Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

وقد تلقى هذا العمل الدعم المالي من لجنة جورجيا للسلع للخضروات المشروع ID # FP00016659. يشكر المؤلفون الدكتور بينغشينغ جي، جامعة جورجيا والدكتورة آن دورانس، جامعة ولاية أوهايو لتقديمها ثقافات نقية من فيتوفاهورا SPP. كما نشكر لي وانغ وديلوريس فيني على مساعدتهما التقنية طوال فترة الدراسة.

1- الكشف في الموقع عن فيتفدورا capsici من مياه الري باستخدام التضخيم الأيزوحرارية المحمول بوساطة حلقة
<ol><li>إعداد المضخة والتصفية<ol>
<li>إرفاق قارورة تصفية إلى أنبوب متصل بمضخة يدوية بحيث عندما يتم تنشيط المضخة، سيتم سحب الهواء من خلال فم قارورة التصفية.</li>
		<li>تناسب قمع Buchner في سدادة المطاط...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops:+research+progress+and+management+challenges.">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li><li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water.">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li><li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water.">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li><li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov.">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li><li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens.">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici.">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici.">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li><li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani.">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).</li><li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

اختبار مياه الري لل phytopathogens هو خطوة حاسمة للمزارعين باستخدام أحواض الري والمياه المعاد تدويرها27. توفر أحواض الري خزاناً وأرضاً خصبة لعدد من الباتات النباتية حيث يتم توجيه مياه الري الزائدة من الحقل إلى البركة التي تحمل معها أي مسببات الأمراض التي قد تكون موجودة16</sup...

أصبحت إعادة تدوير المياه في المزارع والحضانات شعبية متزايدة بسبب زيادة تكاليف المياه والمخاوف البيئية وراء استخدام المياه. وقد تم تطوير العديد من طرق الري للمزارعين للحد من انتشار وانتشار الأمراض النباتية. بغض النظر عن مصدر المياه (الري أو هطول الأمطار)، يتم توليد الجريان السطحي، والعديد من مزارعي الخضروات والحضانة لديها بركة لجمع وإعادة تدوير الجريانالسطحي 1. وهذا يخلق خزانا لتراكم مسببات الأمراض المحتملة لصالح انتشار مسببات الأمراض عند استخدام المياه المعاد تدويرها لري المحاصيل2,3,4. Oomycete النباتات المسببة للأمراض تستفيد بشكل خاص من هذه الممارسة كما سوف تتراكم جراثيم حدائق الحيوان في الماء وspore تشتت الأولية هو الذاتي motile ولكن يتطلب المياه السطحية5،6،7. Phytophthora capsici هو مسببات الأمراض oomycete التي تؤثر على عدد كبير من المحاصيل سولاناسيس و cucurbit بطرق مختلفة8. في كثير من الأحيان، والأعراض هي التخميد قبالة الشتلات، الجذر وتعفن التاج. ومع ذلك، في المحاصيل مثل الخيار، الاسكواش، البطيخ، اليقطين، البطيخ والباذنجان والفلفل، قد تضيع المحاصيل بأكملها بسبب تعفن الفاكهة9. على الرغم من أن هناك طرق معروفة للكشف عن هذا النبات الممرض، ومعظم تتطلب العدوى قد وقعت بالفعل الذي تأخر جدا بالنسبة لأي فطريات وقائية أن يكون لها تأثير كبير10.
الطريقة التقليدية لاختبار مياه الري للكشف عن وتشخيص الكائنات الدقيقة المستهدفة هو نهج عتيق عندما السرعة والحساسية حاسمة للنجاح وإنتاج المحاصيل مربحة11,12. النسيج النباتي المعرض لمسببات الأمراض المستهدفة (على سبيل المثال، الباذنجان لP. capsici)تعلق على فخ المعدلة التي يتم تعليقها في بركة الري لفترة طويلة قبل إزالتها وتفتيشها للعدوى. ثم يتم وضع عينات من الأنسجة النباتية على وسائط شبه انتقائية (PARPH) ومحتضنة لنمو الثقافة ، ثم يتم تنفيذ تحديد المورفولوجية باستخدام مجهر مركب13. هناك طرق أخرى مماثلة للكشف عن مسببات الأمراض النباتية الأخرى باستخدام وسائل الإعلام انتقائية والطلاء كميات صغيرة من المياه الملوثة قبل زراعة الفرعية14،15. هذه الأساليب تتطلب في أي مكان من 2 إلى 6 أسابيع، عدة جولات من الزرع الفرعي لعزل الكائن الحي، والخبرة في تشخيص Phytophthora لتكون قادرة على التعرف على الشخصيات المورفولوجية الرئيسية لكل نوع. هذه الطرق التقليدية لا تعمل بشكل جيد للكشف عن مياه الري الملوثة بp. capsici بسبب عوامل مثل التدخل من قبل الكائنات الحية الدقيقة الأخرى الموجودة أيضا في مصادر المياه. بعض الكائنات الحية الدقيقة سريعة النمو مثل Pythium SPP. والبكتيريا التي تنقلها المياه يمكن أن تتزايد على لوحة مما يجعل P. capsici غير قابل للكشف16,17.
وكان الغرض من هذه الدراسة هو تطوير طريقة جزيئية حساسة ومحددة يمكن استخدامها في كل من البيئات الميدانية والمختبرية للكشف عن جراثيم حدائق الحيوان P. capsici في مياه الري. ويتضمن البروتوكول تطوير رواية حلقة بوساطة التضخيم متساوي الحراري (مصباح) التمهيدي مجموعة قادرة على تضخيم على وجه التحديد P. capsici, استنادا إلى 1121 قاعدة زوج (bp) جزء من P. capsici18,19. تم استخدام التمهيدي مصباح وضعت سابقا من دونغ وآخرون (2015) بالمقارنة مع الفحص الذي تم تطويره لهذه الدراسة20.
إن مقايسة المصباح هي شكل جديد نسبيًا من أشكال الكشف الجزيئي الذي ثبت أنه أكثر سرعة وحساسية وتحديداً من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR)21. وبصفة عامة، لا يمكن لم مقايسات PCR التقليدية الكشف عن أقل من 500 نسخة (1.25 pg/μL)؛ في المقابل، وقد أظهرت الدراسات السابقة أن حساسية مصباح يمكن أن يكون 10 إلى 1000 مرة أعلى من PCR التقليدية ويمكن بسهولة الكشف عن 1 fg/μL من الحمض النوويالجينومي 22،23. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء الفحص بسرعة (غالباً في 30 دقيقة) وفي الموقع (في الحقل) باستخدام كتلة التدفئة المحمولة للتضخيم وصبغة colorimetric التي تغير لون لعينة إيجابية (إزالة الحاجة إلى الكهرباء). في هذه الدراسة، قارنا حساسية المقايسات PCR و LAMP باستخدام طريقة استخراج المرشح. طريقة الكشف المقترحة تسمح للباحثين وعوامل الإرشاد للكشف بسهولة عن وجود جراثيم P. capsici من مصادر المياه المختلفة في أقل من ساعتين. وقد ثبت أن الفحص أكثر حساسية من PCR التقليدية وتم التحقق من صحتها في الموقع عن طريق الكشف عن وجود العامل الممرض في مياه الري المستخدمة من قبل المزارع. وستتيح طريقة الكشف هذه للمزارعين تقدير وجود العامل الممرض وكثافته السكانية في مختلف مصادر المياه المستخدمة في الري، مما يمنع حدوث فاشيات مدمرة وخسائر اقتصادية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

