Name: nuclei isolation from whole tissue using a detergent and enzyme-free method
Uploaded: 2020-06-24T14:00:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method at JoVE.com

Vi tackar medlemmar av Dr Sabine Costagliola och Singh lab för kommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöddes av Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS under Grant nummer 34772792 - MISU till S.P.S.

Alla förfaranden som presenteras nedan utfördes i enlighet med institutionella (Université Libre de Bruxelles (ULB)) och nationella riktlinjer och förordningar om etiskt och djurskydd, som godkändes av den etiska kommittén för djurskydd (CEBEA) från Université Libre de Bruxelles (protokollen 578N-579N).
1. Beredning före dissekering av vävnader
<ol><li>Förbered 0,2% Tricaine lösning i PBS för avlivning av zebrafisk. Kyl lösningen på is.</li>
	<li>Förbered en 30 mm petriskål för malning av vävnaden.</li>
	<li>Förbered iskall 1x PBS (10 ml per vävnadsprov).</li>
	<li>Kyl centrifugen till 4 °C.</li>
	<li>För isolering av kärnor, använd en tvättmedelsfri isoleringssats för kärnor (Tabell över material).</li>
	<li>Innan protokollet påbörjas ska bufferten A och B före kylningen som finns i satsen placeras på is i minst 30 minuter före isolering av kärnor.</li>
	<li>För hantering av isolerade kärnor, belägga plastreagenser som rör och pipettspetsar med 5% BSA-lösning. För detta, förbered lösningen genom att lösa upp 2 g BSA i 40 ml PBS. Beläggning av plastartiklar med 5% BSA minskar kärnorna fastnar på plast. Detta steg förbättrar återvinningen av isolerade kärnor.</li>
	<li>Täck pipettspetsarna genom pipettering 5% BSA-lösning 2-3 gånger. Lufttorka tipsen i 2 timmar. Förbered 10 plasttips per prov.</li>
	<li>Täck rören för insamling av kärnor genom att fylla dem med 5% BSA. Vänd rören 3 gånger för att säkerställa en effektiv beläggning. Ta bort lösningen och lufttorka rören upp och ner på ett rent mjukpapper i 2 timmar. Per prov, coat ett uppsamlingsrör som finns i satsen. Förbered dessutom belagda 1,5 ml-rör för kärnors uppsamling efter FACS. OBS: Glasspetsar rekommenderas starkt alternativ till plastpipetsarna för att minimera fastnar.</li>
</ol>2. Dissekering av zebrafisk hjärna
<ol><li>För att avliva zebrafisken, förbered en 90 mm petriskål med 25 ml iskall Tricaine-lösning.</li>
	<li>Ta försiktigt zebrafisken från tanken med hjälp av ett fiskenät och placera den i petriskålen.</li>
	<li>Avliva fisken genom att lämna den i Tricaine i 5 min.</li>
	<li>Halshugga djuret med ett vasst rakblad.</li>
	<li>Med hjälp av pincett, försiktigt bryta upp skallen och ta bort mjuka vävnader, hud och ben från ventrala och dorsala sidan av skallen.</li>
	<li>Försiktigt, överför hjärnan till en färsk 30 mm maträtt som innehåller iskall PBS.</li>
	<li>Finhacka hjärnan i små bitar med ett rakblad för att underlätta belastningen av provet på spinnkolumnen.</li>
</ol>3. Enda isolering av kärnor
<ol><li>Överför den malda vävnaden till filterpatronen som finns i kärnisoleringssatsen och tillsätt 200 μl kallbuffert A för att sensibilisera vävnaden. Slipa vävnaden med hjälp av plaststången som tillhandahålls av satsen i 2 min.</li>
	<li>Tillsätt 300 μL kallbuffert A och inkubera filterpatronen på is med lock öppet i 10 min.</li>
	<li>Täck patronen och återsuspend vävnaden genom att invertera röret 5 gånger.</li>
	<li>Centrifug på 16.000 x g för 30 s. I detta steg, celler brusten när de passerar genom filtret och hög hastighet centrifugalkraft appliceras. Flödet genom innehåller intakta kärnor, som pellet längst ner i röret.</li>
	<li>Kassera filtret och resuspend pelleten genom att virvla kraftigt i 10 s.</li>
	<li>Pellet kärnorna genom centrifuging lösningen på 500 x g i 3 min. Kassera supernatanten försiktigt eftersom kärnkulan pelleten är färglös.</li>
	<li>Resuspend pelleten i 0,8 ml kallbuffert B och centrifug på 600 x g i 10 min. I detta steg är kärnor separerade från membranskräp. Den färglösa pelleten som erhålls innehåller isolerade kärnor.</li>
	<li>Resuspend den isolerade kärnorna i 500 μL PBS med 5% BSA. Håll kärnfjädringen på is för att utföra FACS efter kvantifieringen.</li>
</ol>4. Visualisering av kärnormorfologi
<ol><li>Bekräfta kärnmorfologi genom Hoechst färgning. För detta, ta bort 100 μL enstaka kärnfjädring i ett nytt rör med BSA-belagda spetsar. För att färga kärnorna, tillsätt 0,1 μl Hoechst (1 mg/ml). Vänd försiktigt röret.</li>
	<li>Överför kärnfjädringen till glasbottensskålen för bildbehandling.</li>
	<li>Bild kärnorna med hjälp av en fluorescens mikroskop med laser excitation inställningar ~ 405 nm (Violet) våglängd.</li>
