Name: rna interference in aquatic beetles as a powerful tool for manipulating gene expression at specific developmental time points
Uploaded: 2020-05-29T15:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Josh Benoit por sua ajuda com a bioinformática Hailey Tobler por sua ajuda na criação de Besouros sunburst e Tamara Pace para assistência editorial. Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation sob as bolsas IOS-1456757 e IOS-1856341 para EKB e IOS1557936 para YT.

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Os autores não têm nada a revelar.

Nosso objetivo é que esta compilação de métodos torne a RNAi amplamente disponível, especialmente porque esta ferramenta continua sendo uma poderosa técnica sinérgica para a edição de genes baseada em CRISPR/Cas9, com a vantagem de que ela pode ser aplicada aos estágios de desenvolvimento desejados dos organismos estudados. Para exemplificar essa força, injetamos dsRNA em embriões e em diferentes estágios larvais. As injeções em ovos afetaram o desenvolvimento de embriões(Figura 2),injeções no segundo estágio larval tiveram efeitos aparentes no terceiro estágio larval(Figura 4 e Figura 6),e as injeções no terceiro estágio larval mostraram efeitos nos adultos(Figura 5). Embora o tempo exato tenha que ser estabelecido experimentalmente, geralmente, as injeções fazem efeito dentro de alguns dias. O sucesso desse processo pode ser afetado pelo comprimento da sequência dsRNA. Aqui, apresentamos exemplos usando pouco mais de 200 bp a mais de 800 bp. Como regra geral, as sequências entre 100 e 600 bp são preferidas para limitar os efeitos fora do alvo, mas as sequências de até 1000 bp produzem bons resultados22. Uma questão em relação ao RNAi é a duração do knockdown que pode ser alcançado através desta técnica. Como os fenótipos eram terminais em cada etapa, não podemos comentar sobre esse assunto com base nos resultados apresentados. No entanto, já foi observado anteriormente que os efeitos RNAi são geralmente relativamente longos, e que concentrações mais altas levam a knockdowns mais duradouros20.
Uma limitação dessa técnica é que ela funciona melhor para alguns organismos do que para outros, e parece não haver uma maneira direta de prever o quão bem funcionará a priori. No entanto, tem sido encontrado para funcionar bem para uma grande variedade de organismos diferentes. Dentro dos artrópodes, isso inclui aracnídeos26, crustáceos27, e uma variedade de insetos, com taxas de sucesso particularmente altas em besouros28. Outra complicação é que as diferenças na gravidade do fenótipo ocorrem frequentemente entre os indivíduos, apesar da aplicação da mesma quantidade de dsRNA. Conforme ilustrado na Figura 2B,a variação pode até ocorrer dentro de um indivíduo. Em nossos estudos RNAi visando diferentes genes envolvidos no desenvolvimento dos olhos larvais T. marmoratus, descobrimos frequentemente que alguns olhos são afetados mais severamente do que outros. Este fenômeno pode estar relacionado ao tecido relativamente denso do aglomerado ocular, com o dsRNA mais capaz de alcançar algumas das unidades.
Para a execução bem sucedida de experimentos RNAi, é fundamental que vários parâmetros sejam otimizados para o gene alvo. Por exemplo, a concentração do dsRNA e o comprimento do gene alvo podem influenciar fortemente o resultado20. Outro parâmetro crítico é como as injeções são executadas, pois esse processo pode influenciar muito a taxa de sobrevivência. Para os embriões, alcançamos os melhores resultados mirando o centro do embrião. Uma placa bem disposta permite a injeção de 100 ou mais embriões em uma única sessão. Para larvas, é fundamental inserir a agulha de injeção entre os segmentos. Essas injeções requerem mais dsRNA, e com base na disponibilidade de larvas, nossos conjuntos de injeção aqui normalmente consistiam apenas de alguns animais de cada vez. Para todas as injeções, é fundamental evitar que o ar entre no organismo.
