la preparación de la muestra. Este método ha desarrollado un aislamiento simplificado y logístico de un solo núcleo.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Investigación

Biología

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Método para la tinción de anticuerpos enteros en el monte del polluelo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Aislamiento de ARN de ratón Páncreas: Un tejido de ribonucleasa-rica

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

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Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Aislamiento de neutrófilos humanos de sangre entera y buffy coats

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Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

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Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias

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