</ol>5. FACS-baserad anrikning av kärnor
<ol><li>Innan du utför FACS, filtrera kärnorna med en 40 μm cellsil i BSA-belagt rör.</li>
	<li>Späd den filtrerade suspensionen genom att tillsätta PBS med 5% BSA till en slutlig volym på 1 000 μL.</li>
	<li>Märk två runda botten FACS rör som "kontroll" och "färgade". Den "kontroll" röret kommer att innehålla un-färgade kärnor, medan "färgade" röret kommer att ha Hoechst färgade kärnor.</li>
	<li>Överför 250 μL av kärnfjädringen till "kontrollröret" med BSA-belagt pipettspets.</li>
	<li>Överför den återstående 750 μL-lösningen till FACS-röret märkt som "färgat" och tillsätt 1 μl Hoechst-färgämne för att färga kärnorna. Blanda genom långsam virvel.</li>
	<li>Läs in det ofläckade kontrollprovet till cellsorteringen. Spela in 5000 händelser.</li>
	<li>Ladda de färgade proverna och spela in 5000 händelser.</li>
	<li>Rita FACS-grindar som gör det möjligt att identifiera enstaka kärnor. Kärnor kan väljas genom att jämföra Hoechst fluorescenssignalen mellan kontroll och färgat prov.</li>
	<li>Sortera Hoechst-positiva kärnor från det färgade röret till nytt 1,5 ml-rör som innehåller 50 μl PBS med 5% BSA. OBS: Isolerade kärnor kan samlas in i ett önskat medium enligt kraven i nedströmsapplikationen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells.">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+characterization+of+ovine+mesenchymal+stem+cells.">Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells.</a> Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).</li><li>Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crude+collagenase+loses+islet-isolating+efficacy+regardless+of+storage+conditions.">Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions.</a> Transplantation Proceedings. 29 (4), 1942-1944 (1997).</li><li>Massoni-Badosa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+artifacts+in+single-cell+genomics+cohort+studies.">Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Van Den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumour+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Bioarxiv. 683227, (2019).</li><li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types.">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> Plos One. 13 (12), 0209648 (2018).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Rajbhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+reveals+immune+cell-adipocyte+crosstalk+regulating+the+transcription+of+thermogenic+adipocytes.">Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney:+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis.">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-13 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Thrupp, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleus+sequencing+fails+to+detect+microglial+activation+in+human+tissue.">Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Selewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Comparison+of+High-throughput+Single-Cell+and+Single-Nucleus+Transcriptomes+during+Cardiomyocyte+Differentiation.">Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Birnie, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Nuclei+from+Animal+Cells+in+Culture.">Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture.</a> Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).</li><li>Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+isolating+intact+mitochondria+and+nuclei+from+the+same+homogenate,+and+the+influence+of+mitochondrial+destruction+on+the+properties+of+cell+nuclei.">A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).</li><li>Hymer, W. C., Kuff, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Nuclei+From+Mammalian+Tissues+Through+the+Use+of+Triton+X-100.">Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100.</a> The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).</li><li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergents:+Triton+X-100,+Tween-20,+and+More.">Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More.</a> Materials and Methods. 3, (2013).</li><li>Sikorskaite, S., Rajam&#228;ki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+Optimised+methodology+for+isolation+of+nuclei+from+leaves+of+species+in+the+Solanaceae+and+Rosaceae+families.">Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families.</a> Plant Methods. 9 (1), 31 (2013).</li><li>Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Subcellular fractionation: a practical approach. , (1997).</li></ol>

Författarna har ingen intressekonflikt. Betalningen för att göra artikeln öppen tillgång gjordes av Invent Biotechnologies Inc., USA.

Profilering av transkriptom och epigenom vid en encellig upplösning har revolutionerat studiet av biologiska system. Studier vid upplösningen av en enda cell för en fast vävnad beror på dissociation av organet i enskilda celler eller kärnor. Dissociation är ett destruktivt förfarande som kan införa tekniska artefakter, vilket kan förhindra utveckling av en korrekt representation av systemet5,6. Till exempel, enzymatisk dissociation kan skada celler med komplexa morfologier, såsom nervceller eller podocyter, och kan framkalla uttryck för stress och värme-chock respons gener7,12. Dessutom kan användning av tvättmedel under dissociation brista kärnmembranet och leda till aggregering23,25. Således, optimera dissociation för att få en enda cell eller kärnor suspension av högsta kvalitet är avgörande för framgången för hög genomströmning profilering experiment.
Här demonstrerar vi en tvättmedels- och enzymfri kärnisoleringsmetod som möjliggör extraktion av intakta kärnor från zebrafiskhjärna på mindre än 20 minuter. Protokollet ger kärnor med typisk morfologi och robust integritet (figur 2). Från en enda zebrafisk hjärna väger 6 mg, protokollet ger totalt 60.000 kärnor bestäms av en hemocytometer räkna. De isolerade kärnorna kan användas för flera nedströmsapplikationer, inklusive snRNA-seq, ATAC-seq och immunostaining. De isolerade kärnorna kan inkludera korskontaminering från cytoplasmatiska fraktioner, särskilt från komponenter av endoplasmatiska reticulum och mitokondrierna. För hög genomströmning profilering experiment, clearance av cellulära skräp, särskilt mitokondrierna, rekommenderas starkt. Flödescytometri (figur 3) ger ett lönsamt alternativ för rening av kärnor. Alternativt kan sackaros gradienten också användas för avlägsnande av skräp.
Protokollet har testats på mus sköldkörtel (data visas inte) och ger resultat som liknar zebrafish hjärnvävnad. Sammantaget ger protokollet en robust, reproducerbar och universell metod för förberedelse av single nucleus suspension, vilket hjälper till att förenkla logistiken för hög genomströmningsprofileringsexperiment.