Em alguns casos, os loops de feedback de uma rede de regulação genética e redundância genética podem influenciar a penetração dos fenótipos RNAi, apesar de knockdowns consistentes. Este parece ser o caso de nossas observações comportamentais de larvas com knockdowns altamente bem sucedidos de uma proteína de lente proeminente, Lens318. Embora tenhamos verificado a alta eficiência desses knockdowns através do qPCR, observou-se variação considerável nos fenótipos associados. Este resultado destaca a necessidade de quantificar adequadamente os knockdowns RNAi (para detalhes sobre as opções ver22). Se não há uma expectativa clara de a priori em relação aos fenótipos resultantes, uma boa maneira de controlar os efeitos fora do alvo da RNAi é atingir o mesmo gene com duas sequências não sobrepostas de dsRNA e avaliar os resultados para fenótipos comuns.
Em contraste com as técnicas de edição de genes, a RNAi também é uma ferramenta poderosa para estudar genes letais, e há duas maneiras de fazê-lo. Por exemplo, se alguém está interessado na contribuição funcional de um gene onde a perda de função no início do desenvolvimento é conhecida como letal, uma investigação funcional de tal gene pode ser alcançada simplesmente permitindo que o animal se desenvolva normalmente e, em seguida, derrubando o gene via RNAi mais tarde em desenvolvimento (ou seja, no adulto). Alternativamente, um gene onde a perda completa de função é conhecida como letal pode ser investigado através de um knockdown parcial, que pode ser alcançado injetando uma série de concentrações de dsRNA. Alguns de nossos resultados mostram knockdowns de lac2, que são conhecidos por serem letais se a cutícula em insetos se tornar excessivamente macia24. Mesmo o besouro lac2 RNAi retratado na Figura 5 seria improvável de sobreviver fora das condições laboratoriais. Outro gene letal é o corte, que codifica um fator de transcrição que é fundamental para a especificação do destino celular em vários sistemas de órgãos em artrópodes e tem sido ligado ao desenvolvimento da glia no sistema visual Drosophila 29. Com base em nossa experiência com rnai cortado em embriões T. marmoratus, podemos evocar fenótipos informativos oculares em embriões que são capazes de completar seu desenvolvimento ocular embrionário (observações inéditas). Aqui, doses mais altas parecem levar a maiores taxas de letalidade, enquanto doses mais baixas resultam em fenótipos observáveis e informativos.
Nosso protocolo não apenas lista os passos necessários para um pesquisador prosseguir experimentos RNAi em T. marmoratus,como ilustrado, mas também é geralmente aplicável a outros organismos, especialmente organismos aquáticos. Entre os organismos aquáticos, já existem vários exemplos dentro dos crustáceos, como as pulgas de água Dafnia30 e camarão (para uma revisão recente, veja referência31). Há amplas oportunidades entre insetos aquáticos, pois estima-se que eles compõem cerca de 6% de toda a diversidade de insetos, com provavelmente mais de 200.000 espécies32. Além disso, a RNAi já foi realizada em andaridores de água que tendem a habitar a superfície dos ambientes aquáticos33. Se nenhum genoma estiver presente, então um transcriptome pode ser montado de novo. Desde que este processo revele contigas de algumas centenas de nucleotídeos, dsRNA contra genes específicos pode ser projetado. Nosso protocolo para imobilizar insetos em agarose provavelmente também será útil para outros procedimentos, especialmente para organismos macios, maleáveis e aquáticos. Juntos, a RNAi continua sendo uma técnica poderosa para manipular a expressão genética em um grupo diversificado de organismos, mesmo quando não há outras ferramentas moleculares e genéticas disponíveis.

A questão de como genes específicos contribuem para a evolução de traços diversos é um tema emocionante na biologia. Ao longo das últimas décadas, muito progresso foi feito em relação à dissecação dos fundamentos genéticos dos processos de desenvolvimento em alguns organismos modelo, como o nematode Caenorhabditis elegans, a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster, e o rato da casa Mus musculus1. Mais recentemente, a invenção de técnicas poderosas de edição de genes, como repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/Cas92, proporcionou a capacidade de alterar o código genético de organismos não-modelo (porexemplo,ver3,4). Como resultado, houve um aumento nos estudos genéticos sobre uma variedade de organismos que não haviam sido abordados anteriormente através de técnicas moleculares. Considerando a enorme diversidade do nosso reino animal, com muitos traços interessantes ou variâncias de traços que só são representados em espécies específicas, esse progresso tornou-o um momento emocionante para o trabalho relacionado à biologia evolutiva-de-desenvolvimento ("evo-devo"). No entanto, as técnicas de edição de genomas que estão disponíveis para organismos não-modelo são relativamente restritas em relação aos pontos de tempo de desenvolvimento aos quais podem ser aplicados, tornando desafiador discernir as propriedades temporais relacionadas ao papel que genes específicos desempenham em qualquer característica. Além disso, as técnicas transgênicas são muitas vezes limitadas a genes que não são essenciais para a sobrevivência (ou seja, cujo nocaute não resulta em letalidade). Portanto, embora as técnicas de edição de genes tenham começado a se popularizar, ainda há a necessidade de técnicas eficazes aplicáveis a uma variedade de organismos diferentes em pontos de tempo específicos de desenvolvimento e facilitam knockdowns parciais (em vez de perda completa de função). Aqui, chamamos a atenção para a interferência de RNA (RNAi), uma técnica de knockdown genética um pouco datada, maspoderosa, que é particularmente valiosa como uma abordagem sinérgica para a edição de genes. Especificamente, desenvolvemos procedimentos que permitem a aplicação do RNAi aos besouros de mergulho aquático como exemplo que ilustra a implementação desta técnica, desde a aquisição das sequências moleculares necessárias até a injeção bem sucedida de RNA de duplaridade (dsRNA) em ovos e larvas.
O knockdown genético baseado em RNAi aproveita um mecanismo de defesa inata de organismos, no qual moléculas de dsRNA facilitam o silenciamento de sequências de ácido nucleico invasor, como vírus e transposons6. Resumindo, o dsRNA é levado para dentro da célula, onde é cortado em 20-25 pedaços de nucleotídeos pela enzima Dicer. Essas peças então ativam a formação do complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC), que inibe o mRNA direcionado, vinculando-se a ele em locais específicos usando a cadeia guia. Esse processo acaba por levar à degradação do mRNA e, portanto, interfere na tradução do mRNA para a respectiva proteína6. A técnica de knockdown genético baseada em RNAi apresentada aqui, portanto, conta com a injeção de dsRNA. Para modelos animais, essa técnica foi originalmente desenvolvida em C. elegans7 e D. melanogaster8, mas desde então surgiu como uma poderosa ferramenta genética funcional em organismos não-modelo9,,10. Devido à sua natureza altamente eficaz em alguns insetos, a RNAi pode até ser aplicada no manejo de pragas11.
Como ferramenta de pesquisa, a RNAi tem sido usada para examinar como as principais vias de desenvolvimento molecular funcionam em modelos de insetos não tradicionais. Por exemplo, rnAi no besouro de farinha Tribolium castaneum tem sido fundamental para determinar o quão profundamente conservados genes contribuem para traços específicos naquele besouro, como exemplificado para o desenvolvimento de asas especificamente moldadas12,,13,,14 e olhos15,,16. As técnicas que estão por trás das manipulações em T. castaneum foram bem descritas17 e contam com a capacidade de imobilizar ovos e larvas relativamente secos em uma superfície pegajosa. Essa imobilização, no entanto, não é possível para as formas de desenvolvimento úmido de organismos aquáticos como o Fusca de Mergulho Sunburst Thermonectus marmoratus. Como é o caso de muitos organismos modelos não tradicionais, ele não tem um genoma anotado. Manipular a expressão genética em qualquer organismo sem genoma, um primeiro passo razoável e econômico é gerar transcritos e identificar as sequências putativas de nucleotídeos dos genes de interesse expressos com base na similaridade sequencial com organismos modelos relacionados, mas mais estabelecidos, neste caso, principalmente os genes Tribolium (Coleoptera) e Drosophila.
Aqui, para demonstrar como o RNAi pode ser usado em um organismo aquático, primeiro discutimos protocolos e softwares para extração de RNA e geração e montagem de transcriptome, que permitem a identificação de sequências genéticas específicas direcionadas. Resumimos então os passos necessários para sintetizar o dsRNA específico de genes. Posteriormente, ilustramos como os ovos podem ser injetados em um ambiente aquático e demonstramos protocolos de incubação para a cultura de embriões em desenvolvimento. Além disso, mostramos como o gel de agarose pode ser usado para imobilizar completamente as larvas durante o processo de injeção, uma técnica que geralmente é útil durante vários procedimentos e pode ser aplicada a uma variedade de artrópodes. Para demonstrar como o RNAi pode ser aplicado a diferentes estágios de desenvolvimento, incluímos um exemplo no qual silenciamos o gene da pigmentação dos olhos branco em embriões. Além disso, descrevemos um exemplo no qual o gene de bronzeamento laccase2(lac2) foi silenciado durante a segunda instar larval (para afetar larvas da terceira instar larval) quanto a terceira instar larval (para afetar adultos). Finalmente, demonstramos que a injeção de uma menor concentração de dsRNA leva a um knockdown parcial, o que mostra que essa técnica também pode ser aplicada a genes onde a perda de função é conhecida por ser letal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>University Stockroom</td>
			<td></td>
			<td>Typically locally available at research institutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>size dependent</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74804</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer (NnanoDrop)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>9836674</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2. De novo transcriptome assembly.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUSCO.v3</td>
			<td>https://busco.ezlab.org/</td>
			<td></td>
			<td>Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomics workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832021</td>
			<td>Other equivalent software packages are also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy workbench</td>
			<td>https://usegalaxy.org/</td>
			<td></td>
			<td>An open source online transcriptome assembly &#38; annotation pipeline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI BLASTx</td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&#38;PAGE_TYPE=BlastSearch&#38;PROGRAM=blastx</td>
			<td></td>
			<td>An open source online alignment and annotation pipeline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. cDNA synthesis, Cloning &#38; Miniprep isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin sodium salt</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscript RT (reverse trasncription) kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205111</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot&#8482; TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>771471</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker-incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>211DS</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer (NnanoDrop)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>9836674</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermal cycler for PCR</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1845069</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal Solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0941</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2 PCR amplification &#38; in vitro dsRNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastTaq DNA Polymerase, dNTPack</td>
			<td>Roche</td>
			<td>13873432</td>
			<td>This kit contains all the reagents necessary for a PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcriiption clean up kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Detailed specific protocol is provided with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td>Make 3M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (NnanoDrop)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>9836674</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9180</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (Dumon #4 Biology)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cavity dish (3 well-dish)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-243-43</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwave</td>
			<td>Welbilt</td>
			<td>turn-table</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>natural hair paintbrush</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any fine brush will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micro-pipetter</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Microsocope Central</td>
			<td>10446293</td>
			<td>Any good stereomicroscope will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-109</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital camera</td>
			<td>Edmund optics (Qimaging)</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>food dye</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td>Any available food dye should work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidity chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>Labline</td>
			<td>203</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 &#181;L of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 &#181;L of 0.5 M potassium chloride solution, 100 &#181;L of food dye and 790 &#181;L of double-distilled water. Store in 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>intracellular Microinjection Systems (Picospritzer)</td>
			<td>Parker</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Currently the model III is available, but older models work also</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672441</td>
			<td>Other products would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>603000</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td>Any quality micromanipulator will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monosodium phosphate</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 micro-pipetter</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micro-pipetter</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate buffer (0.1M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Microsocope Central</td>
			<td>10446293</td>
			<td>Any good stereomicroscope will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (Dumon #4 Biology)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Products from other vendors would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>603000</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjection syringe</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>603000</td>
			<td>Other models would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672441</td>
			<td>Other products would work equally well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Microsocope Central</td>
			<td>10446293</td>
			<td>Any good stereomicroscope will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna interference in aquatic beetles as a powerful tool for manipulating gene expression at specific developmental time points

A interferência de RNA (RNAi) continua sendo uma técnica poderosa que permite a redução direcionada da expressão genética através da degradação do mRNA. Esta técnica é aplicável a uma grande variedade de organismos e é altamente eficiente na ordem rica em espécies Coleoptera (besouros). Aqui, resumimos os passos necessários para o desenvolvimento dessa técnica em um novo organismo e ilustramos sua aplicação aos diferentes estágios de desenvolvimento do besouro de mergulho aquático Thermonectus marmoratus. As sequências genéticas de destino podem ser obtidas de forma econômica através da montagem de transcriptomes contra um parente próximo com genômica conhecida ou de novo. A clonagem de genes candidatos utiliza um vetor de clonagem específico (o plasmídeo pCR4-TOPO), que permite a síntese de RNA de dupla cadeia (dsRNA) para qualquer gene com o uso de um único primer comum. O dsRNA sintetizado pode ser injetado em embriões para processos de desenvolvimento precoce ou larvas para processos de desenvolvimento posteriores. Em seguida, ilustramos como o RNAi pode ser injetado em larvas aquáticas usando a imobilização em agarose. Para demonstrar a técnica, fornecemos vários exemplos de experimentos RNAi, gerando knockdowns específicos com fenótipos previstos. Especificamente, RNAi para o gene de bronzeamento laccase2 leva à clareamento de cutículas em larvas e adultos, e RNAi para o gene de pigmentação dos olhos branco produz uma clareamento/falta de pigmentação em tubos oculares. Além disso, o knockdown de uma proteína de lente-chave leva a larvas com deficiências ópticas e uma capacidade reduzida de caçar presas. Combinados, esses resultados exemplificam o poder da RNAi como ferramenta para investigar padronagem morfológica e traços comportamentais em organismos com apenas bancos de dados transcriômicos.

