Name: rna interference in aquatic beetles as a powerful tool for manipulating gene expression at specific developmental time points
Uploaded: 2020-05-29T15:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points at JoVE.com

Wir danken Dr. Josh Benoit für seine Unterstützung bei der Bioinformatik Hailey Tobler für ihre Hilfe bei der Aufzucht von Sunburst Diving Beetles und Tamara Pace für redaktionelle Unterstützung. Diese Forschung wurde von der National Science Foundation unter den Stipendien IOS-1456757 und IOS-1856341 an EKB und IOS1557936 an YT unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Unser Ziel ist es, dass diese Zusammenstellung von Methoden RNAi weit verfügbar machen wird, zumal dieses Tool eine leistungsstarke synergistische Technik zur CRISPR/Cas9-basierten Genbearbeitung bleibt, mit dem Vorteil, dass es auf die gewünschten Entwicklungsstadien untersuchter Organismen angewendet werden kann. Um diese Stärke zu veranschaulichen, injizierten wir dsRNA in Embryonen und in verschiedene Larvenstadien. Injektionen in Eier beeinflussten die Entwicklung von Embryonen (Abbildung 2), Injektionen in das zweite Larvenstadium hatten offensichtliche Auswirkungen auf das dritte Larvenstadium (Abbildung 4 und Abbildung 6), und Injektionen in das dritte Larvenstadium zeigten Effekte bei Den Erwachsenen (Abbildung 5). Während der genaue Zeitpunkt experimentell festgelegt werden muss, in der Regel, Injektionen wirksam innerhalb von ein paar Tagen. Der Erfolg dieses Prozesses kann durch die Länge der dsRNA-Sequenz beeinflusst werden. Hier präsentierten wir Beispiele mit etwas mehr als 200 bp bis über 800 bp. In der Regel werden Sequenzen zwischen 100 und 600 bp bevorzugt, um Off-Target-Effekte zu begrenzen, aber Sequenzen bis zu 1000 bp ergeben gute Ergebnisse22. Eine Frage in Bezug auf RNAi ist die Dauer des Knockdown, die durch diese Technik erreicht werden kann. Da die Phänotypen in jeder Phase terminal waren, können wir dieses Problem nicht auf der Grundlage unserer vorgestellten Ergebnisse kommentieren. Jedoch, Es wurde zuvor festgestellt, dass RNAi-Effekte sind in der Regel relativ langlebig, und dass höhere Konzentrationen führen zu länger anhaltenden Knockdowns20.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass es für einige Organismen besser funktioniert als für andere, und es scheint keine direkte Möglichkeit zu geben, vorherzusagen, wie gut es a priori funktionieren wird. Dennoch hat sich herausgestellt, dass es für eine Vielzahl von verschiedenen Organismen gut funktioniert. Innerhalb der Arthropoden, dies umfasst Arachniden26, Krebstiere27, und eine Vielzahl von Insekten, mit besonders hohen Erfolgsraten bei Käfern28. Eine weitere Komplikation ist, dass Unterschiede in der Phänotyp-Schwere oft zwischen Individuen auftreten, trotz der Anwendung der gleichen Menge an dsRNA. Wie in Abbildung 2Bdargestellt, kann es sogar innerhalb eines Individuums zu Abweichungen kommen. In unseren RNAi-Studien, die auf verschiedene Gene abzielen, die an der Entwicklung von T. marmoratus Larvenaugen beteiligt sind, haben wir häufig festgestellt, dass einige Augen stärker betroffen sind als andere. Dieses Phänomen kann mit dem relativ dichten Gewebe des Augenhaufens zusammenhängen, wobei die dsRNA besser in der Lage ist, einige der Einheiten zu erreichen.
Für die erfolgreiche Durchführung von RNAi-Experimenten ist es entscheidend, dass mehrere Parameter für das Zielgen optimiert sind. Zum Beispiel kann die Konzentration der dsRNA und die Länge des Zielgens das Ergebnis stark beeinflussen20. Ein weiterer kritischer Parameter ist, wie die Injektionen ausgeführt werden, da dieser Prozess die Überlebensrate stark beeinflussen kann. Bei Embryonen erzielten wir die besten Ergebnisse, indem wir auf das Zentrum des Embryos zielten. Eine gut angelegte Platte ermöglicht die Injektion von 100 oder mehr Embryonen in einer einzigen Sitzung. Bei Larven ist es wichtig, die Injektionsnadel zwischen die Segmente einzufügen. Diese Injektionen erfordern mehr dsRNA, und basierend auf der Verfügbarkeit von Larven bestanden unsere Injektionssets hier in der Regel nur aus wenigen Tieren gleichzeitig. Bei allen Injektionen ist es wichtig, zu verhindern, dass Luft in den Organismus gelangt.