Single-cell RNA-seq (scRNA-Seq) och ATAC-seq är mångsidiga verktyg för att studera komplexa biologiska system med encellig upplösning. De används allmänt för att definiera cell subtyper och tillstånd, gennätverk och att bedöma cellulär heterogenitet. En förutsättning för att utföra scRNA-seq är beredningen av en enda cell suspension genom vävnad dissociation. På grund av variationen i den extracellulära matrissammansättningen och mekaniska egenskaper kräver enskilda vävnader optimering av dissociationsprotokollet för beredning av single cell suspension.
Dissociation av vävnader till enstaka celler innebär vanligtvis behandling med matsmältningsenzymer, inklusive kollagen, dispase eller trypsin, vid 37 °C1,2,3,4. Eftersom transkriptionsmaskiner förblir aktiva vid 37 °C kan enzymatisk dissociation införa mRNA-uttrycksartefakter och buller5,6. Framför allt kan långvarig inkubation framkalla stressresponsiva gener och värmechocksrespons på ett ojämnt sätt – vilket leder till tekniska variationer i experimentet7.
En annan nackdel med att generera en enda cell suspension är svårigheten att få livskraftiga och intakta cell-typer med komplexa morfologier. I synnerhet är nervceller, adipocyter och podocyter utmanande att isolera8,,9,,10,11. Till exempel, Wu och kollegor visade avsaknaden av glomerular podocytes i scRNA profiler från en vuxen mus njure12. Liknande icke-optimala observationer har gjorts när det gäller återvinning av sammankopplade nervceller från hjärnvävnad8,,13,14. Sammanfattningsvis kan dissociation protokoll införa upptäckt bias mot lättare att separera cell-typer, vilket leder till en förvrängning av cellulära arkitektur av organet.
För att övervinna det tekniska brus och bias som infördes under provberedning i scRNA-Seq., isolering och profilering kärnan ger ett attraktivt alternativ. Eftersom nukleär morfologi är liknande mellan olika celltyper, isolering av kärnorna kringgår frågan om att isolera intakta och livskraftiga celler med komplexa morfologier. Till exempel visade Wu och kollegor framgångsrik profilering av glomerular podocytes med enkärnan RNA-Seq. (snRNA-Seq.) av en vuxen mus njure, som saknades från scRNA-Seq12. Spännande, jämförande studier mellan encelliga och enstaka kärnan RNA-seq har föreslagit en minskning av induktion av stress och värme-chock respons gener med snRNA-Seq12. Studierna tyder vidare på en hög korrelation mellan de gener som detekteras av de två metoderna. Emellertid, en nyligen genomförd studie på mänskliga mikroglia misslyckades med att upptäcka genetisk aktivering vid Alzheimers sjukdom15. Således i vissa sammanhang är snRNA-Seq ett lämpligt alternativ för scRNA-Seq16,17. Dessutom kan den nukleära isoleringen användas för encelliga ATAC-Seq., som ger information om regionerna av öppen kromatin inom enskilda celler.
Protokollet för kärnisolering omfattar tre huvudsteg: i) tvättmedelsbaserad lys av cellmembranet för att frigöra kärnan; ii) vävnadshomogenisering med hjälp av en Dounce-homogenisator. och iii) anrikning av kärnor och avlägsnande av cellskräp med hjälp av gradientcentrifugering eller flödescytometri18,,19,,20,,21,22. Bland detta beror de två första stegen på vävnadstypen och måste empiriskt optimeras. Milt rengöringsmedel leder till partiell bristning av cellmembran och ineffektiv hämtning av kärnor från vävnaden23. Å andra sidan leder hög tvättmedel och hård homogenisering till bristning av det nukleära membranet och deras förlust24,25. Brusten kärnor tenderar ytterligare att klumpa ihop sig och bilda aggregat, som om inte tas bort kan leda till artefakter i nedströms profilering experiment.
För att kringgå de frågor som rör tvättmedel optimering för kärnor isolering, introducerar vi ett protokoll för att isolera intakta kärnor från färska prover med hjälp av en detergent-free och spin-kolumn-baserad metod. Protokollet ger kärnor från hela organet inom 20 minuter, vilket begränsar induktion av artifactual transkription. De isolerade kärnorna kan berikas med FACS för single-nuclei RNA-Seq. och ATAC-seq, vilket ger en enkel och universell metod som möjliggör robust och reproducerbar höggenomströmningsprofilering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>90604-29-8</td>
			<td>Albumin fraction V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-14C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (5 mL )</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Polystyrene round bottom test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle (250 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>215-1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottomed dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD3510-100</td>
			<td>Fluorodish 35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette socket</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>388.1</td>
			<td>Pipetting aid pi-pump 2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst staining dye solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228551</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit</td>
			<td>Invent Biotechnologies</td>
			<td>NI-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (30 mm)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>11333704</td>
			<td>Pyrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (90 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>758-10178-CS</td>
			<td>Gosselin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079</td>
			<td>10 &#956;L, 200 &#956;L, 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td>Pipetman</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>7981809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex machine</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclei isolation from whole tissue using a detergent and enzyme-free method

Hög genomströmning transkriptom och epigenom profilering kräver beredning av en enda cell eller enstaka kärnor suspension. Beredning av suspensionen med intakt cell eller kärnor innebär dissociation och permeabilisering, steg som kan införa oönskat buller och oönskade skador. Särskilt, vissa celltyper såsom nervceller är utmanande att separera till enskilda celler. Dessutom, permeabilization av det cellulära membranet för att frigöra kärnor kräver optimering av trial-and-error, vilket kan vara tidskrävande, arbetsintensiva och ekonomiskt nonviable. För att öka robustheten och reproducerbarheten hos provberedning för sekvensering med hög genomströmning beskriver vi en snabb enzym- och tvättmedelsfri pelarbaserad kärnisoleringsmetod. Protokollet möjliggör effektiv isolering av kärnor från hela zebrafiskhjärna inom 20 minuter. De isolerade kärnorna visar intakt nukleär morfologi och låg benägenhet att aggregera. Vidare, flöde cytometri tillåter kärnor anrikning och clearance av cellulära skräp för nedströms tillämpning. Protokollet, som bör fungera på mjuka vävnader och odlade celler, ger en enkel och tillgänglig metod för provberedning som kan användas för hög genomströmning profilering, förenkla de steg som krävs för framgångsrika single-kärnor RNA-seq och ATAC-seq experiment.

--Det protokoll som beskrivs ovan användes för att generera enstaka kärna suspension direkt från zebrafish hjärnvävnad. Isoleringen kräver vanligtvis 20 minuter och undvika användning av tvättmedel eller matsmältningsenzym. En schematisk sammanfattning av de enskilda stegen i protokollet finns i figur 1, som kan skrivas ut för att användas för vägledning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk av tvättmedelsfri spin-kolumnbaserad metod för isolering av kärnor. Grafisk representation av de enskilda steg som utförs under utvinning av kärnor från färska zebrafish hjärnvävnad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Visualisering av kärnmorfologi
För kvalitativ bekräftelse av kärn- morfologi, fläckades de isolerade kärnorna med Hoechst och visualized med hjälp av fluorescencemikroskopi. Kärnorna verkade intakta, runda och väl åtskilda (figur 2). Viktigt, nukleär aggregering, ett tecken på nukleära membran bristning, var frånvarande.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig02.jpg"> Figur 2: Enstaka kärnor isolering från zebrafisk hjärnan. Fluorescensmikroskopi bild av Hoechst-färgade kärnor visar deras intaktmorfologi. Skala bar: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
FACS-baserad anrikning av intakta kärnor
Anrikning av isolerade kärnor och avlägsnande av cellulära skräp utfördes genom flöde cytometri genom gating på förekomsten av en Hoechst fluorescens signal. Hoechst signalen upptäcktes vid excitation med violett, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 - BV421). Ofläckade kärnor visade bakgrundsfluorescens (figur 3A, Tilläggsbild 1A),medan färgade kärnor uppvisade stark fluorescerande signal (figur 3B, Tilläggsbild 1B). Som illustreras i figur 3C, den ofläckade och Hoechst färgade kärnor var väl segregerade i den violetta kanalen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig03.jpg"> Figur 3: Isolerade kärnor visar stark och specifik Hoechst fluorescerande signal i flödescytometri. Histogram tomter för enstaka kärnor suspension visar fördelningen av Hoechst färgning. Hoechst är upphetsad av violett, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Det ofläckade provet (A) visar signalen i intervallet 100-103, medan Hoechst färgade kärnor (B) avger signal i intervallet 10-1035. Ett överlägg av fluorescensintensitet som avges av ofläckade (grå) och färgade (blå) prover (C) visar en tydlig åtskillnad mellan de två populationerna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471supfig01v2.jpg"> Tilläggs figur 1: Flödescytometri gating strategi för isolerade kärnor. Representativa flödesritplaner för isolerad kärnfjädring. Isolerade kärnor analyserades med hjälp av framåt scatter och Violet laser BV421 som retar Hoechst på 405 nm. Det ofläckade provet (A) visade BV421-signalen i intervallet 100-103. Av 13130 händelser upptäcktes 141 händelser som enstaka kärnor baserade på FSC-A (1,07% av det totala antalet) och 0 händelser för ofläckade kärnor baserat på BV421-signal (0% av det totala). Hoechst-färgade kärnor (B) visade BV421-signalen i intervallet 103-105. Av 50000 händelser upptäcktes 2418 händelser som enstaka kärnor baserat på FSC-A (4,84% av det totala antalet) och 2414 händelser för Hoechst-positiva kärnor baserade på BV421-signal (4,83% av det totala). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471supfig01.jpg" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method at JoVE.com