Usando o protocolo descrito acima, derrubamos três genes diferentes, como branco, laccase2 (lac2),e Lens3 (Tabela 1),em uma variedade de diferentes estágios de desenvolvimento do Fusca de Mergulho Sunburst T. marmoratus. Realizamos RNAi em T. marmoratus injetando dsRNA em um estágio muito inicial durante a embriogênese (Figura 1A). Como alguns dos embriões não sobrevivem ao processo e tornam-se necroses(Figura 1B),eles precisam ser removidos para manter os demais embriões saudáveis. Exemplificadas aqui estão as injeções de dsRNA contra o gene branco. Este gene é bem conhecido em Drosophila como um dos três transportadores de de ligação ATP (ABC) envolvidos na absorção e armazenamento dos precursores do pigmento ocular23. Assim, sua perda de função resulta em um fenótipo de olho branco não espigmentado. Nossos resultados mostram que as injeções de dsRNA visando o gene branco ortologous em embriões de T. marmoratus levam à perda de pigmentação ocular em larvas recém-emergentes. Neste caso, as larvas do tipo selvagem são caracterizadas por olhos fortemente pigmentados, e o knockdown RNAi de branco leva a vários níveis de redução e até eliminação completa do pigmento ocular. No geral, observamos pelo menos alguma redução na coloração dos olhos em 34% dos embriões sobreviventes (n = 35). A Figura 2A compara um indivíduo de controle e um indivíduo com cor de olho ligeiramente mais clara. A Figura 2B ilustra um knockdown mais severo em um indivíduo, no qual os olhos mais ventral (Olhos 2-5) do aglomerado são completamente despigmentados, enquanto os olhos dorsais ainda mostram alguma pigmentação. Essas diferenças destacam como a eficiência do knockdown pode variar regionalmente, o que possivelmente está relacionado a diferenças na eficácia da penetração de dsRNA em tecido denso. Outro indivíduo mostra essencialmente perda completa de pigmento em todos os olhos(Figura 2C).
Para investigar o quão bem rnAi funciona na fase larval de T. marmoratus, injetamos dsRNA visando o gene tânnico lac2 em segunda larva instar alguns dias antes de serem devidos a molt em terceiras estrelas(Figura 3) e avaliamos o efeito na coloração cuticular da terceira larva instar. Lac2 é um tipo de fenoxidase que conjuga oxidativamente proteínas para torná-las insolúveis, mais duras e escuras. Knockdown no besouro de farinha T. castaneum tem sido mostrado para levar a indivíduos de cor mais clara em doses baixas, mas é considerado letal em altas doses24. A Figura 4 ilustra que este tratamento também leva a larvas de besouros de mergulho de sunburst coloridos mais claros. Especificamente, neste experimento, 75% das larvas injetadas sobreviventes (n = 12) apresentaram pigmentação reduzida (em comparação com 0% no grupo controle). A Figura 4A mostra um indivíduo com despigmentação relativamente leve, enquanto a Figura 4C ilustra a cabeça de uma larva T. marmoratus na qual a coloração escura da cutícula está quase ausente. A despigmentação foi particularmente evidente para a padronização escura central típica dessas larvas, enquanto este padrão permaneceu claramente visível em um indivíduo injetado no controle(Figura 4B). Além disso, observou-se um clareamento da traqueia da cauda, como retratado na Figura 4D. No caso em que lac2 dsRNA foi injetado em terceiras larvas instar, indivíduos adultos mais leves foram obtidos(Figura 5). Note que as asas do besouro knockdown são um pouco deformadas, provavelmente devido à sua maciez incomum.
Além de alterar traços morfológicos, é possível usar RNAi para atingir genes que afetam o comportamento. Para demonstrar isso, realizamos o RNAi contra um gene de codificação de proteínas de lente-chave, Lens318, e injetamos-no em segunda larva instar para afetar as propriedades ópticas do terceiro olho larval instar. Quaisquer efeitos na lente aqui observados são prováveis porque os olhos das larvas de T. marmoratus sofrem um grande crescimento ocular nesta transição, que também envolve grandes alterações ópticas da lente25. O knockdown da RNAi neste experimento foi altamente eficiente. A verificação através do qPCR mostrou uma taxa de sucesso de 100%; dos 13 indivíduos testados, 12 foram derrubados para menos de 10% do nível de expressão dos indivíduos de controle, com o indivíduo restante tendo um nível de expressão de 17% do nível de controle (observação inédita). No nível fenotípico, apenas alguns indivíduos eram severamente deficientes ou incapazes de capturar presas, como é ilustrado na Figura 6 para um indivíduo que repetidamente se aproximou de sua presa de uma distância muito próxima, mas consistentemente a ultrapassou.
Tabela 1: Sequências de primer e amplicons para proteínas branca, lac2 e Lens3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61477/Table1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig01.jpg"> Figura 1: Ilustração de injeções de embriões. (A) Embriões descores alinhados em uma placa de agarose e injetados perto de seu centro usando uma agulha de microinjeção cheia de dsRNA e tampão de injeção contendo corante alimentar. A barra de escala representa 500 μm. (B) Um indivíduo com um knockdown mais grave. Embriões injetados são mantidos em uma câmara de umidade e monitorados diariamente para marcar fenótipos e remover indivíduos mortos (que ficam marrons). A barra de escala representa 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig02.jpg"> Figura 2: Exemplo de embriões totalmente desenvolvidos que foram injetados com dsRNA contra branco. (A) Comparação de um indivíduo com redução da pigmentação ocular (esquerda) e um indivíduo injetado no controle (direita). E1-E6 refere-se a Olhos 1-6. (B) Um indivíduo com um fenótipo de knockdown mais grave, que ilustra que, às vezes, alguns dos olhos dentro do aglomerado são mais severamente afetados pelo knockdown do que outros. (C) Indivíduo com perda quase completa de pigmentação ocular. A barra de escala representa 200 μm; Os painéis B e C estão representados na mesma escala. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig03.jpg"> Figura 3: Ilustração de injeções larvais. (A) Várias larvas imobilizadas pela incorporação em 2% de agarose com seus espirros traseiros deixados longe de qualquer agarose. (B) Microeletroda contendo a solução de injeção colocada para que sua ponta possa penetrar na membrana fina entre dois segmentos. (C) Corante de injeção azul visível no local da injeção após a injeção. As barras de escala representam 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig04.jpg"> Figura 4: RNAi para laccase2 aplicada à segunda larva instar resultando em coloração de cutícula reduzida em terceira larva instar. (A) Perda relativamente leve de coloração em um indivíduo lac2 RNAi (inferior) quando comparado com um indivíduo injetado no controle (superior). A barra de escala representa 5 mm. (B) Cabeça de um indivíduo de controle mostrando o padrão colorido escuro característico no centro da cabeça. (C) Knockdown relativamente severo de lac2 levando a uma perda quase completa da coloração central da cabeça. (D) Perda de coloração na cutícula traseira principal de um indivíduo lac2 RNAi (inferior) quando comparado com um indivíduo injetado no controle (superior). Barras de escala em B\u2012D representam 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig05.jpg"> Figura 5: RNAi para laccase2 aplicada a uma terceira larva instar resultando em coloração de cutícula reduzida em um adulto. O indivíduo knockdown (esquerda) também é caracterizado por elytra muito suave quando comparado com o controle (direita). A barra de escala representa 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig06.jpg"> Figura 6: Derrubada de uma proteína de lente principal levando a deficiências na captura de presas. (A-C). Três exemplos em que uma larva de Besouro de Mergulho Sunburst, na qual déficits ópticos foram induzidos através do RNAi, foi incapaz de capturar presas (larvas de mosquito). Imagens estáinas representativas foram selecionadas a partir de uma gravação de vídeo de capturas de presas características. (D)Controle da captura de larvas. Todas as barras de escala representam 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

A interferência de RNA é uma técnica amplamente aplicável e poderosa para manipular a expressão genética em estágios específicos de desenvolvimento. Aqui, descrevemos os passos necessários para a implementação dessa técnica no besouro de mergulho aquático Thermonectus marmoratus, desde a aquisição de sequências genéticas até o knockdown de genes que afetam a estrutura ou o comportamento.

Interferência de RNA em besouros aquáticos como uma poderosa ferramenta para manipular a expressão genética em pontos de tempo específicos de desenvolvimento

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Mesmo que a edição de genes tenha se tornado popular para estudar a genética molecular de organismos não-modelo, a RNAi continua sendo uma poderosa ferramenta sinérgica. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aplicada a diferentes estágios de desenvolvimento. Além disso, o knockdown parcial pode ser usado para estudar esses genes inteiros.O sucesso do procedimento depende da injeção de DSR e de ter danos mínimos. Isso requer prática, então não desanime se for preciso algumas tentativas para acertar. Para preparar embriões em estágio inicial para micro injeção, primeiro despeje a ebulição de 20% em uma pequena placa de Petri e coloque três tubos plásticos de um a dois milímetros de largura na superfície do líquido que surgiu antes de se solidificar.Uma vez que a agarose tenha solidificado use um par de fórceps contundentes para remover os tubos e cobrir as indentações resultantes com 500 microliters de água autoclave destilada. Quando o recipiente de coleta estiver pronto use uma escova de tinta de cabelo natural fina para transferir cinco embriões T.marmoratus de oito horas de idade dos locais de ninho de besouro em um prato de cavidade de vidro cheio de água autoclave destilada sob um microscópio estéreo. Usando o microscópio e as fórceps de dissecção fina agarram o acorde de cada embrião de ambos os lados e rasgam o acorde aberto permitindo que o embrião deslize suavemente para fora do tecido.Depois de remover ambas as camadas de chorion de todos os embriões coletados use o pincel para transferir cuidadosamente os embriões do prato de cavidade de vidro para as ranhuras da placa de agarose preparada. Para injetar embriões em estágio inicial com RNA duplo estonteado específico do gene primeiro preparar agulhas de microinjeção em um puler agulha e usar o microscópio estéreo e encontrar fórceps para quebrar cada ponta a uma borda afiada. Depois de jogar o estoque purificado de duplo fio RNA de interesse no gelo, adicione um microliter de tampão de injeção de 10X à solução resultante e use água dupla destilada para trazer o volume de vinil da solução para 10 microliters.Use uma pipeta P10 para enchir uma das agulhas de microinjeção preparadas com a solução de RNA dupla encalhada e carregar a agulha em um suporte de microagulha conectado a um sistema de microinjeção que utiliza a tecnologia de ejeção de pressão. Ligue o sistema de microinjeção e a fonte de ar pressurizada e use a micro válvula no sistema de microinjeção para ajustar a pressão de injeção a 15 quilos de pressão por polegada quadrada e, em seguida, use o botão de ajuste de tempo para definir a duração da injeção em segundos. Para calibrar a agulha de injeção avalie o volume da bolha de fluido que é formada na ponta da agulha ao injetar no ar para o embrião T.marmoratus use um tamanho de bolha ideal de 100 a 200 mícrons.A agulha de injeção é de boa qualidade se bolhas ideais podem ser alcançadas a 15 quilos de pressão por polegada quadrada com uma duração de injeção de cerca de três segundos. Quando a agulha configurada estiver pronta, alinhe a agulha na placa de agarose de embriões de tal forma que a agulha se aproxime dos embriões em um ângulo de 45 a 60 graus. Use o micro manipulador para mover lentamente o microagulha até que a ponta toque a superfície do meio de um embrião e mova cuidadosamente a agulha para a frente até que ela apenas perfure a superfície do embrião.Uma vez que a agulha esteja dentro do embrião pressione cuidadosamente o botão de injeção de micro injetor para entregar um a dois nanoliters de RNA duplo encalhado no embrião. Quando todo o RNA tiver sido entregue lentamente retraia a agulha do embrião sem causar a ruptura do embrião. Embriões injetados com sucesso podem ser identificados pela presença de um ponto colorido no local da injeção.Quando todos os embriões tiverem sido injetados cuidadosamente coloque o prato em uma câmara de umidade em uma incubadora de 25 graus Celsius definida para um ciclo escuro de 14 horas de luz de 10 horas por quatro a cinco dias. Monitore o progresso do desenvolvimento de embriões diariamente sob o microscópio estéreo para identificar fenótipos de knockdown morfologicamente visíveis. Usando uma câmera digital de alta resolução para documentar o processo de desenvolvimento.Remova quaisquer embriões mortos e reponha a água na placa de agarose diariamente para evitar a dessecação e a propagação da contaminação microbiana para outros embriões sobreviventes durante o período de incubação. Antes de coletar a larva adicione pela primeira vez 60 a 70 graus Celsius 2% líquido surgido a uma pequena placa de Petri. Quando a agarose solidificou o uso de fórceps contundentes para fazer um grupo raso por larva a ser injetado na agarose e drenar suavemente a água dos copos de cultura larva.Após a anestesia, use fórceps macios para colocar cuidadosamente a larva na placa de imobilização com os pescoços e corpos nas ranhuras, mas a cauda localizada acima da superfície da ágarose. Quando toda a larva foi colocada, cubra cada lava com uma espessa camada de agarose que ainda é líquida, mas não perigosamente quente e livre quaisquer contos que foram acidentalmente cobertos conforme necessário. para uma microinjeção de RNA duplamente encalhada carregar um microativo com a solução de trabalho de RNA dupla encalhada específica do gene, como demonstrado.Redescalgue o êmbolo de uma seringa de microinjeção controlada manualmente e carregue a agulha no sistema de microinjeção. Posicione a larva imobilizada sob o microscópio estéreo de modo que o local da injeção esteja alinhado com a trajetória da agulha de microinjeção em um ângulo relativamente plano. Use o micro manipulador para mover cuidadosamente a ponta da agulha para dentro da larva e aplicar lentamente e cuidadosamente pressão na seringa, ajustando a pressão de injeção de acordo com o movimento do fluido de injeção colorido na agulha, conforme necessário.Quando todo o RNA tiver sido injetado use fórceps macios para libertar a larva da agarose e colocar a larva em um novo recipiente de água de temperatura ambiente a 25 a 28 graus Celsius e um ciclo escuro de 14 horas de luz de 10 horas. Nesta análise representativa, três genes diferentes foram derrubados em uma variedade de diferentes estágios de desenvolvimento do besouro de mergulho de explosão solar T.marmoratus. A interferência de RNA é realizada como demonstrado pela injeção de RNA de dupla-encalhada em um estágio muito inicial de embriogênese.Alguns dos embriões não sobrevivem ao processo e se tornam necroses. Nessas imagens, eles controlam o indivíduo e um indivíduo com uma cor um pouco mais clara dos olhos pode ser observado. Neste indivíduo, um knockdown mais severo em que as mentiras mais ventral do aglomerado são completamente despigmentados, mas os aliados do ainda mostram alguma pigmentação pode ser observada.Aqui um exemplo de outro indivíduo com essencialmente perda completa de pigmento em todos os olhos é mostrado. Lac2 derrubado em larvas resulta em uma cutícula menos pigmentada, indivíduos adultos mais leves com asas um pouco deformadas provavelmente devido à maciez incomum do tecido também foram obtidos. Certifique-se de olhar atentamente para observar seus animais injetados diariamente e remover imediatamente quaisquer indivíduos mortos.O poder desta técnica é que ela pode ser aplicada aos genes de muitos organismos diferentes. Esta técnica também foi amplamente e bem aplicada à biologia do desenvolvimento evolutivo.

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