Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Dit werk kreeg de financiële steun van Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID# FP00016659. De auteurs danken Dr Pingsheng Ji, Universiteit van Georgië en Dr Anne Dorrance, Ohio State University voor het verstrekken van pure culturen van Phytophthora spp. We danken ook Li Wang en Deloris Veney voor hun technische bijstand tijdens het onderzoek.

1. On-site detectie van Phytophthora capsici uit irrigatiewater met behulp van draagbare lus-gemedieerde isothermale versterking
<ol><li>Het instellen van de pomp en het filter<ol>
<li>Bevestig een filterfles aan een buis die is aangesloten op een handpomp, zodat wanneer de pomp wordt geactiveerd, de lucht via de mond van de filterfles naar binnen wordt getrokken.</li>
		<li>Plaats de Buchner trechter in de rubberen stop in de mond van de filterfles en plaats het juiste formaat stuk filterpapier in de Buchner ...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops:+research+progress+and+management+challenges.">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li><li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water.">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li><li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water.">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li><li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov.">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li><li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens.">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici.">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici.">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li><li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani.">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).</li><li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

Het testen van irrigatiewater voor fytopathogenen is een cruciale stap voor telers die irrigatievijvers en gerecycled watergebruiken 27. Irrigatievijvers bieden een reservoir en broedplaats voor een aantal fytopathogenen als overtollig irrigatiewater wordt gericht van het veld naar de vijver die met zich mee alle ziekteverwekkers die aanwezig kunnen zijn geweest16,27. De traditionele methode voor de detectie van een plant pathogenen in een...

Het recyclen van water in boerderijen en kwekerijen wordt steeds populairder door de stijging van de waterkosten en de milieuproblemen achter het watergebruik. Er zijn veel irrigatiemethoden ontwikkeld voor telers om de verspreiding en het optreden van plantenziekten te verminderen. Ongeacht de bron van het water (irrigatie of neerslag), afvloeiing wordt gegenereerd, en veel groente-en kwekers hebben een vijver te verzamelen en te recyclen runoff1. Hierdoor ontstaat een reservoir voor mogelijke pathogene accumulatie ten gunste van de verspreiding van ziekteverwekkers wanneer het gerecycleerde water wordt gebruikt om gewassen te irrigeren2,3,4. Oomycete plant pathogenen in het bijzonder profiteren van deze praktijk als zoösporen zal zich ophopen in water en de primaire dispersieve spore is zelf-motile, maar vereist oppervlaktewater5,6,7. Phytophthora capsici is een oomycete pathogene die een aanzienlijk aantal solanaceous en cucurbit gewassen op verschillende manieren beïnvloedt8. Vaak zijn de symptomen demping-off van zaailingen, wortel en kroonrot; echter, in gewassen zoals komkommer, pompoen, meloen, pompoen, watermeloen, aubergine en peper, hele oogsten kunnen verloren gaan als gevolg van fruitrot9. Hoewel er bekende methoden zijn om deze plantenpathogen te detecteren, vereisen de meeste een infectie die al heeft plaatsgevonden, wat te laat is om preventieve fungiciden een significant effect te hebben10.
De traditionele methode om irrigatiewater te testen op de detectie en diagnose van gerichte micro-organismen is een verouderde aanpak wanneer snelheid en gevoeligheid cruciaal zijn voor succes en winstgevende gewasproductie11,12. Plantweefsel dat gevoelig is voor de beoogde ziekteverwekker (bijvoorbeeld aubergine voor P. capsici)is bevestigd aan een gemodificeerde val die gedurende langere tijd in een irrigatievijver wordt opgehangen voordat het wordt verwijderd en gecontroleerd op infectie. Monsters van het plantenweefsel worden vervolgens verguld op semi-selectieve media (PARPH) en geïncubeerd voor groei van de cultuur, dan morfologische identificatie wordt uitgevoerd met behulp van een samengestelde microscoop13. Er zijn andere soortgelijke detectiemethoden voor andere plantpathogenen met behulp van selectieve media en plating kleine hoeveelheden verontreinigd water voor sub-culturing14,15. Deze methoden vereisen overal van 2 tot 6 weken, verschillende rondes van sub-culturing om het organisme te isoleren, en ervaring op Phytophthora diagnostiek te kunnen de belangrijkste morfologische kenmerken van elke soort te herkennen. Deze traditionele methoden werken niet goed voor de detectie van irrigatiewater besmet door P. capsici als gevolg van factoren zoals interferentie door andere micro-organismen die ook aanwezig zijn in de waterbronnen. Sommige snelgroeiende micro-organismen zoals Pythium spp. en door water overgedragen bacteriën kunnen overwoekeren op de plaat waardoor P. capsici niet op te sporen16,17.
Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een gevoelige en specifieke moleculaire methode die kan worden gebruikt in zowel veld- als laboratoriumomgevingen om P. capsici zoosporen in irrigatiewater te detecteren. Het protocol omvat de ontwikkeling van een nieuwe lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) primer set in staat om specifiek versterken P. capsici, gebaseerd op een 1121-base paar (bp) fragment van P. capsici18,19. Een eerder ontwikkelde LAMP primer van Dong et al. (2015) werd gebruikt in vergelijking met de test die werd ontwikkeld voor deze studie20.
De LAMP-test is een relatief nieuwe vorm van moleculaire detectie waarvan is aangetoond dat deze sneller, gevoeliger en specifieker is dan conventionele polymerasekettingreactie (PCR)21. In het algemeen kunnen conventionele PCR-tests niet onder 500 kopieën (1,25 pg/μL) worden gedetecteerd; in tegenstelling, eerdere studies hebben aangetoond dat de gevoeligheid van LAMP kan 10 tot 1.000 keer hoger zijn dan conventionele PCR en kan gemakkelijk detecteren zelfs 1 fg/μL van genomische DNA22,23. Bovendien kan de test snel worden uitgevoerd (vaak in 30 minuten) en on-site (in het veld) met behulp van een draagbaar verwarmingsblok voor versterking en een colorimetrische kleurstof die van kleur verandert voor een positief monster (waardoor de noodzaak van elektroforese wordt verwijderd). In deze studie hebben we de gevoeligheid van PCR- en LAMP-tests vergeleken met behulp van een filterextractiemethode. De voorgestelde detectiemethode stelt onderzoekers en extensiemiddelen in staat om de aanwezigheid van P. capsici sporen uit verschillende waterbronnen in minder dan twee uur gemakkelijk te detecteren. De test is bewezen gevoeliger te zijn dan conventionele PCR en werd ter plaatse gevalideerd door de aanwezigheid van de ziekteverwekker in het irrigatiewater te detecteren dat door een teler wordt gebruikt. Deze detectiemethode zal telers in staat stellen om de aanwezigheid en bevolkingsdichtheid van de ziekteverwekker in verschillende waterbronnen te schatten die worden gebruikt voor irrigatie, waardoor verwoestende uitbraken en economische verliezen worden voorkomen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