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Enda atomkärna isolering bygger på dissociation och tvättmedel-baserade permeabilisering av cellmembranet, steg som behöver optimering och är benägna att införa tekniska artefakter. Vi visar ett tvättmedel och enzym-fria protokoll för snabb isolering av intakt kärnor direkt från hela vävnaden, vilket ger kärnor lämpliga för single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) eller ATAC-seq.

Kärnorolering från helvävnad med hjälp av ett rengöringsmedel och enzymfri metod

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Förbereda en enda cell eller enstaka kärnor suspension är ett kritiskt steg för hög genomströmning transkriptom och epigenome profilering. Vårt protokoll ger en enkel, reproducerbar, och universell metod för enkel kärnor isolering. I motsats till andra metoder som kräver tvättmedel för kärnor isolering, är vårt protokoll kolumn-baserade, som är tvättmedel och enzym-fri.Det möjliggör kärnor isolering på mindre än 30 minuter. Vårt protokoll förenklar nuklei-isoleringen. Det ger en robust metod för att förbereda enstaka kärnor suspension från svåra att dissociate vävnader.Till att börja med, pre-chill buffert A och B från en tvättmedel-fri kärnor isolering kit genom att placera dem på is i minst 30 minuter. Coat rör och pipett tips med 5%BSA lösning, som kommer att öka återvinning av atomkärnor. För att belägga pipettspetsarna, pipettera 5%BSA-lösning två till tre gånger och lufttorka dem i två timmar.För att belägga rören, fyll dem med BSA och invertera dem tre gånger. Ta bort lösningen och lufttorka rören upp och ner på ett rent mjukpapper i två timmar. Coat en samlingsrör och en 1,5 milliliter tub per prov.Använd forceps för att försiktigt bryta upp skallen och ta bort mjuka vävnader, hud och ben från de ventrala och dorsala sidorna av skallen. Sedan försiktigt överföra hjärnan till en 30 millimeters maträtt som innehåller iskall PBS och hacka hjärnan i små bitar med hjälp av ett rakblad. För att isolera enstaka kärnor, överför den malda vävnaden till filterpatronen som finns i isoleringssatsen för kärnor och avlägsna överflödig lösning och tillsätt 200 mikroliter av kallbuffert A.Slipa vävnaden med en plaststav i två minuter.Tillsätt 300 mikroliter kallbuffert A till filterpatronen och inkubera den på is med locket öppet i 10 minuter. Sedan locket patronen och återanvända vävnaden genom att vända röret fem gånger. Centrifugera provröret vid 16, 000 gånger g i 30 sekunder för att brista cellerna.Genomflödet innehåller intakta kärnor, som bildar en färglös pellet i botten av röret. Kassera filtret och sedan återanvänd pelleten genom att virvel kraftigt i 10 sekunder. Pellet kärnorna igen genom att centrifugera lösningen vid 500 gånger g i tre minuter.Sedan försiktigt kasta supernatanten. Resuspend pelleten i 0,8 milliliter av kall buffert B genom pipettering två till tre gånger och centrifug kärnorna på 600 gånger g i 10 minuter, som kommer att skilja dem från membranet skräp. Kassera supernatanten försiktigt.Resuspend den isolerade atomkärnor i 500 mikroliter av PBS med 5%BSA och hålla suspensionen på is tills FACS. För att bekräfta kärnmorfologi med HEX-färgning, överför 100 mikroliter av den enda kärnor suspensionen till ett nytt rör med hjälp av BSA belagda tips. Stain kärnorna genom att lägga till 0,1 mikroliter av HEX och försiktigt virvelning röret.Överför atomkärnor suspensionen till en glas botten skålen och bild av atomkärnor med hjälp av en fluorescens mikroskop med en laser excitation inställning av 405 nanometer. Innan du utför FACS, filtrera atomkärnorna med en 40 mikrometer cell sil i en BSA belagda röret. Späd den filtrerade upphängningen genom att addera PBS med 5%BSA till en slutlig volym på 1, 000 mikroliter.Märk två runda botten-FACS-rör som kontroll och färgas och överföra 250 mikroliter av kärnor suspensionen i kontrollröret med hjälp av en BSA-belagd pipett spets. Överför de återstående 750 mikroliter av lösningen till FACS röret märkt färgade och tillsätt en mikroliter AV HEX färgämne att färga atomkärnor. Blanda det sedan genom långsam virvelning.Ladda det ej besvakna kontrollprovet i cellsorteraren och spela in 5, 000 händelser. Ladda sedan det färgade provet och spela in 5, 000 händelser. Rita FACS-portar för identifiering av enstaka kärnor.Kärnor kan väljas genom att jämföra HEX-lysrörssignalen mellan reglaget och färgade prover. Sortera sedan HEX-positiva kärnor från det färgade röret till ett nytt 1,5 milliliterrör som innehåller 50 mikroliter PBS med 5%BSA. Detta protokoll användes för att generera enda kärnan suspension direkt från zebrafish hjärnvävnad.De isolerade atomkärnor var färgas med HEX och visualiseras med fluorescence mikroskopi. De verkade intakta, runda och väl åtskilda. Viktigt, kärnkraft aggregering var frånvarande.Anrikning av isolerade atomkärnor utfördes med flödescytometri genom gating på förekomsten av en HEX fluorescerande signal. Unstained kärnor visas bakgrund fluorescens medan färgade kärnor uppvisade stark fluorescens signal. De obefläckade och färgade atomkärnor var väl segregerade i den violetta kanalen.Medan du försöker detta protokoll, det är viktigt att komma ihåg att enskilda kärnor tenderar att hålla sig på ett plastmaterial. För att förhindra den potentiella förlusten av kärnor och öka effektiviteten rekommenderas det starkt med grundbeläggning av plastmaterialet. Isolerade enda kärnor suspension kan ytterligare utnyttjas för enstaka kärnor RNA Denna teknik belysa cellulära heterogenitet i komplexa biologiska system och hjälpa till att definiera cell subtyper och nätverk gen.Med hjälp av en tvättmedel och enzymfri metod registrerar det tekniska buller och bias som infördes under provberedningen. Denna metod har utvecklat en förenklad och logistisk enda kärnor isolering.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronal Nuclei Isolering från Human obduktion hjärnvävnad

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Metod för hela berget antikropp färgning i Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primära Myofibroblaster från mus och Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA Isolering från mus Pankreas: En Ribonuclease rika Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering och Funktionell analys av mitokondrier från odlade celler och mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D vit fettvävnad struktur med hjälp av hela-mount färgning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Isolering av mänskliga neutrofiler från helblod och buffyrockar

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Kärnisolering från vuxen musnjure för RNA-sekvensering med en kärna

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolering och analys av spårbara och funktionaliserade extracellulära vesiklar från plasma och fasta vävnader

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobule lipiddroppisolering från växtbladvävnad och cyanobakterier

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...