In einigen Fällen können die Rückkopplungsschleifen eines Genregulierungsnetzwerks und genetische Redundanz die Penetranz von RNAi-Phänotypen beeinflussen, trotz konsequenter Knockdowns. Dies scheint der Fall für unsere Verhaltensbeobachtungen von Larven mit sehr erfolgreichen Knockdowns eines prominenten Linsenproteins, Lens318, zu sein. Obwohl wir die hohe Effizienz dieser Knockdowns durch qPCR überprüften, wurden erhebliche Abweichungen bei den zugehörigen Phänotypen beobachtet. Dieses Ergebnis unterstreicht die Notwendigkeit einer ordnungsgemäßen Quantifizierung von RNAi-Knockdowns (Details zu Optionen siehe22). Wenn es keine klare a priori Erwartung in Bezug auf die resultierenden Phänotypen gibt, ist eine gute Möglichkeit, die Off-Target-Effekte von RNAi zu kontrollieren, das gleiche Gen mit zwei nicht überlappenden Sequenzen von dsRNA anzuvisieren und die Ergebnisse für gängige Phänotypen zu bewerten.
Im Gegensatz zu Gen-Editing-Techniken ist RNAi auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um tödliche Gene zu untersuchen, und es gibt zwei Möglichkeiten, dies zu tun. Wenn man zum Beispiel an dem funktionellen Beitrag eines Gens interessiert ist, bei dem der Funktionsverlust früh in der Entwicklung als tödlich bekannt ist, kann eine funktionelle Untersuchung eines solchen Gens erreicht werden, indem man dem Tier einfach erlaubt, sich normal zu entwickeln, und dann das Gen später in der Entwicklung (d. h. beim Erwachsenen) über RNAi niederschlägt. Alternativ kann ein Gen, bei dem der vollständige Funktionsverlust als tödlich bekannt ist, durch einen partiellen Knockdown untersucht werden, der durch Injektion einer Reihe von dsRNA-Konzentrationen erreicht werden kann. Einige unserer Ergebnisse zeigen Knockdowns von lac2, die bekanntermaßen tödlich sind, wenn die Nagelhaut bei Insekten zu weich wird24. Selbst der in Abbildung 5 abgebildete Lac2-RNAi-Käfer würde außerhalb der Laborbedingungen wahrscheinlich nicht überleben. lac2 Ein weiteres tödliches Gen wird geschnitten,das codes für einen Transkriptionsfaktor, der für die Zell-Fate-Spezifikation in verschiedenen Organsystemen in Arthropoden grundlegend ist und mit der Gliaentwicklung im Visuellen System Drosophila in Verbindung gebracht wurde29. Basierend auf unseren Erfahrungen mit geschnittenen RNAi in T. marmoratus Embryonen können wir informative Augenphänotypen in Embryonen evozieren, die in der Lage sind, ihre embryonale Augenentwicklung abzuschließen (unveröffentlichte Beobachtungen). Hier, höhere Dosierungen scheinen zu höheren Tödlichkeitsraten führen, während niedrigere Dosen führen in beobachtbaren und informativen Phänotypen.
Unser Protokoll listet nicht nur die notwendigen Schritte auf, damit ein Forscher RNAi-Experimente an T. marmoratusdurchführen kann, wie dargestellt, sondern ist auch allgemein auf andere Organismen, insbesondere Wasserorganismen, anwendbar. Unter den Wasserorganismen gibt es bereits mehrere Beispiele innerhalb von Krebstieren wie den Wasserflöhen Daphnia30 und Garnelen (für eine aktuelle Überprüfung, siehe Referenz31). Es gibt genügend Möglichkeiten unter Wasserinsekten, da sie schätzungsweise etwa 6% der gesamten Insektenvielfalt ausmachen, mit wahrscheinlich mehr als 200.000 Arten32. Darüber hinaus wurde RNAi bereits an Wasserstridern durchgeführt, die dazu neigen, die Oberfläche von aquatischen Umgebungen zu bewohnen33. Wenn kein Genom vorhanden ist, kann ein Transkriptom de novo zusammengesetzt werden. Solange dieser Prozess Kontaste von einigen hundert Nukleotiden offenbart, kann dsRNA gegen bestimmte Gene entwickelt werden. Unser Protokoll zur Immobilisierung von Insekten in Agarose wird wahrscheinlich auch für andere Verfahren nützlich sein, insbesondere für weiche, formbare und Wasserorganismen. Zusammengenommen bleibt RNAi eine leistungsfähige Technik zur Manipulation der Genexpression in einer vielfältigen Gruppe von Organismen, auch wenn keine anderen molekularen und genetischen Werkzeuge zur Verfügung stehen.