Phytophthora capsici is een verwoestende oomycete ziekteverwekker die veel belangrijke solanaceous en cucurbit gewassen veroorzaakt aanzienlijke economische verliezen in de plantaardige productie jaarlijks beïnvloedt. Phytophthora capsici is bodemgedragen en een hardnekkig probleem in groentevelden als gevolg van de langlevende overlevingsstructuren (oospores en chlamydosporen) die verwering en afbraak weerstaan. De belangrijkste methode van verspreiding is door de productie van zoösporen, die eencellige, gevlagde sporen die kunnen zwemmen door dunne films van water aanwezig op oppervlakken of in met water gevulde bodem poriën en kan zich ophopen in plassen en vijvers. Daarom kunnen irrigatievijvers een bron zijn van de ziekteverwekker en de eerste punten van ziekte-uitbraken. Detectie van P. capsici in irrigatiewater is moeilijk met behulp van traditionele cultuur gebaseerde methoden, omdat andere micro-organismen aanwezig in het milieu, zoals Pythium spp., meestal overwoekeren P. capsici waardoor het niet op te sporen. Om de aanwezigheid van P. capsici sporen in waterbronnen (irrigatiewater, afvloeiing, enz.) te bepalen, ontwikkelden we een handpompgebaseerde filterpapier (8-10 μm) methode die de sporen van de ziekteverwekker (zoösporen) vangt en later wordt gebruikt om het DNA van de ziekteverwekker te versterken door middel van een nieuwe lusgemedieerde isothermale versterking (LAMP) assay ontworpen voor de specifieke versterking van P capsici. Deze methode kan versterken en detecteren DNA uit een concentratie zo laag als 1,2 x 102 zoösporen / mL, dat is 40 keer gevoeliger dan conventionele PCR. Er werd geen kruisversterking verkregen bij het testen van nauw verwante soorten. LAMP werd ook uitgevoerd met behulp van een colorimetrische LAMP master mix kleurstof, het weergeven van resultaten die kunnen worden gelezen met het blote oog voor on-site snelle detectie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere ziekteverwekkers die zich bevinden, accumuleren of verspreid zijn via verontreinigde irrigatiesystemen.

Optimalisatie van de LAMP-methode In deze studie ontdekten we de aanwezigheid van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van een draagbare lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test. Ten eerste werd de voorgestelde LAMP-test geoptimaliseerd door verschillende LAMP primerconcentraties te testen [F3, B3 (0,1–0,5 μM per stuk); LF, LB (0,5–1,0 μM per stuk) en FIP, BIP (0,8–2,4 μM per stuk)], duur (30-70 min) en temperaturen (55-70 °C). De uiteindelijke LAMP primer mi...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We ontwikkelden een methode om Phytophthora capsici zoospores in waterbronnen te detecteren met behulp van een filter papier DNA-extractie methode in combinatie met een lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test die kan worden geanalyseerd in het veld of in het lab.