فيتفدورا capsici هو مسبب الأمراض oomycete المدمرة التي تؤثر على العديد من المحاصيل سولاناسيس و cucurbit الهامة مما تسبب خسائر اقتصادية كبيرة في إنتاج الخضروات سنويا. فيتفدورا capsici هو التربة التي تنقلها ومشكلة مستمرة في حقول الخضروات بسبب هياكلها البقاء على قيد الحياة طويلة (oospores وchlamydospores) التي تقاوم التجوية والتدهور. الطريقة الرئيسية للتشتت هي من خلال إنتاج جراثيم حدائق الحيوان ، وهي جراثيم ذات خلية واحدة ، ذات اسلافية يمكن أن تسبح من خلال أفلام رقيقة من الماء الموجود على الأسطح أو في مسام التربة المليئة بالماء ويمكن أن تتراكم في البرك والبرك. ولذلك، يمكن أن تكون أحواض الري مصدرا للأمراض والنقاط الأولية لتفشي الأمراض. الكشف عن P. capsici في مياه الري من الصعب استخدام الأساليب التقليدية القائمة على الثقافة لأن الكائنات الحية الدقيقة الأخرى الموجودة في البيئة، مثل Pythium spp.، وعادة ما تكون مفرطة P. capsici مما يجعلها غير قابلة للكشف. لتحديد وجود جراثيم P. capsici في مصادر المياه (مياه الري ، الجريان السطحي ، وما إلى ذلك) ، قمنا بتطوير ورقة تصفية يدوية تعتمد على المضخة (8-10 ميكرومتر) تلتقط جراثيم العامل الممرض (جراثيم حدائق الحيوان) وتستخدم لاحقًا لتضخيم الحمض النووي للممرض من خلال مكبرات ايزومترية (مصباح) جديدة بوساطة حلقة مصممة لتضخيم P. capsici محددة. يمكن لهذه الطريقة تضخيم وكشف الحمض النووي من تركيز منخفض يصل إلى 1.2 × 102 zoospores /mL ، وهو أكثر حساسية 40 مرة من PCR التقليدية. ولم يتم الحصول على أي تضخيم عبري عند اختبار الأنواع ذات الصلة الوثيقة. كما تم تنفيذ مصباح باستخدام صبغة المزيج الرئيسي مصباح colorimetric، وعرض النتائج التي يمكن قراءتها بالعين المجردة للكشف السريع في الموقع. ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع مسببات الأمراض الأخرى التي تقيم أو تتراكم أو تتوزع عبر شبكات الري الملوثة.

تحسين أسلوب المصباح في هذه الدراسة، اكتشفنا وجود فيتفتورا capsici في مياه الري باستخدام التضخيم الأيزوحرارية المحمولة التي تتوسطها حلقة (مصباح) المقايسة. أولاً، تم تحسين مقايسة المصباح المقترحة من خلال اختبار تركيزات مختلفة من التمهيديات للمصباح [F3، B3 (0.1-0.5 ميكرومتر لكل منهم?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

قمنا بتطوير طريقة للكشف عن Phytophthora capsici zoospores في مصادر المياه باستخدام طريقة استخراج الحمض النووي ورقة مرشح إلى جانب تضخيم متساوي الحراري حلقة بوساطة (مصباح) التي يمكن تحليلها في الميدان أو في المختبر.

الكشف عن فيتفتورا capsici في مياه الري باستخدام Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

الكشف عن Phytopathogen هو خطوة حاسمة في إدارة الأمراض النباتية. يوفر هذا البروتوكول طريقة الكشف السريع لتلوث مياه الري بسبب مسببات الأمراض الشائعة التي تنقلها مقاتلات منقولة بالماء. باستخدام هذه التقنية ، يمكن معالجة مسببات الأمراض المحددة ، مثل Phytophthora capcici ، والكشف عنها بسرعة من كمية كبيرة من مياه الري بينما تبقى في الموقع.وسوف يكون إثبات الإجراء أوين هدسون ، وهو طالب الماجستير من مختبري ، وسوفيا ولي الله ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبر Dr.Pingxi G لإنشاء مضخة وتصفية للكشف على موقع Phytophthora capcici في مياه الري. إرفاق قارورة تصفية إلى أنبوب متصل بمضخة يدوية ومجهزة قمع buchner في سدادة المطاط في فم قارورة التصفية. ثم تناسب قطعة الحجم المناسب من ورقة مرشح مع حجم الاحتفاظ 15 ميكرون في القمع.الحصول على عينات المياه جمع مياه الري من المصدر المستهدف. وقد يكون للمياه كميات صغيرة من الحطام، ولكنها لا تحتوي على رواسب أو تربة كبيرة. صب ببطء بين 50 إلى 1000 ملليلتر من الماء اختبار على ورقة مرشح داخل القمع أثناء استخدام مضخة اليد لإنشاء شفط لسحب المياه من خلال القمع.عند تصفية كل الماء، استخدم ملقط لإزالة ورق التصفية من القمع. واستخدام مقص معقمة لقطع ورقة إلى قطع صغيرة. غمر 8 إلى 12 قطعة من الورق في 400 ميكرولترتر من عازلة الاستخراج في أنبوب 1.5 ملليلتر لاحتضان خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.دوامة أو خلاف ذلك يهيج ورقة لمدة 10 ثانية مرة واحدة كل دقيقة. في نهاية الحضانة، استخدم ملقط لإزالة الورق مع أقل قدر ممكن من العازلة. وكرر الترخيص مع المجموعة التالية من قطعة ورقة مرشح.لاستخراج الحمض النووي من عينات ورقة تصفية وأضاف 20 ميكرولترات من البروتينات K و 10 ميكرولتر من 10 نانوغرام لكل ميكرولتر RNAs إلى العينة أيضا واحتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع دوامة أو تهتز كل ثلاث دقائق. في نهاية الحضانة، إضافة 500 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي في العازلة ملزمة للعينة ومزيج جيد عن طريق هز. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ضع الأنبوب ورف الفاصل المغناطيسي لمدة دقيقتين قبل إزالة المابير والتخلص منها.إزالة أنبوب من الفاصل المغناطيسي وبقوة إعادة تعليق الخرز في 500 ميكرولترات من العازلة الغسيل. بعد 30 ثانية العودة الأنبوب إلى المغناطيس وانتظر دقيقتين قبل التخلص من افرط. كرر غسل مع 500 ميكرولترات من العازلة غسل جدا و 500 ميكرولترات من 80٪ الإيثانول كما أظهرت للتو.والهواء محرك بيليه حبة المغناطيسي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة إعادة تعليق الخرز في 50 ميكرولترات من عازلة elution مع pipetting لمدة دقيقة واحدة قبل وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس لمدة دقيقتين للسماح لجمع من supernatant. بعد إعداد المزيج التمهيدي مصباح كما هو مبين في الجدول، إضافة في 2.5 microliters من مزيج التمهيدي 12.5 ميكرولترات من الحمم مصباح mastermix واحد ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج وتسعة ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة إلى أنبوب PCR واقامة واحد إيجابي والسيطرة السلبية واحدة.احتضان جميع العينات في 64 درجة مئوية الحرارة بلوق لمدة 45 دقيقة أو الجني ثلاثة أداة تضخيم في نهاية الحضانة، وحمولة من خمسة ميكرولترات من كل عينة تضخيم على هلام agarose 1٪وصورة العصابات الناتجة على آلة التصوير فوق البنفسجية. إذا تم استخدام صبغة كالوريمترية، عرض تغيير اللون لتحديد النتائج كـ موجبة أو سالبة. إذا تم استخدام أداة تضخيم محمولة، اعرض الرسم البياني للتضخيم على الشاشة لتحديد النتائج.الوقت البصري لتشغيل مقايسة المصباح في 64 درجة هو 45 دقيقة، كما لا يتم تضخيم أدنى تركيزات التي كانت إيجابية للكشف حتى 40 دقيقة، في حين يتم تضخيم تركيزات أعلى في 20 دقيقة. يمكن تأكيد التضخيم على جل agarose 1٪ المسمى مع وصمة عار من حمض النووي. كما يتضح PCR التقليدية هي 40 مرة أقل حساسية من مصباح.الكشف عن 4.8 مرات 10 إلى ثالث حدائق الحيوان في تركيزات المليلتر في أدنى. وفي هذا التحليل، تم جمع عينات من المياه من سبع أحواض تستخدم لإنتاج الخضروات التجارية في مقاطعة تيفت، جورجيا. ثلاثة منها أظهرت نتائج إيجابية مصباح.عندما تم اختبار العينات بواسطة PCR التقليدية ومع ذلك، تم الكشف عن حدائق الحيوان في واحدة فقط من العينات الثلاث الإيجابية. في هذا الجدول، يتم تلخيص الاختلافات بين طرق الكشف باستخدام متغيرات مثل الحساسية والوقت والإعداد المطلوب والمواد والتكلفة. مصباح هو الأسلوب الأقل تكلفة بين الأساليب التي تم اختبارها، وأيضا هو الأسرع، والتي تتطلب فقط 30 إلى 60 دقيقة للتضخيم مقارنة مع التضخيم PCR التقليدية.باستخدام هذا البروتوكول الحمض النووي المستخرجة من مسببات الأمراض البذور UMI وثيقة الصلة النتائج في أي كشف لأي من العينات، مما يؤكد خصوصية التمهيديات. تأكد من عدم صب الماء العينة بسرعة كبيرة، وتوخي الحذر عند إضافة الحمض النووي المستخرج إلى أنابيب المصباح للحد من التلوث. وبمجرد أن تكون مسببات الأمراض الأخرى المنقولة بالمياه قد تم تطوير مجموعاتها التمهيدية المحددة ، يمكن تكييف أساليب الترشيح وحمض المصباح لمسببات الأمراض الأخرى.

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

على الورق اللونية الكشف عن<em&gt; كولاي</em&gt;،<em&gt; السالمونيلا</em&gt; النيابة، و<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; من كميات كبيرة من المياه الزراعية

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

التي تحددها المختبر الفوسفور الجريان من بحيرة الرواسب كمقياس للتحميل الفوسفور الداخلية

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية ونوروفيروس حدوثها في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. I. جمع عينات الفيروسات

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

وحجم صغير الأحيائي لتقييم البكتيرية / العوالق النباتية المشارك الثقافة عن طريق WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) التألق

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية ونوروفيروس التواجد في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. الجزء الثالث. كشف الفيروس عن طريق RT-QPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

وPCR الفحص دوبلكس الرقمي للوقت واحد الكمي ل<em&gt; المعوية النيابة.</em&gt; وما يرتبط بها من البراز-الإنسان HF183 علامة في المياه

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

الكشف عن آخر الغدد الصماء في المياه عن طريق المتاحة تجاريا<em&gt; في المختبر</em&gt; Transactivation اختبارات بيولوجية

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

بسيطة زراعة تقنية لإعادة إنشاء الأشجار التي يحدث فيها غمر متكررة

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

بيوينديكيشن اختبار لمدى ملاءمة البيئة تيار للشباب المياه العذبة بيرل بلح البحر باستخدام طرق التعرض في الموقع

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

الإجراء الأمثل لتحديد "الامتزاز فوسفوناتيس" على "هيدروكسيد الحديديك الحبيبية" باستخدام "أسلوب تحديد الفوسفور المنمنمة"

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...