Die Frage, wie spezifische Gene zur Evolution unterschiedlicher Merkmale beitragen, ist ein spannendes Thema in der Biologie. In den letzten Jahrzehnten wurden große Fortschritte bei der Zersebung der genetischen Grundlagen von Entwicklungsprozessen in einigen wenigen Modellorganismen gemacht, wie der Nematode Caenorhabditis elegans, der Fruchtfliege Drosophila melanogasterund der Hausmaus Mus musculus1. In jüngerer Zeit hat die Erfindung leistungsstarker Gen-Editing-Techniken wie gruppierter, regelmäßig interspaced short palindromischer Wiederholungen (CRISPR)/Cas92 die Möglichkeit geboten, den genetischen Code von Nicht-Modellorganismen zu ändern (Beispiele siehe3,4). Infolgedessen gab es einen Anstieg der genetischen Studien an einer Vielzahl von Organismen, die zuvor nicht durch molekulare Techniken angegangen worden waren. Angesichts der enormen Vielfalt unseres Tierreichs mit vielen interessanten Merkmalen oder Merkmalsvarianzen, die nur in bestimmten Arten vertreten sind, hat dieser Fortschritt es zu einer aufregenden Zeit für die evolutions-entwicklungsbezogene Arbeit ("evo-devo") gemacht. Die Genom-Editing-Techniken, die Nicht-Modellorganismen zur Verfügung stehen, sind jedoch relativ eingeschränkt, was die Entwicklungszeitpunkte betrifft, auf die sie angewendet werden können, was es schwierig macht, die zeitlichen Eigenschaften zu unterscheiden, die mit der Rolle zusammenhängen, die bestimmte Gene in jeder Eigenschaft spielen. Darüber hinaus sind transgene Techniken oft auf Gene beschränkt, die für das Überleben nicht wesentlich sind (d. h., deren Knockout nicht zu Tödlichkeit führt). Obwohl die Gen-Editing-Techniken immer beliebter geworden sind, besteht daher nach wie vor bedarf es effektiver Techniken, die auf eine Vielzahl verschiedener Organismen zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten anwendbar sind und teilweise Knockdowns (anstelle des vollständigen Funktionsverlusts) erleichtern. Hier machen wir auf RNA-Interferenz (RNAi) aufmerksam, eine etwas veraltete, aber leistungsstarke Gen-Knockdown-Technik5, die als synergistischer Ansatz zur Genbearbeitung besonders wertvoll ist. Insbesondere haben wir Verfahren entwickelt, die die Anwendung von RNAi auf Wassertauchkäfer als Beispiel ermöglichen, das die Umsetzung dieser Technik veranschaulicht, vom Erwerb der notwendigen molekularen Sequenzen bis zur erfolgreichen Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in Eier und Larven.
RNAi-basierte Gen Knockdown nutzt einen angeborenen Abwehrmechanismus von Organismen, in dem dsRNA-Moleküle das Schweigen von eindringenden Nukleinsäuresequenzen wie Viren und Transposons6erleichtern. Kurz gesagt, dsRNA wird in die Zelle aufgenommen, wo es durch das Dicer-Enzym in 20–25 Nukleotidstücke geschnitten wird. Diese Teile aktivieren dann die Bildung des RNA-induzierten Silencing-Komplexes (RISC), der die gezielte mRNA hemmt, indem sie an bestimmten Stellen mit dem Führungsstrang an sie bindet. Dieser Prozess führt letztlich zum mRNA-Abbau und stört somit die Translation von mRNA in das jeweilige Protein6. Die hier vorgestellte RNAi-basierte Gen-Knockdown-Technik beruht daher auf der Injektion von dsRNA. Für Tiermodelle wurde diese Technik ursprünglich in C. elegans7 und D. melanogaster8 entwickelt, hat sich aber seitdem als leistungsfähiges funktionelles genetisches Werkzeug in Nicht-Modellorganismen9,10herauskristallisiert. Aufgrund seiner hochwirksamen Natur bei einigen Insekten kann RNAi sogar im Schädlingsmanagement eingesetzt werden11.
Als Forschungsinstrument wurde RNAi verwendet, um zu untersuchen, wie wichtige molekulare Entwicklungspfade in nichttraditionellen Insektenmodellen funktionieren. Zum Beispiel hat RNAi im Mehlkäfer Tribolium castaneum entscheidend dazu beigetragen, wie tief konservierte Gene zu bestimmten Merkmalen in diesem Käfer beitragen, wie beispielhaft für die Entwicklung von speziell geformten Flügeln12,13,14 und Augen15,16. Die Techniken, die den Manipulationen in T. castaneum zugrunde liegen, wurden gut beschrieben17 und verlassen sich auf die Fähigkeit, relativ trockene Eier und Larven auf einer klebrigen Oberfläche zu immobilisieren. Eine solche Immobilisierung ist jedoch für die nassen Entwicklungsformen von Wasserorganismen wie dem Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratusnicht möglich. Wie bei vielen nichttraditionellen Modellorganismen fehlt ihm ein verfremdetes Genom. Um die Genexpression in jedem Organismus ohne Genom zu manipulieren, besteht ein vernünftiger und kostengünstiger erster Schritt darin, Transkriptome zu erzeugen und die vermeintlichen Nukleotidsequenzen der exprimierten Gene von Interesse auf der Grundlage von Sequenzähnlichkeit mit verwandten, aber etablierteren Modellorganismen, in diesem Fall in erster Linie Tribolium (Coleoptera) und Drosophila-Gene, zu identifizieren.
Um zu zeigen, wie RNAi auf einem Wasserorganismus eingesetzt werden kann, diskutieren wir zunächst Protokolle und Software für die RNA-Extraktion und Transkriptom-Generierung und -Assemblage, die die Identifizierung spezifischer gezielter Gensequenzen ermöglichen. Anschließend fassen wir die notwendigen Schritte zur Synthese genspezifischer dsRNA zusammen. Anschließend zeigen wir, wie Eier in eine aquatische Umgebung injiziert werden können, und zeigen Inkubationsprotokolle für die Kultivierung von Embryonen. Darüber hinaus zeigen wir, wie Agarose-Gel verwendet werden kann, um Larven während des Injektionsprozesses vollständig zu immobilisieren, eine Technik, die in der Regel während verschiedener Verfahren nützlich ist und auf eine Vielzahl von Arthropoden angewendet werden könnte. Um zu zeigen, wie RNAi auf verschiedene Entwicklungsstadien angewendet werden kann, fügen wir ein Beispiel an, in dem wir das Augenpigmentierungsgen weiß in Embryonen zum Schweigen gebracht haben. Darüber hinaus beschreiben wir ein Beispiel, in dem das Gerbungsgen laccase2(lac2) sowohl während des zweiten Larveninsterns (zur Beeinflussung von Larven des dritten Larveninsterns) als auch während des dritten Larveninsterns (um Erwachsene zu beeinflussen) zum Schweigen gebracht wurde. Schließlich zeigen wir, dass die Injektion einer niedrigeren Konzentration von dsRNA zu einem partiellen Knockdown führt, was zeigt, dass diese Technik auch auf Gene angewendet werden kann, bei denen Funktionsverlust bekanntlich tödlich ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>University Stockroom</td>
			<td></td>
			<td>Typically locally available at research institutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>size dependent</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74804</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer (NnanoDrop)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>9836674</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2. De novo transcriptome assembly.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUSCO.v3</td>
			<td>https://busco.ezlab.org/</td>
			<td></td>
			<td>Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomics workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832021</td>
			<td>Other equivalent software packages are also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy workbench</td>
			<td>https://usegalaxy.org/</td>
			<td></td>
			<td>An open source online transcriptome assembly &#38; annotation pipeline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI BLASTx</td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&#38;PAGE_TYPE=BlastSearch&#38;PROGRAM=blastx</td>
			<td></td>
			<td>An open source online alignment and annotation pipeline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. cDNA synthesis, Cloning &#38; Miniprep isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin sodium salt</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscript RT (reverse trasncription) kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205111</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot&#8482; TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>771471</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker-incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>211DS</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer (NnanoDrop)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>9836674</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermal cycler for PCR</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1845069</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal Solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0941</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2 PCR amplification &#38; in vitro dsRNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastTaq DNA Polymerase, dNTPack</td>
			<td>Roche</td>
			<td>13873432</td>
			<td>This kit contains all the reagents necessary for a PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcriiption clean up kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td>Make 3M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (NnanoDrop)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>9836674</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9180</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (Dumon #4 Biology)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cavity dish (3 well-dish)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-243-43</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwave</td>
			<td>Welbilt</td>
			<td>turn-table</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>natural hair paintbrush</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any fine brush will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micro-pipetter</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Microsocope Central</td>
			<td>10446293</td>
			<td>Any good stereomicroscope will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-109</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital camera</td>
			<td>Edmund optics (Qimaging)</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>food dye</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td>Any available food dye should work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidity chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>Labline</td>
			<td>203</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 &#181;L of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 &#181;L of 0.5 M potassium chloride solution, 100 &#181;L of food dye and 790 &#181;L of double-distilled water. Store in 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>intracellular Microinjection Systems (Picospritzer)</td>
			<td>Parker</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Currently the model III is available, but older models work also</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672441</td>
			<td>Other products would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>603000</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td>Any quality micromanipulator will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monosodium phosphate</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micro-pipetter</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micro-pipetter</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate buffer (0.1M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Microsocope Central</td>
			<td>10446293</td>
			<td>Any good stereomicroscope will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (Dumon #4 Biology)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>603000</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjection syringe</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>603000</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672441</td>
			<td>Other products would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Microsocope Central</td>
			<td>10446293</td>
			<td>Any good stereomicroscope will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna interference in aquatic beetles as a powerful tool for manipulating gene expression at specific developmental time points

Die RNA-Interferenz (RNAi) bleibt eine leistungsfähige Technik, die eine gezielte Reduktion der Genexpression durch mRNA-Abbau ermöglicht. Diese Technik ist auf eine Vielzahl von Organismen anwendbar und ist in der artenreichen Ordnung Coleoptera (Käfer) hocheffizient. Hier fassen wir die notwendigen Schritte für die Entwicklung dieser Technik in einem neuartigen Organismus zusammen und veranschaulichen deren Anwendung auf die verschiedenen Entwicklungsstadien des Wassertauchkäfers Thermonectus marmoratus. Zielgensequenzen können kostengünstig durch die Zusammenstellung von Transkriptomen gegen einen nahen Verwandten mit bekannter Genomik oder de novo erhalten werden. Das Klonen von Kandidatengenverwendet einen spezifischen Klonvektor (das pCR4-TOPO-Plasmid), das die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA) für jedes Gen unter Verwendung eines einzigen gemeinsamen Primers ermöglicht. Die synthetisierte dsRNA kann entweder in Embryonen für frühe Entwicklungsprozesse oder Larven für spätere Entwicklungsprozesse injiziert werden. Wir veranschaulichen dann, wie RNAi mit Hilfe der Immobilisierung bei Agarose in Wasserlarven injiziert werden kann. Um die Technik zu demonstrieren, stellen wir mehrere Beispiele für RNAi-Experimente bereit, die spezifische Knockdowns mit vorhergesagten Phänotypen generieren. Insbesondere RNAi für das Gerbgen laccase2 führt zu einer Nagelhautaufhellung sowohl bei Larven als auch bei Erwachsenen, und RNAi für das Augenpigmentierungsgen weiß erzeugt eine Aufhellung/mangelnde Pigmentierung in Augenröhrchen. Darüber hinaus führt der Knockdown eines Schlüssellinsenproteins zu Larven mit optischen Mängeln und einer verminderten Fähigkeit, Beute zu jagen. Kombiniert, veranschaulichen diese Ergebnisse die Macht von RNAi als Werkzeug zur Untersuchung sowohl morphologischer Muster- als auch Verhaltensmerkmale in Organismen mit nur transkriptomischen Datenbanken.

Mit dem oben beschriebenen Protokoll haben wir drei verschiedene Gene, nämlich weiß, laccase2 (lac2) und Lens3 (Tabelle 1), in einer Vielzahl von Entwicklungsstadien des Sunburst Diving Beetle T. marmoratusniedergeklopft. Wir führten RNAi in T. marmoratus durch Injektion von dsRNA in einem sehr frühen Stadium während der Embryogenese (Abbildung 1A). Da einige der Embryonen den Prozess nicht überleben und nekrotisch werden (Abbildung 1B), müssen sie entfernt werden, um die verbleibenden Embryonen gesund zu halten. Beispielhaft sind hier die Injektionen von dsRNA gegen das weiße Gen. Dieses Gen ist in Drosophila als einer von drei ATP-bindenden Kassetten (ABC) Transportern bekannt, die an der Aufnahme und Lagerung der Vorläufer des Augenpigments23beteiligt sind. Dementsprechend führt sein Funktionsverlust zu einem unpigmentierten, weißäugigen Phänotyp. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Injektionen von dsRNA, die auf das orthologe weiße Gen in T. marmoratus Embryonen abzielen, zum Verlust der Augenpigmentierung bei neu entstehenden Larven führen. In diesem Fall sind Wildlarven durch stark pigmentierte Augen gekennzeichnet, und der RNAi-Knockdown von Weiß führt zu verschiedenen Reduktionsgraden und sogar zur vollständigen Eliminierung von Augenpigmenten. Insgesamt beobachteten wir bei 34 % der überlebenden Embryonen zumindest eine gewisse Verringerung der Augenfärbung (n = 35). Abbildung 2A vergleicht eine Steuerperson und eine Person mit einer etwas helleren Augenfarbe. Abbildung 2B zeigt einen schwereren Knockdown bei einem Individuum, bei dem die ventralen Augen (Augen 2–5) des Clusters völlig unpigmentiert sind, während die dorsalen Augen noch eine gewisse Pigmentierung aufweisen. Diese Unterschiede zeigen, wie die Effizienz des Knockdowns regional variieren kann, was möglicherweise mit Unterschieden in der Wirksamkeit der dsRNA-Penetration in dichtem Gewebe zusammenhängt. Eine andere Person zeigt im Wesentlichen vollständigen Pigmentverlust in allen Augen (Abbildung 2C).
Um zu untersuchen, wie gut RNAi im Larvenstadium von T. marmoratusarbeitet, injizierten wir dsRNA, die auf das Tannengen lac2 abzielte, wenige Tage vor dem Versuch, in dritte Insterne einzudringen (Abbildung 3) und bewerteten die Wirkung auf die schnittförmige Färbung der dritten Instarlarven. Lac2 ist eine Art von Phenoloxidase, die Proteine oxidativ konjugiert, um sie unlöslich, härter und dunkler zu machen. Knockdown im Mehlkäfer T. castaneum hat gezeigt, dass zu helleren farbigen Personen in niedrigen Dosen führen, aber gilt als tödlich in hohen Dosen24. Abbildung 4 zeigt, dass diese Behandlung auch zu helleren Sunburst Diving Beetle Larven führt. Insbesondere hatten in diesem Experiment 75% der überlebenden injizierten Larven (n = 12) eine reduzierte Pigmentierung (im Vergleich zu 0% in der Kontrollgruppe). Abbildung 4A zeigt ein Individuum mit relativ leichter Depigmentierung, während Abbildung 4C den Kopf einer T. marmoratus Larve zeigt, bei der die dunkle Färbung der Nagelhaut fast fehlt. Die Depigmentierung war besonders deutlich bei der für diese Larven typischen zentralen dunklen Musterung, während dieses Muster bei einem kontrollinjizierten Individuum deutlich sichtbar blieb (Abbildung 4B). Darüber hinaus wurde eine Aufhellung der Schwanzluftröhre beobachtet, wie in Abbildung 4Ddargestellt. In dem Fall, in dem lac2 dsRNA in dritte Instarlarven injiziert wurde, wurden leichtere erwachsene Individuen erhalten (Abbildung 5). Beachten Sie, dass die Flügel des Abstoßkäfers etwas deformiert sind, wahrscheinlich aufgrund seiner ungewöhnlichen Weichheit.
Neben der Veränderung morphologischer Merkmale ist es möglich, RNAi zu verwenden, um Gene zu zielen, die das Verhalten beeinflussen. Um dies zu demonstrieren, führten wir RNAi gegen ein Schlüssellinsenprotein-Codierungsgen, Lens318, durch und injizierten es in zweite Instar-Larven, um die optischen Eigenschaften von dritten Insternlarvenaugen zu beeinflussen. Alle Auswirkungen auf die Linse, die hier beobachtet werden, sind wahrscheinlich, da die Augen von T. marmoratus Larven bei diesem Übergang einem großen Augenwachstum unterzogen werden, was auch große optische Veränderungen der Linse beinhaltet25. RNAi Knockdown in diesem Experiment war hocheffizient. Die Überprüfung durch qPCR ergab eine Erfolgsquote von 100 %; von 13 getesteten Personen wurden 12 auf weniger als 10 % des Expressionsniveaus von Kontrollpersonen reduziert, wobei die verbleibende Person eine Expressionsstufe von 17 % der Kontrollstufe (unveröffentlichte Beobachtung) hatte. Auf der phänotypischen Ebene waren nur einige Personen schwer behindert oder unfähig, Beute zu fangen, wie in Abbildung 6 für eine Person dargestellt wird, die sich ihrer Beute immer wieder aus sehr großer Entfernung näherte, sie aber konsequent überschoss.
Tabelle 1: Primersequenzen und Amplicons für weiße, lac2- und Lens3-Proteine. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61477/Table1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig01.jpg"> Abbildung 1: Abbildung der Embryoinjektionen. (A) Dechorionierte Embryonen, die auf einer Agaroseplatte aufgereiht und in der Nähe ihres Zentrums mit einer Mikroinjektionsnadel injiziert wurden, die mit dsRNA und einem lebensmittelfärbenden Injektionspuffer gefüllt war. Der Maßstabsbalken entspricht 500 m. (B) Eine Person mit einem schwereren Knockdown. Injizierte Embryonen werden in einer Feuchtigkeitskammer aufbewahrt und täglich überwacht, um Phänotypen zu bewerten und tote Individuen zu entfernen (die braun werden). Die Maßstabsleiste stellt 5 mm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für voll entwickelte Embryonen, die mit dsRNA gegen Weiß injiziert wurden. (A) Vergleich einer Person mit einer Reduktion der Augenpigmentierung (links) und einer kontrollinjizierten Person (rechts). E1–E6 siehe Eyes 1–6. (B) Eine Person mit einem schwereren Knockdown-Phänotyp, was zeigt, dass manchmal einige der Augen innerhalb des Clusters stärker von dem Knockdown betroffen sind als andere. (C) Einzelperson mit einem nahezu vollständigen Verlust der Augenpigmentierung. Der Maßstabsbalken entspricht 200 m; Die Panels B und C sind in der gleichen Skala dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig03.jpg"> Abbildung 3: Abbildung der Larveninjektionen. (A) Mehrere Larven, die durch Einbettung in 2% Agarose mit ihren Schwanzspracles frei von jeder Agarose immobilisiert wurden. (B) Mikroelektrode, die die Injektionslösung enthält, so dass ihre Spitze die feine Membran zwischen zwei Segmenten durchdringen kann. (C) Blauer Injektionsfarbstoff, der nach der Injektion an der Injektionsstelle sichtbar ist. Maßstabsleisten stellen 1 cm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig04.jpg"> Abbildung 4: RNAi für laccase2, die auf zweite Instar-Larven angewendet wird, was zu einer reduzierten Nagelhautfärbung bei dritten Instarlarven führt. (A) Relativ leichter Verlust der Färbung in einem lac2 RNAi Individuum (unten) im Vergleich zu einem kontrollinjizierten Individuum (oben). Die Skalenstange stellt 5 mm dar. (B) Kopf einer Steuerperson, die das charakteristische dunkel gefärbte Muster in der Mitte des Kopfes zeigt. (C) Relativ schwerer Knockdown von Lac2, was zu einem nahezu vollständigen Verlust der zentralen Kopffärbung führt. (D) Verlust der Färbung in der Hauptschwanznagel eines lac2 RNAi Individuums (unten) im Vergleich zu einem kontrollinjizierten Individuum (oben). Maßstabsleisten in B-u2012D stellen 1 mm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig05.jpg"> Abbildung 5: RNAi für laccase2 auf eine dritte Instar-Larve angewendet, was zu einer reduzierten Nagelhautfärbung bei einem Erwachsenen führt. Das Knockdown-Individuum (links) zeichnet sich auch im Vergleich zur Steuerung (rechts) durch sehr weiches Elytra aus. Die Maßstabsleiste stellt 5 mm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig06.jpg"> Abbildung 6: Knockdown eines großen Linsenproteins, das zu Mängeln bei der Beuteerfassung führt. (A–C). Drei Beispiele, in denen eine Sunburst Diving Beetle Larve, in der optische Defizite durch RNAi induziert wurden, nicht in der Lage war, Beute (Mückenlarven) zu fangen. Repräsentative Standbilder wurden aus einer Videoaufzeichnung charakteristischer Beuteaufnahmen ausgewählt. (D) Kontrolle Larven fangen Beute. Alle Maßstabsleisten stellen 2 cm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA-Interferenz ist eine weit verbreitete, leistungsfähige Technik zur Manipulation der Genexpression in bestimmten Entwicklungsstadien. Hier beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Umsetzung dieser Technik im Wassertauchkäfer Thermonectus marmoratus, vom Erwerb von Gensequenzen bis zum Knockdown von Genen, die Struktur oder Verhalten beeinflussen.

RNA-Interferenz in Wasserkäfern als leistungsstarkes Werkzeug zur Manipulation der Genexpression an bestimmten Entwicklungszeitpunkten

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Auch wenn die Genbearbeitung für die Erforschung der Molekulargenetik von Nicht-Modellorganismen populär geworden ist, bleibt RNAi ein mächtiges synergistisches Werkzeug. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie auf verschiedene Entwicklungsstadien angewendet werden kann. Darüber hinaus kann ein partieller Knockdown verwendet werden, um diese ganzen Gene zu untersuchen.Der Erfolg des Verfahrens beruht auf der Injektion von DSR und mit minimalem Schaden. Dies erfordert Praxis, also lassen Sie sich nicht entmutigen, wenn es ein paar Versuche braucht, um es richtig zu machen. Um Embryonen im Frühstadium für die Mikroinjektion vorzubereiten, gießen Sie zunächst kochende 20%Agarose in eine kleine Petrischale und legen Sie drei ein bis zwei Millimeter breite Kunststoffröhren auf die Oberfläche der flüssigen Agarose, bevor sie erstarrt.Sobald die Agarose erstarrt ist, verwenden Sie ein Paar stumpfe Zange, um die Rohre zu entfernen und die resultierenden Einkerbungen mit 500 Mikroliter Autoklav destilliertem Wasser zu bedecken. Wenn der Sammelbehälter bereit ist, verwenden Sie einen feinen natürlichen Haarpinsel, um fünf acht Stunden alte T.marmoratus Embryonen aus den Käfernistplätzen in eine Glashohlraumschale zu übertragen, die mit Autoklavendestilliertem Wasser unter einem Stereomikroskop gefüllt ist. Mit dem Mikroskop und feinen Sezierzangen greifen die Chorion jedes Embryos von beiden Seiten und reißen die Chorion auf, so dass der Embryo sanft aus dem Gewebe gleiten kann.Nach dem Entfernen beider Chorionsschichten aus allen gesammelten Embryonen verwenden Sie den Pinsel, um die Embryonen vorsichtig aus der Glashöhlenschale in die Rillen der vorbereiteten Agaroseplatte zu übertragen. Um Embryonen im Frühstadium mit genspezifischer doppelsträngiger RNA zu injizieren, bereiten Sie zunächst Mikroinjektionsnadeln auf einem Nadelpuler vor und verwenden sie das Stereomikroskop und finden Zangen, um jede Spitze bis zu einer scharfen Kante zu brechen. Nachdem Sie die gereinigte, doppelsträngige RNA auf Eis geworfen haben, fügen Sie der resultierenden Lösung einen Mikroliter 10-fachen Injektionspuffer hinzu und verwenden Sie doppelt destilliertes Wasser, um das Vinylvolumen der Lösung auf 10 Mikroliter zu bringen.Verwenden Sie eine P10-Pipette, um eine der vorbereiteten Mikroinjektionsnadeln mit der arbeitenden doppelsträngigen RNA-Lösung zu füllen und die Nadel in einen Mikronadelhalter zu laden, der mit einem Mikroinjektionssystem verbunden ist, das die Druckauswurftechnologie nutzt. Schalten Sie das Mikroinjektionssystem und die Druckluftzufuhr ein und verwenden Sie das Mikroventil am Mikroinjektionssystem, um den Einspritzdruck auf 15 Pfund Druck pro Quadratzoll einzustellen und dann den Zeiteinstellungsknopf zu verwenden, um die Injektionsdauer auf Sekunden einzustellen. Um die Injektionsnadel zu kalibrieren, bewerten Sie das Volumen der Flüssigkeitsblase, die an der Spitze der Nadel gebildet wird, wenn sie in die Luft für T.marmoratus Embryo injiziert wird, verwenden Sie eine optimale Blasengröße von 100 bis 200 Mikrometer.Die Injektionsnadel ist von guter Qualität, wenn optimale Blasen bei 15 Pfund Druck pro Quadratzoll mit einer Injektionsdauer von etwa drei Sekunden erreicht werden können. Wenn die Nadel aufgestellt ist, richtet die Nadel auf der Agaroseplatte von Embryonen so aus, dass sich die Nadel den Embryonen in einem Winkel von 45 bis 60 Grad nähert. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Mikronadel langsam zu bewegen, bis die Spitze die Oberfläche der Mitte eines Embryos berührt und dann vorsichtig die Nadel nach vorne bewegt, bis sie nur die Oberfläche des Embryos durchbohrt.Sobald sich die Nadel im Embryo befindet, drücken Sie vorsichtig den Mikroinjektor-Injektionsknopf, um ein bis zwei Nanoliter doppelsträngiger RNA in den Embryo zu liefern. Wenn die gesamte RNA geliefert wurde, ziehen Sie die Nadel langsam aus dem Embryo zurück, ohne dass der Embryo bricht. Erfolgreich injizierte Embryonen können durch das Vorhandensein eines farbigen Flecks an der Injektionsstelle identifiziert werden.Wenn alle Embryonen sorgfältig injiziert wurden, legen Sie die Schale vorsichtig in eine Feuchtigkeitskammer in einem 25 Grad Celsius Inkubator eingestellt, um einen 14 Stunden licht 10 Stunden dunklen Zyklus für vier bis fünf Tage. Überwachen Sie täglich den Entwicklungsfortschritt der Embryonen unter dem Stereomikroskop, um morphologisch sichtbare Knockdown-Phänotypen zu identifizieren. Verwenden einer hochauflösenden Digitalkamera zur Dokumentation des Entwicklungsprozesses.Entfernen Sie alle toten Embryonen und füllen Sie das Wasser auf der Agaroseplatte täglich auf, um austrocknung und die Ausbreitung der mikrobiellen Kontamination auf andere überlebende Embryonen während der Inkubationszeit zu vermeiden. Vor dem Sammeln der Larve zuerst 60 bis 70 Grad Celsius 2% flüssige Agarose zu einer kleinen Petrischale hinzufügen. Wenn die Agarose verfestigt hat, verwenden Sie stumpfe Zangen, um eine flache Gruppe pro Larve herzustellen, die in die Agarose injiziert werden soll, und das Wasser vorsichtig aus den Larvenkulturbechern abtropfen zu lassen.Nach der Anästhesie verwenden Sie weiche, gemittelte Zangen, um die Larve vorsichtig auf die Immobilisierungsplatte mit den Hälsen und Körpern in den Rillen zu legen, aber der Schwanz befindet sich über der Agarose-Oberfläche. Wenn alle Larven platziert worden waren, bedecken Sie jede Lava mit einer dicken Schicht Von Agarose, die noch flüssig ist, aber nicht gefährlich heiß und frei alle Geschichten, die versehentlich bedeckt wurden, wie nötig. für eine doppelsträngige RNA-Mikroinjektionslast eine Mikronadel mit der genspezifischen, von Interesse zeigenden doppelsträngigen RNA-Arbeitslösung.Ziehen Sie den Kolben einer manuell gesteuerten Mikroinjektionsspritze zurück und laden Sie die Nadel auf das Mikroinjektionssystem. Positionieren Sie die immobilisierte Larve unter dem Stereomikroskop so, dass die Injektionsstelle in einem relativ flachen Winkel an der Flugbahn der Mikroinjektionsnadel ausgerichtet ist. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadelspitze vorsichtig in die Larve zu bewegen und langsam und vorsichtig Druck auf die Spritze auszuüben, indem Sie den Injektionsdruck entsprechend der Bewegung der farbigen Injektionsflüssigkeit in der Nadel bei Bedarf anpassen.Wenn die gesamte RNA injiziert wurde, verwenden Sie weiche Zangen, um die Larve von der Agarose zu befreien und legen Sie die Larve in einen neuen Behälter mit Raumtemperatur Wasser bei 25 bis 28 Grad Celsius und einem 14 Stunden Licht 10 Stunden dunklen Zyklus. In dieser repräsentativen Analyse wurden drei verschiedene Gene in einer Vielzahl von verschiedenen Entwicklungsstadien des Sonnenkäfers T.marmoratus niedergeschlagen. Die RNA-Interferenz wird durch die Injektion von doppelsträngiger RNA in einem sehr frühen Stadium der Embryogenese nachgewiesen.Einige der Embryonen überleben den Prozess nicht und werden nekrotisch. In diesen Bildern steuern sie Einzelne und eine Person mit einer etwas helleren Augenfarbe beobachtet werden. In diesem Individuum, ein schwererKnockdown, in dem die mehr ventralen Lügen des Clusters sind völlig unpigmentiert, aber die do Verbündeten noch zeigen einige Pigmentierung beobachtet werden können.Hier wird ein Beispiel für ein anderes Individuum mit im Wesentlichen vollständigen Pigmentverlust in allen Augen gezeigt. Lac2 in Larven niedergeschlagen ergebnisse in einer weniger pigmentierten Nagelhaut, leichtere erwachsene Personen mit etwas deformierten Flügeln wahrscheinlich aufgrund der ungewöhnlichen Weichheit des Gewebes wurden auch erhalten. Achten Sie darauf, ihre injizierten Tiere täglich genau zu beobachten und sofort tote Individuen zu entfernen.Die Kraft dieser Technik ist, dass sie auf die Gene vieler verschiedener Organismen angewendet werden kann. Diese Technik wurde auch weit verbreitet und erfolgreich auf die evolutionäre Entwicklungsbiologie angewendet.

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