Detectie van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van loop-gemedieerde isothermale versterking

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Fytopathogen detectie is een cruciale stap in het beheer van plantenziekten. Dit protocol biedt een snelle detectiemethode voor irrigatiewaterverontreiniging als gevolg van een veel voorkomende ziekteverwekker in water. Met behulp van deze techniek kan specifieke ziekteverwekker, zoals Phytophthora capcici, worden verwerkt en snel worden gedetecteerd uit ons grote volume irrigatiewater terwijl ze ter plaatse blijven.Het aantonen van de procedure zal Owen Hudson, een Masters student uit mijn laboratorium, en Sumyya Waliullah, een postdoctoraal onderzoeker van dr. Pingxi G's laboratorium op te zetten het opzetten van een pomp en filter voor op het terrein Phytophthora capcici detectie in irrigatiewater. Bevestig een filterfles aan een buis die is aangesloten op een handpomp en plaats buchnertrechter in de rubberen stop in de mond van de filterfles. Dan past een geschikt formaat stuk filterpapier met een retentiegrootte van 15 micron in de trechter.Om watermonsters te verkrijgen, verzamelt u irrigatiewater van de beoogde bron. Het water kan kleine hoeveelheden puin hebben, maar geen significant sediment of bodem. Giet langzaam tussen de 50 tot 1000 milliliter testwater over het filterpapier in de trechter terwijl u de handpomp gebruikt om een zuigkracht te creëren om het water door de trechter te trekken.Wanneer al het water is gefilterd, gebruikt u tangen om het filterpapier uit de trechter te verwijderen. En gebruik steriele schaar om het papier in kleine stukjes te snijden. Dompel acht tot twaalf stukken papier onder in 400 microliter extractiebuffer in een buis van 1,5 milliliter voor een vijf minuten durende incubatie bij kamertemperatuur.Vortex of anderszins roeren het papier voor 10 seconden per minuut. Gebruik aan het einde van de incubatiekracht tangen om het papier met zo min mogelijk buffer te verwijderen. En herhaal de licentie met de volgende set van filter papier stukken.Voor DNA-extractie van de filter papier monsters toegevoegd 20 microliter van proteinase K en 10 microliter van 10 nanogram per microliter RNAs aan het monster ook en de oplossing incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met vortexing of schudden om de drie minuten. Voeg aan het einde van de incubatie 500 microliter magnetische kralen in bindende buffer toe aan het monster en meng goed door te schudden. Na vijf minuten op kamertemperatuur, plaats de buis en de magnetische scheidingsteken rack gedurende twee minuten voor het verwijderen en weggooien van de supernatant.Verwijder de buis van de magnetische afscheider en zet de kralen krachtig opnieuw op in 500 microliter wasbuffers. Na 30 seconden terug de buis naar de magneet en wacht twee minuten voordat het verwijderen van de supernatant. Herhaal de was met 500 microliters van wasbuffer ook en 500 microliters van 80% ethanol zoals net aangetoond.En lucht drijft de magnetische kraalpellet gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie opnieuw opschorten de kralen in 50 microliter van elution buffer met pipetten gedurende een minuut voor het plaatsen van de buis terug op de magneet gedurende twee minuten om het verzamelen van de supernatant mogelijk te maken. Na de voorbereiding van de LAMP primer mix zoals aangegeven in de tabel, voeg op 2,5 microliter van primer mix 12,5 microliter van een lava LAMP mastermix een microliter van geëxtraheerd DNA en negen microliter van dubbel gedestilleerd water aan een PCR buis en het opzetten van een positieve en een negatieve controle.incubeer alle monsters in een 64 graden Celsius warmte blog gedurende 45 minuten of de geest drie versterking instrument aan het einde van de incubatie, een belasting van vijf microliters van elk versterkt monster op een 1%agarose gel en beeld de resulterende banden op een ultraviolet beeldvorming machine. Als een calorimetrische kleurstof is gebruikt, bekijkt u de kleurverandering om de resultaten als positief of negatief te bepalen. Als een draagbaar versterkingsinstrument is gebruikt, bekijkt u de versterkingsgrafiek op het scherm om de resultaten te bepalen.De optische tijd voor het uitvoeren van de LAMP-test bij 64 graden is 45 minuten, omdat de laagste concentraties die positief waren voor detectie pas na 40 minuten worden versterkt, terwijl hogere concentraties na 20 minuten worden versterkt. Versterking kan worden bevestigd op een 1%agarose gel gelabeld met een Nucleïnezuur vlek. Zoals geïllustreerd conventionele PCR is 40 keer minder gevoelig dan LAMP.Detecteren 4,8 keer 10 tot de derde zoösporen per milliliter concentraties op de laagste. In deze analyse werden watermonsters verzameld uit zeven vijvers die werden gebruikt voor commerciële groenteproductie in Tift County, Georgia. