Name: rna interference in aquatic beetles as a powerful tool for manipulating gene expression at specific developmental time points
Uploaded: 2020-05-29T15:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר ג'וש בנואה על עזרתו בביואיינפורמטיקה היילי טובלר על עזרתה בהעלאת אנברסט צללית ותמרה פייס לסיוע עריכה. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענקים IOS-1456757 ו IOS-1856341 כדי EKB ו IOS1557936 ל YT.

<ol>
	<li>Muller, B., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+organisms+-+A+historical+perspective.">Model organisms - A historical perspective.</a> Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Modular+RNA-Guided+Regulation+of+Transcription+in+Eukaryotes.">CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li><li>Westerman, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aristaless+Controls+Butterfly+Wing+Color+Variation+Used+in+Mimicry+and+Mate+Choice.">Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice.</a> Current Biology. 28, 3469 (2018).</li><li>Perry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+logic+behind+the+three-way+stochastic+choices+that+expand+butterfly+colour+vision.">Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision.</a> Nature. 535, 280 (2016).</li><li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+Right+Tool+for+the+Job:+RNAi,+TALEN,+or+CRISPR.">Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).</li><li>Meister, G., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+gene+silencing+by+double-stranded+RNA.">Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA.</a> Nature. 431, 343-349 (2004).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway.">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95, 1017-1026 (1998).</li><li>Mello, C. C., Conte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+world+of+RNA+interference.">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li><li>Agrawal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+Biology,+mechanism,+and+applications.">RNA interference: Biology, mechanism, and applications.</a> Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).</li><li>Gu, L. Q., Knipple, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+RNA+interference+research+in+insects:+Implications+for+future+insect+pest+management+strategies.">Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies.</a> Crop Protection. 45, 36-40 (2013).</li><li>Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+developmental+analysis+of+Drosophila+and+Tribolium+reveals+conserved+and+diverged+roles+of+abrupt+in+insect+wing+evolution.">Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution.</a> Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Co-options+of+Exoskeleton+Formation+during+Wing-to-Elytron+Evolution+in+Beetles.">Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles.</a> Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II):+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>ZarinKamar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pax+gene+eyegone+facilitates+repression+of+eye+development+in+Tribolium.">The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium.</a> Evodevo. 2, 15 (2011).</li><li>Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNA+Interference+in+the+Red+Flour+Beetle,+Tribolium+castaneum.">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum.</a> Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).</li><li>Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+lens+for+a+complex+eye.">A complex lens for a complex eye.</a> Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).</li><li>Yeku, O., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Amplification+of+cDNA+Ends+(RACE).">Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE).</a> RNA, Methods In Molecular Biology. , 107-122 (2011).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Systemic+RNA+Interference+in+the+Red+Flour+Beetle+Tribolium+castaneum:+Parameters+Affecting+the+Efficiency+of+RNAi.">Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi.</a> Plos One. 7, (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y., Orgogozo, V., Rockman, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods for Evolutionary Genetics. , 471-497 (2011).</li><li>Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+localisation+of+the+White/Scarlet+ABC+transporter+to+pigment+granule+membranes+within+the+compound+eye+of+Drosophila+melanogaster.">Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster.</a> Genetica. 108, 239-252 (2000).</li><li>Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase+2+is+the+phenoloxidase+gene+required+for+beetle+cuticle+tanning.">Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).</li><li>Werner, S., Buschbeck, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+step-wise+eye+growth+in+molting+diving+beetle+larvae.">Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).</li><li>Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+via+Embryonic+RNAi+in+Spider+Embryos.">Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos.</a> Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).</li><li>Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+in+Crustaceans:+From+Basic+Research+to+Biotechnologies.">Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies.</a> Genes. 4, 620-645 (2013).</li><li>Zhu, K. Y., Palli, S. R., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Review of Entomology. 65, 293-311 (2020).</li><li>Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+network+controlling+glial+development+in+the+Drosophila+visual+system.">A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system.</a> Development. 142, 2184 (2015).</li><li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+analysis+of+doublesex1+expression+in+Daphnia+pulex+Leydig,+1860+(Cladocera).">RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera).</a> Crustaceana. 92, 137-154 (2019).</li><li>Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+shrimp+and+potential+applications+in+aquaculture.">RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture.</a> Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).</li><li>Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U., Berenbaum, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Review of Entomology. 59, 143-163 (2014).</li><li>Crumiere, A. J. J., Khila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+genes+mediate+the+escalation+of+sexually+antagonistic+traits+in+water+striders.">Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders.</a> Biology. Letters. 15, 5 (2019).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

המטרה שלנו היא כי אוסף זה של שיטות יהפוך RNAi זמין באופן נרחב, במיוחד כמו כלי זה נשאר טכניקה סינרגטית רבת עוצמה לעריכת גנים מבוססי CRISPR / Cas9, עם היתרון כי ניתן להחיל אותו על השלבים ההתפתחותיים הרצויים של אורגניזמים שנחקרו. כדי להדגים את הכוח הזה, הזרקנו dsRNA לעוברים ולתוך שלבי זחל שונים. זריקות לביצים השפיעו על התפתחות העוברים (איור 2), זריקותלשלב הזחל השני היו השפעות לכאורה על שלב הזחל השלישי (איור 4 ואיור 6),וזריקות לשלב הזחל השלישי הראו השפעות אצל המבוגרים (איור 5). בעוד התזמון המדויק צריך להיות מבוסס באופן ניסיוני, בדרך כלל, זריקות להשפיע בתוך כמה ימים. ההצלחה של תהליך זה יכולה להיות מושפעת מאורך רצף dsRNA. כאן, אנו הציגו דוגמאות באמצעות קצת מעל 200 bp ליותר מ 800 bp. ככלל, רצפים בין 100 ו 600 bp מעדיפים להגביל את ההשפעות מחוץ ליעד, אבל רצפים עד 1000 bp להניב תוצאות טובות22. שאלה אחת לגבי RNAi היא משך הנוקאאוט שניתן להשיג באמצעות טכניקה זו. מכיוון שהפנוטיפים היו סופניים בכל שלב, איננו יכולים להגיב על נושא זה בהתבסס על התוצאות המוצגות שלנו. עם זאת, זה כבר ציין בעבר כי השפעות RNAi הם בדרך כלל חיים ארוכים יחסית, כי ריכוזים גבוהים יותר להוביל נוקאאוטיםלאורך זמן 20.
מגבלה אחת של טכניקה זו היא שזה עובד טוב יותר עבור אורגניזמים מסוימים מאשר לאחרים, ונראה שאין דרך ישירה לחזות כמה טוב זה יעבוד פריורי. אף על פי כן, זה נמצא לעבוד היטב עבור מגוון גדול של אורגניזמים שונים. בתוך פרוקי רגליים, זה כולל עכבישים26,סרטנים 27, ומגוון רחב של חרקים, עם שיעורי הצלחה גבוהים במיוחד בסלקות28. סיבוך נוסף הוא כי הבדלים בחומרת פנוטיפ מתרחשים לעתים קרובות בין אנשים למרות היישום של אותה כמות של dsRNA. כפי שמוצג באות 2B, וריאציה יכולה להתרחש אפילו בתוך אדם. במחקרי RNAi שלנו מיקוד גנים שונים המעורבים T. מרמורטוס זחל העין התפתחות, מצאנו לעתים קרובות כי כמה עיניים מושפעים באופן חמור יותר מאחרים. תופעה זו עשויה להיות קשורה רקמה צפופה יחסית של אשכול העין, עם dsRNA טוב יותר מסוגל להגיע לחלק מהיחידות.
לביצוע מוצלח של ניסויי RNAi, זה קריטי כי מספר פרמטרים ממוטבים עבור גן היעד. לדוגמה, הריכוז של dsRNA ואת אורך הגן המיועד יכול להשפיע מאוד על התוצאה20. פרמטר קריטי נוסף הוא כיצד הזריקות מבוצעות, כמו תהליך זה יכול להשפיע מאוד על שיעור ההישרדות. עבור עוברים, השגנו את התוצאות הטובות ביותר על ידי מיקוד מרכז העובר. צלחת מונחת היטב מאפשרת הזרקה של 100 עוברים או יותר בפגישה אחת. עבור זחלים, זה קריטי להכניס את מחט ההזרקה בין המקטעים. These injections require more dsRNA, and based on larvae availability, our injection sets here typically only consisted of a few animals at a time. עבור כל הזריקות, זה קריטי כדי למנוע אוויר מלהיכנס האורגניזם.
במקרים מסוימים, לולאות המשוב של רשת רגולטורית גנטית ויתירות גנטית יכולות להשפיע על ההתפכחות של פנוטיפים RNAi, למרות נוקאאוטים עקביים. זה נראה המקרה עבור תצפיות התנהגותיות שלנו של זחלים עם נוקאאוטים מוצלחים מאוד של חלבון עדשה בולט, Lens318. למרות שאימתנו את היעילות הגבוהה של נוקאאוטים אלה באמצעות qPCR, וריאציה ניכרת נצפתה פנוטיפים הקשורים. תוצאה זו מדגישה את הצורך לכמת כראוי נוקאאוטים RNAi (לפרטים על אפשרויות ראה22). אם אין ציפייה פריורי ברורה לגבי פנוטיפים וכתוצאה מכך, דרך טובה לשלוט על ההשפעות מחוץ ליעד של RNAi היא למקד את אותו גן עם שני רצפים שאינם חופפים של dsRNA ולהעריך את התוצאות עבור פנוטיפים נפוצים.
בניגוד לטכניקות לעריכת גנים, RNAi הוא גם כלי רב עוצמה לחקר גנים קטלניים, ויש שתי דרכים לעשות זאת. לדוגמה, אם אחד מעוניין בתרומה הפונקציונלית של גן שבו אובדן של תפקוד בשלב מוקדם של הפיתוח ידוע להיות קטלני, חקירה פונקציונלית של גן כזה יכול להיות מושגת על ידי פשוט לאפשר לחיה להתפתח כרגיל ולאחר מכן להפיל את הגן באמצעות RNAi מאוחר יותר בפיתוח (כלומר, במבוגר). לחלופין, גן שבו אובדן מוחלט של תפקוד ידוע להיות קטלני יכול להיחקר באמצעות נוק-דאון חלקי, אשר ניתן להשיג על ידי הזרקת מגוון של ריכוזי dsRNA. חלק מהתוצאות שלנו להראות נוקאאוטים של lac2, אשר ידועים להיות קטלני אם העור בחרקים הופך רך מדי24. אפילו חיפושית RNAi lac2 המתוארת בדמות 5 לא יהיה סביר לשרוד מחוץ לתנאי מעבדה. גן קטלני נוסף נחתך, אשר קודים עבור גורם שעתוק כי הוא בסיסי עבור מפרט גורל התא במערכות איברים שונות פרוקי רגליים, נקשר להתפתחות גליה במערכת הראייה Drosophila 29. בהתבסס על הניסיון שלנו עם RNAi לחתוך בעוברי T. marmoratus, אנחנו יכולים לעורר פנוטיפים אינפורמטיביים בעיניים בעוברים שמסוגלים להשלים את התפתחות העין העוברית שלהם (תצפיות שלא פורסם). כאן, מינונים גבוהים יותר נראים להוביל שיעורי קטלניות גבוהים יותר, בעוד מינונים נמוכים יותר לגרום פנוטיפים נצפים אינפורמטיביים.
הפרוטוקול שלנו לא רק מפרט את הצעדים הדרושים לחוקר להמשיך ניסויים RNAi על T. marmoratus, כפי שתואר, אבל גם ישים בדרך כלל אורגניזמים אחרים, במיוחד אורגניזמים ימיים. בקרב אורגניזמים ימיים, יש כבר כמה דוגמאות בתוך סרטנים כגון פרעושים מים דפניה30 ושרימפס (לסקירה האחרונה,ראה התייחסות 31). ישנן הזדמנויות רבות בקרב חרקים ימיים, כפי שהם העריכו כי הם מהווים כ 6% מכל מגוון החרקים, עם סבירות יותר מ 200,000מינים 32. יתר על כן, RNAi כבר בוצע על מים striders הנוטים לאכלס את פני השטח של סביבות ימיות33. אם לא קיים גנום, אז ניתן להרכיב תעתיק של דה נובו. כל עוד תהליך זה חושף רציפים של כמה מאות נוקלאוטידים, dsRNA נגד גנים ספציפיים ניתן לתווע. הפרוטוקול שלנו לניתיקת חרקים באגרוז יהיה ככל הנראה שימושי גם עבור הליכים אחרים, במיוחד עבור אורגניזמים רכים, גמישים, וים. יחד, RNAi נשאר טכניקה רבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בקבוצה מגוונת של אורגניזמים, גם כאשר אין כלים מולקולריים וגנטיים אחרים זמינים.

השאלה כיצד גנים ספציפיים תורמים לאבולוציה של תכונות מגוונות היא נושא מרגש בביולוגיה. במהלך העשורים האחרונים, נעשתה התקדמות רבה בכל הנוגע לנתח את התסיסים הגנטיים של תהליכים התפתחותיים בכמה אורגניזמים מודל, כגון הנמטודה Caenorhabditis elegans, פרי לעוף Drosophila מלנוגאסטר, ואת עכבר הבית השרירים1. לאחרונה, המצאת טכניקות רבות עוצמה לעריכת גנים כגון אשכולות קבועים בין-מרחבים קצרים פלינדרומיים חוזרים (CRISPR)/Cas92 סיפק את היכולת לשנות את הקוד הגנטי של אורגניזמים שאינם מודל (לדוגמה ראה3,4). כתוצאה מכך, יש כבר גל של מחקרים גנטיים על מגוון רחב של אורגניזמים שלא ניגשו בעבר באמצעות טכניקות מולקולריות. בהתחשב במגוון העצום של ממלכת החיות שלנו, עם תכונות מעניינות רבות או שונות תכונות המיוצגות רק מינים ספציפיים, התקדמות זו הפכה אותו לזמן מרגש עבור ביולוגיה אבולוציונית-התפתחותית ("evo-devo") עבודה הקשורה. עם זאת, טכניקות עריכת הגנום הזמינות אורגניזמים שאינם מודל מוגבלים יחסית לגבי נקודות זמן התפתחותיות שבו הם יכולים להיות מיושמים, מה שהופך את זה מאתגר להבחין בתכונות הזמניות הקשורות לתפקיד כי גנים ספציפיים לשחק בכל תכונה. בנוסף, טכניקות טרנסגניות מוגבלות לעתים קרובות לגנים אינם חיוניים להישרדות (כלומר, שהנוקאאוט שלהם אינו תוצאתו קטלניות). לכן, בעוד טכניקות עריכת גנים החלו להיות פופולרי, יש עדיין צורך בטכניקות יעילות החלות על מגוון רחב של אורגניזמים שונים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות ולהקל על נוקאאוטים חלקיים (במקום אובדן מוחלט של פונקציה). כאן, אנו מושכים תשומת לב להפרעה RNA (RNAi), טכניקה קצת מיושנת אךרבת עוצמה נוק-דאון גנים 5 כי הוא יקר במיוחד כגישה סינרגטית לעריכת גנים. באופן ספציפי, פיתחנו הליכים המאפשרים את היישום של RNAi לחפשיות צלילה ימית כדוגמה הממחישה את היישום של טכניקה זו, מרכישת הרצפים המולקולריים הדרושים להזרקה מוצלחת של RNA דו-גדילי (dsRNA) לתוך ביצים וזחלים.
נוק-דאון גנטי מבוסס RNAi ממנף מנגנון הגנה מולד של אורגניזמים, שבו מולקולות dsRNA להקל על השתקת רצפי חומצה גרעין פולשים, כגון וירוסים ו transposons6. בקצרה, dsRNA נלקח לתוך התא, שם הוא נחתך 20-25 חתיכות נוקלאוטיד על ידי אנזים Dicer. חלקים אלה מפעילים את היווצרות קומפלקס ההשתקה המושרה על-ידי RNA (RISC), אשר מעכב את ה-mRNA המכוונת על-ידי כריכה אליו באתרים ספציפיים באמצעות קווצת המדריך. תהליך זה בסופו של דבר מוביל להשפלה mRNA ולכן מפריע התרגום של mRNA לתוך החלבון בהתאמה6. טכניקת הנוק-דאון של הגן המבוסס על RNAi המוצגת כאן ולכן מסתמכת על הזרקת DSRNA. עבור מודלים של בעלי חיים, טכניקה זו פותחה במקור C. elegans7 ו D. מלנוגסטר8, אבל מאז התגלה ככלי גנטי פונקציונלי רב עוצמה אורגניזמים שאינם מודל9,,10. בשל אופיו היעיל מאוד חרקים מסוימים, RNAi יכול אפילו להיות מיושם בניהול מזיקים11.
ככלי מחקר, RNAi שימש כדי לבחון כיצד מסלולים מולקולריים-התפתחותיים מפתח לתפקד במודלים חרקים לא מסורתיים. לדוגמה, RNAi ב קסטניום חיפושית הקמח Tribolium כבר אינסטרומנטלי בקביעת כמה עמוק גנים שנשרמו לתרום תכונות ספציפיות חיפושית זו, כפי שמדגים לפיתוחשל כנפיים מעוצבות במיוחד 12,13,,14 ועיניים15,16., הטכניקות שמתוארות למניפולציות ב-T. castaneum תוארו היטב 17 ומסתמכות על היכולת לשתק ביצים יבשות יחסית וזחלים על משטח דביק. עם זאת, אי-תנועה כזו אינה אפשרית עבור הצורות ההתפתחותיות הרטובות של אורגניזמים ימיים כגון חיפושית הצלילה של קרניהשמש. כמו במקרה של אורגניזמים מודל לא מסורתיים רבים, זה חסר גנום ביאורים. כדי לתמרן ביטוי גנים בכל אורגניזם ללא גנום, צעד ראשון סביר וחסכוני הוא ליצור transcriptomes ולזהות את רצפי נוקלאוטיד putative של הגנים המבוטאים של עניין בהתבסס על דמיון רצף עם אורגניזמים מודל קשורים אך מבוססים יותר, במקרה זה, בעיקר טריבוליום (Coleoptera) וגנים Drosophila.
כאן, כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש ב-RNAi על אורגניזם ימי, אנו דנים תחילה בפרוטוקולים ובתוכנה לחילוץ RNA ותעתוק והרכבה, המאפשרים זיהוי רצפי גנים ממוקדים ספציפיים. לאחר מכן אנו מסכמים את השלבים הדרושים לסנתז dsRNA ספציפי לגנים. לאחר מכן, אנו ממחישים כיצד ניתן להזריק ביצים בסביבה מימית ולהפגין פרוטוקולי דגירה לתחינת עוברים מתפתחים. בנוסף, אנו מראים כיצד ג'ל agarose יכול לשמש כדי לשתק לחלוטין זחלים במהלך תהליך ההזרקה, טכניקה כי הוא שימושי בדרך כלל במהלך הליכים שונים, ניתן להחיל על מגוון רחב של פרוקי רגליים. כדי להדגים כיצד ניתן להחיל RNAi על שלבים התפתחותיים שונים, אנו כוללים דוגמה שבה השתקנו את גן פיגמנטציה העין לבן בעוברים. בנוסף, אנו מתארים דוגמה שבה הגן שיזוף laccase2(lac2) הושתק במהלך instar הזחל השני (כדי להשפיע על הזחלים של instar הזחל השלישי) ואת instar הזחל השלישי (כדי להשפיע על מבוגרים). לבסוף, אנו מוכיחים כי הזריקה של ריכוז נמוך יותר של dsRNA מוביל נוק-דאון חלקי, אשר מראה כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על גנים שבהם אובדן של תפקוד ידוע להיות קטלני.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>University Stockroom</td>
			<td></td>
			<td>Typically locally available at research institutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>size dependent</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74804</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer (NnanoDrop)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>9836674</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2. De novo transcriptome assembly.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUSCO.v3</td>
			<td>https://busco.ezlab.org/</td>
			<td></td>
			<td>Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomics workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832021</td>
			<td>Other equivalent software packages are also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy workbench</td>
			<td>https://usegalaxy.org/</td>
			<td></td>
			<td>An open source online transcriptome assembly &#38; annotation pipeline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI BLASTx</td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&#38;PAGE_TYPE=BlastSearch&#38;PROGRAM=blastx</td>
			<td></td>
			<td>An open source online alignment and annotation pipeline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. cDNA synthesis, Cloning &#38; Miniprep isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin sodium salt</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscript RT (reverse trasncription) kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205111</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot&#8482; TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>771471</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker-incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>211DS</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer (NnanoDrop)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>9836674</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermal cycler for PCR</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1845069</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal Solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0941</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2 PCR amplification &#38; in vitro dsRNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastTaq DNA Polymerase, dNTPack</td>
			<td>Roche</td>
			<td>13873432</td>
			<td>This kit contains all the reagents necessary for a PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcriiption clean up kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td>Make 3M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (NnanoDrop)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>9836674</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9180</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (Dumon #4 Biology)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cavity dish (3 well-dish)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-243-43</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwave</td>
			<td>Welbilt</td>
			<td>turn-table</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>natural hair paintbrush</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any fine brush will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micro-pipetter</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Microsocope Central</td>
			<td>10446293</td>
			<td>Any good stereomicroscope will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-109</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital camera</td>
			<td>Edmund optics (Qimaging)</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>food dye</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td>Any available food dye should work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidity chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>Labline</td>
			<td>203</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 &#181;L of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 &#181;L of 0.5 M potassium chloride solution, 100 &#181;L of food dye and 790 &#181;L of double-distilled water. Store in 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>intracellular Microinjection Systems (Picospritzer)</td>
			<td>Parker</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Currently the model III is available, but older models work also</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672441</td>
			<td>Other products would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>603000</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td>Any quality micromanipulator will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monosodium phosphate</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micro-pipetter</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micro-pipetter</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate buffer (0.1M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Microsocope Central</td>
			<td>10446293</td>
			<td>Any good stereomicroscope will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (Dumon #4 Biology)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>603000</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjection syringe</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>603000</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672441</td>
			<td>Other products would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Microsocope Central</td>
			<td>10446293</td>
			<td>Any good stereomicroscope will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna interference in aquatic beetles as a powerful tool for manipulating gene expression at specific developmental time points

הפרעות RNA (RNAi) נשאר טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הפחתה ממוקדת של ביטוי גנים באמצעות השפלה mRNA. טכניקה זו ישימה למגוון רחב של אורגניזמים ויעילה מאוד בסדר העשיר במין Coleoptera (סלקות). כאן, אנו מסכמים את הצעדים הדרושים לפיתוח טכניקה זו באורגניזם חדשני וממחישים את יישומה לשלבים ההתפתחותיים השונים של חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס. רצפי גנים היעד ניתן להשיג חסכוני באמצעות הרכבה של transcriptomes נגד קרוב משפחה עם גנומיקה ידועה או דה נובו. שיבוט גנים מועמד מנצל וקטור שיבוט ספציפי (pCR4-TOPO plasmid), המאפשר סינתזה של RNA כפול גדילים (dsRNA) עבור כל גן עם שימוש פריימר משותף יחיד. DSRNA מסונתז ניתן להזריק לתוך עוברים עבור תהליכים התפתחותיים מוקדמים או זחלים לתהליכים התפתחותיים מאוחרים יותר. לאחר מכן אנו ממחישים כיצד ניתן להזריק RNAi לזחלים ימיים באמצעות אימוביליזציה באגרוז. כדי להדגים את הטכניקה, אנו מספקים מספר דוגמאות של ניסויי RNAi, יצירת נוקאאוטים ספציפיים עם פנוטיפים צפויים. באופן ספציפי, RNAi עבור הגן שיזוף laccase2 מוביל הבהרה הציפורן הן זחלים ומבוגרים, white ו RNAi עבור הגן פיגמנטציה העין לבן מייצר הבהרה / חוסר פיגמנטציה בצינורות עיניים. בנוסף, הנוקאאוט של חלבון עדשת מפתח מוביל זחלים עם ליקויים אופטיים ויכולת מופחתת לצוד טרף. יחד, תוצאות אלה מדגישות את העוצמה של RNAi ככלי לחקירת דפוסים מורפולוגיים ותכונות התנהגותיות באורגניזמים עם מסדי נתונים תעתיק בלבד.

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, הפלנו שלושה גנים whiteשונים, כלשהם לבנים, laccase2 (lac2), ועדשה3 (שולחן 1), במגוון שלבים התפתחותיים שונים של חיפושית הצלילה Sunburst T. marmoratus. ביצענו RNAi ב T. marmoratus על ידי הזרקת dsRNA בשלב מוקדם מאוד במהלך embryogenesis(איור 1A). מכיוון שחלק מהעוברים אינם שורדים את התהליך ולהפוךלנמק (איור 1B),יש להסירם כדי לשמור על בריאות העוברים הנותרים. מופת כאן זריקות של dsRNA נגד הגן הלבן. גן זה ידוע ב Drosophila כאחד משלושה משגרי קלטת ATP מחייב (ABC) מעורב ספיגה ואחסון של מבשרי פיגמנטהעין 23. בהתאם לכך, אובדן התפקוד שלו תוצאה של פנוטיפ לא מנוון, עין לבנה. התוצאות שלנו מראות כי הזריקות של dsRNA white מיקוד הגן הלבן אורתולוגי בעוברי T. marmoratus מוביל לאובדן פיגמנטציה בעיניים בזחלים חדשים המתעוררים. במקרה זה, זחלי סוג פראי מאופיינים בעיניים פיגמנט כבד, ואת RNAi נוק-דאון של לבן מוביל לרמות שונות של הפחתה ואפילו חיסול מלא של פיגמנט עיניים. בסך הכל, ראינו לפחות ירידה מסוימת בצבע העיניים ב-34% מהעוברים ששרדו (n = 35). איור 2A משווה אדם בשליטה לבין אדם עם צבע עיניים מעט בהיר יותר. איור 2B ממחיש נוק-דאון חמור יותר באדם, שבו העיניים האוורניות יותר (עיניים 2-5) של האשכול אינן מנוקבות לחלוטין, בעוד שעיני הגב עדיין מראות פיגמנטציה מסוימת. הבדלים אלה מדגישים כיצד היעילות של הנוק-דאון יכולה להשתנות באופן אזורי, אשר עשוי להיות קשור להבדלים ביעילות של חדירה dsRNA ברקמה צפופה. אדם אחר מראה למעשה אובדן פיגמנט מוחלט בכל העיניים(איור 2C).
כדי לחקור כמה טוב RNAi עובד בשלב הזחל של T. marmoratus, הזרקנו dsRNA מיקוד lac2 גן tannic לתוך זחלים instar השני כמה ימים לפני שהם היו בשל molt לתוך instars שלישי (איור 3) והעריך את ההשפעה על צבע ציורי של זחלים instar השלישי. Lac2 הוא סוג של פנולוקסידאז המכין חלבונים באופן חמצוני כדי להפוך אותם לבודדים, קשים וכהים יותר. נוק-דאון חיפושית הקמח T. castaneum כבר הראה להוביל אנשים צבעוניים בהירים במינונים נמוכים, אבל נחשב קטלני במינוניםגבוהים 24. איור 4 ממחיש כי טיפול זה מוביל גם זחלי חיפושית Sunburst בצבע בהיר יותר. באופן ספציפי, בניסוי זה, 75% מהזחלים המוזרקים ששרדו (n = 12) הפחיתו פיגמנטציה (לעומת 0% בקבוצת הביקורת). איור 4א מראה אדם עם depigmentation מתון יחסית, בעוד איור 4C ממחיש את הראש של זחל T. marmoratus שבו הצבע הכהה של העורון כמעט נעדר. ההתגה הייתה בולטת במיוחד עבור התבניות הכהות המרכזיות האופייניות לזחלים אלה, בעוד שתבנית זו נותרה גלויה בבירור באדם שהוזרקלבקרה (איור 4B). בנוסף, נצפה הקלות של קנה הנשימה של הזנב, כפי שמתואר בדמות 4D. במקרה שבו lac2 dsRNA הוזרק לתוך זחלים instar השלישי, אנשים מבוגרים קלים יותר הושגו(איור 5). שימו לב כי כנפי החיפושית הנוקאאוט מעוותות במקצת, ככל הנראה בשל רכותה יוצאת הדופן.
בנוסף לשינוי תכונות מורפולוגיות, ניתן להשתמש ב-RNAi כדי למקד גנים המשפיעים על ההתנהגות. כדי להדגים זאת, ביצענו RNAi נגד גן קידוד חלבון עדשת מפתח, Lens318, והזרקנו אותו לתוך זחלים instar השני כדי להשפיע על המאפיינים האופטיים של עיני זחל instar שלישי. כל ההשפעות על העדשה שנצפתה כאן סביר להניח כי העיניים של T. זחלי marmoratus לעבור צמיחת עיניים גדולה במעבר זה, אשר כרוך גם שינויים אופטיים גדולים שלהעדשה 25. RNAi נוקאאוט בניסוי זה היה יעיל מאוד. אימות באמצעות qPCR הראה 100% אחוזי הצלחה; מתוך 13 אנשים שנבדקו, 12 הופלו לפחות מ-10% מרמת הביטוי של אנשים בעלי שליטה, כאשר הפרט הנותר בעל רמת ביטוי של 17% מרמת הבקרה (תצפית שלא פורסם). ברמה הפנוטיפית, רק אנשים מסוימים היו נכים קשות או לא מסוגלים ללכוד טרף, כפי שמוצג בדמות 6 לאדם שהתקרב שוב ושוב לטרפו ממרחק קרוב מאוד אך באופן עקבי התעופף עליו.
טבלה 1: רצפי פריימר ואפליונים לחלבונים לבנים, lac2 ו-Lens3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61477/Table1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig01.jpg"> איור 1: איור של זריקות עובר. (א)עוברים מפורקים בשורה על צלחת agarose מוזרק ליד המרכז שלהם באמצעות מחט microinjection מלא dsRNA ומזון המכיל חיץ הזרקה. סרגל קנה המידה מייצג 500 μm. אדםעם נוק-דאון חמור יותר. עוברים מוזרקים נשמרים בתא לחות ומנווטרים מדי יום כדי להבקיע פנוטיפים ולהסיר אנשים מתים (שהפכו לחומים). סרגל קנה המידה מייצג 5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig01large.jpg" target="_blank">מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig02.jpg"> איור 2: דוגמה לעוברים מפותחים שהוזרקו עם dsRNA נגד לבן. (א)השוואה של אדם עם ירידה בפיגמנטציה בעיניים (משמאל) ואדם שהוזרק לבקרה (מימין). E1-E6 מתייחסים לעיניים 1-6. (ב)אדם עם פנוטיפ נוק-דאון חמור יותר, אשר ממחיש כי, לפעמים, חלק מהעיניים בתוך האשכול מושפעים באופן חמור יותר על ידי הנוקאאוט מאחרים. (ג)אדם עם אובדן כמעט מוחלט של פיגמנטציה בעיניים. סרגל קנה המידה מייצג 200 μm; לוחות B ו- C מיוצגים באותו קנה מידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig03.jpg"> איור 3: איור של זריקות זחל. (א)כמה זחלים משותקים על ידי הטבעה ב 2% agarose עם זנב שלהם spiracles עזב ברור של כל agarose. (ב)Microelectrode המכיל את פתרון ההזרקה ממוקם כך הקצה שלה יכול לחדור את קרום פיין בין שני מקטעים. (ג)צבע הזרקה כחול גלוי באתר ההזרקה לאחר הזריקה. פסים בקנה מידה מייצגים 1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig03large.jpg" target="_blank">ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig04.jpg"> איור 4: RNAi עבור laccase2 מוחל על זחלים instar השני וכתוצאה מכך צבעי ציור מופחת בזחלים instar השלישי. (א)אובדן צבע מתון יחסית באדם lac2 RNAi (למטה) בהשוואה לאדם מוזרק שליטה (למעלה). סרגל קנה המידה מייצג 5מ"מ. (ב)ראש של אדם שליטה המציג את התבנית האופיינית בצבע כהה במרכז הראש. (ג)נוק-דאון חמור יחסית של lac2 המוביל לאובדן כמעט מוחלט של צבע ראש מרכזי. (ד)אובדן צבע בציור הזנב הראשי של אדם lac2 RNAi (למטה) בהשוואה לאדם שהוזרק לבקרה (למעלה). הסתכם מייצגים 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig04large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig05.jpg"> איור 5: RNAi עבור laccase2 מוחל על זחל instar שלישי וכתוצאה מכך צבעי ציור מופחתבמבוגל. הפרט הנוקאאוט (שמאל) מאופיין גם elytra רך מאוד בהשוואה לפקד (מימין). סרגל קנה המידה מייצג 5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig05large.jpg" target="_blank">מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig06.jpg"> איור 6: נוק-דאון של חלבון עדשה מרכזי המוביל לליקויים בלכידת טרף. אני לאיודע מה זה אומר. שלוש דוגמאות שבהן זחל חיפושית צלילה Sunburst, שבו גירעונות אופטיים היו מושרה באמצעות RNAi, לא הצליח ללכוד טרף (זחלי יתושים). תמונות סטילס מייצגות נבחרו מתוך הקלטת וידאו של לכידת טרף אופיינית. זחלשליטה תופס טרף. כל הסורגים בקנה מידה מייצגים 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig06large.jpg" target="_blank">ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points at JoVE.com

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

אפילו כאשר עריכת גנים הפכה לפופולרית לחקר הגנטיקה המולקולרית של אורגניזמים שאינם מודלים, RNAi נשאר כלי סינרגטי רב עוצמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול להיות מיושם על שלבים התפתחותיים שונים. בנוסף, ניתן להשתמש בהפלה חלקית כדי לחקור את כל הגנים האלה.ההצלחה של ההליך מסתמכת על הזרקת DSR ויש נזק מינימלי. זה דורש תרגול, אז אל תתייאש אם זה לוקח כמה ניסיונות כדי לקבל את זה נכון. כדי להכין עוברים בשלב מוקדם להזרקת מיקרו, יוצקים תחילה 20% רותחים לתוך צלחת פטרי קטנה ומ מניחים שלושה צינורות פלסטיק ברוחב 1-2 מ"מ על פני הנוזל לפני שהוא מתגבש.לאחר שהתעוררות התגבשה השתמשו בזוג מדפים קהים כדי להסיר את הצינורות ולכסות את החריצים הנובעים מכך ב-500 מיקרוליטרים של מים מזוקקים אוטוקלאבים. כאשר מיכל הקולקציה מוכן להשתמש במברשת צבע שיער טבעית עדין להעביר חמישה שמונה שעות עובר T.marmoratus בן מאתרי קינון חיפושית לתוך צלחת חלל זכוכית מלא מים מזוקקים autoclave תחת מיקרוסקופ סטריאו. באמצעות מיקרוסקופ ומטלות ניתוח בסדר לתפוס את chorion של כל עובר משני הצדדים לקרוע את chorion פתוח המאפשר לעובר להחליק בעדינות מתוך הרקמה.לאחר הסרת שתי שכבות chorion מכל העוברים שנאספו להשתמש במברשת צבע כדי להעביר בזהירות את העוברים מן צלחת חלל הזכוכית לתוך החריצים של צלחת אגרוז מוכן. כדי להזריק עוברים בשלב מוקדם עם RNA גנים ספציפיים כפול תקוע תחילה להכין מחטי microinjection על פולר מחט ולהשתמש במיקרוסקופ סטריאו ולמצוא מדפים לשבור כל קצה לקצה חד. לאחר זריקת מלאי מטוהרים כפול תקועים RNA של עניין על קרח, להוסיף microliter אחד של חיץ הזרקה 10X לפתרון וכתוצאה מכך ולהשתמש במים מזוקקים כפולים כדי להביא את נפח ויניל של הפתרון 10 microliters.השתמש פיפטה P10 כדי backfill אחד מחטי microinjection מוכן עם פתרון RNA תקוע כפול עובד לטעון את המחט לתוך מחזיק microneedle מחובר למערכת microinjection שמשתמש בטכנולוגיית פליטת לחץ. הפעל את מערכת microinjection ואת אספקת האוויר בלחץ ולהשתמש שסתום מיקרו על מערכת microinjection כדי להגדיר את לחץ ההזרקה ל 15 ק"ג של לחץ לאינץ 'מרובע ואז להשתמש ידית התאמת זמן כדי להגדיר את משך ההזרקה לשניות. כדי לכייל את מחט ההזרקה להעריך את נפח בועת הנוזל שנוצר בקצה המחט בעת הזרקת לאוויר עבור עובר T.marmoratus להשתמש בגודל בועה אופטימלית של 100 עד 200 מיקרון.מחט ההזרקה היא באיכות טובה אם בועות אופטימליות ניתן להשיג ב 15 ק"ג של לחץ לאינץ 'מרובע עם משך הזרקה של כשלוש שניות. כאשר המחט להגדיר מוכן ליישר את המחט על צלחת agarose של עוברים, כך המחט מתקרב העוברים בזווית של 45 עד 60 מעלות. השתמש במיקרו מניפולטור כדי להזיז לאט את המיקרונידל עד שהטיפ נוגע במשטח של אמצע עובר אחד ואז בזהירות להזיז את המחט קדימה עד שהוא פשוט חודר את פני השטח של העובר.ברגע המחט היא בתוך העובר בזהירות ללחוץ על כפתור הזרקת מזרק מיקרו כדי לספק אחד עד שני nanoliters של RNA תקוע כפול לתוך העובר. כאשר כל RNA נמסר לאט לסגת המחט מן העובר מבלי לגרום לעובר להיקרע. עוברים מוזרקים בהצלחה ניתן לזהות על ידי נוכחות של נקודה צבעונית באתר של הזרקה.כאשר כל העוברים הוזרקו בזהירות למקם את המנה לתוך תא לחות באינקובטור 25 מעלות צלזיוס להגדיר מחזור אור 14 שעות 10 שעות כהה במשך ארבעה עד חמישה ימים. נטר את התקדמות התפתחות העובר מדי יום תחת מיקרוסקופ הסטריאו כדי לזהות פנוטיפים נוקאאוטים גלויים למורפולוגית. שימוש במצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה כדי לתעד את תהליך הפיתוח.הסר את כל העוברים המתים ולחדש את המים על צלחת האגרוז מדי יום, כדי למנוע יירוז והתפשטות של זיהום מיקרוביאלי לעוברים אחרים ששרדו במהלך תקופת הדגירה. לפני איסוף הזחל הראשון להוסיף 60 עד 70 מעלות צלזיוס 2% נוזלי agarose לצלחת פטרי קטנה. כאשר agarose יש מוצק להשתמש מדפים קהה לעשות קבוצה רדודה אחת לכל זחל להיות מוזרק לתוך אגרוז בעדינות לנקז את המים מן כוסות תרבות הזחל.לאחר ההרדמה להשתמש מטלפים קצה רך בזהירות למקם את הזחל על צלחת קיבוע עם הצווארים והגוף בחריצים אבל הזנב ממוקם מעל פני השטח agarose. כאשר כל הזחל הונח, לכסות כל לבה עם שכבה עבה של אגרוז כי הוא עדיין נוזלי אבל לא חם בצורה מסוכנת ללא כל סיפורים כי היו מכוסים בטעות לפי הצורך. עבור microinjection RNA תקוע כפול לטעון microneedle עם הגן ספציפי כפול תקוע RNA פתרון עבודה של עניין כפי שהוכח.רדרג את הבוכנה של מזרק microinjection נשלט ידנית לטעון את המחט על מערכת microinjection. מקם את הזחל משותק תחת מיקרוסקופ סטריאו כך אתר ההזרקה מיושר עם המסלול של מחט microinjection בזווית שטוחה יחסית. השתמש במיקרו מניפולטור כדי להעביר בזהירות את קצה המחט לתוך הזחל לאט ובזהירות להפעיל לחץ על המזרק, התאמת לחץ ההזרקה על פי התנועה של נוזל ההזרקה הצבעונית במחט לפי הצורך.כאשר כל ה- RNA הוזרק להשתמש במקלפים רכים כדי לשחרר את הזחל מן agarose ולהחיל את הזחל לתוך מיכל חדש של מים בטמפרטורת החדר ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס ומחזור אור 14 שעות 10 שעות כהה. בניתוח מייצג זה שלושה גנים שונים הופלו במגוון שלבים התפתחותיים שונים של חיפושית הצלילה של קרני השמש T.marmoratus. הפרעת RNA מבוצעת כפי שהוכח על ידי הזרקת RNA כפול תקוע בשלב מוקדם מאוד של עובר.חלק מהעוברים אינם שורדים את התהליך והפכו לנמקים. בתמונות אלה הם שולטים הפרט אדם עם צבע עיניים בהיר מעט ניתן לראות. באדם זה, הפלה חמורה יותר שבה השקרים הגחוני יותר של האשכול הם unpigmented לחלוטין, אבל בעלי הברית לעשות עדיין להראות קצת פיגמנטציה ניתן לראות.כאן דוגמה של אדם אחר עם אובדן פיגמנט שלם במהותו בכל העיניים מוצגת. Lac2 הפיל בתוצאות זחלים קוטיקל פחות פיגמנט, אנשים בוגרים קלים יותר עם כנפיים מעוותות במקצת סביר בשל הרכות יוצאת דופן של הרקמה הושגו גם. הקפד להסתכל בחריפות כדי להתבונן מקרוב בבעלי החיים המוזרקים שלך על בסיס יומי ולהסיר באופן מיידי את כל האנשים המתים.כוחה של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה על הגנים של אורגניזמים רבים ושונים. טכניקה זו גם יישמת באופן נרחב ומצליח על ביולוגיה התפתחותית אבולוציונית.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Environment

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

פרוטוקול ניסוי להטרוגניות קרקע מושרה צמח מניפולציה

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

אפיון ויישום של דוגמים פסיביים עבור ניטור של דברה במים

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

שיטה חלופית של הסרת Otoliths מ חדקן

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

מערכת חשיפת זרימה דרך להערכת מושעה משקעים השפעות על חיים ימיים

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

זיפרגליים Balanus improvisus כמודל ימית - Culturing, ביטוי גנים

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

נסיוני לבחינת תגובה התנהגותית פרופילים בדגים זחל: ליישום הקפאין נוירו-ממריץ

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...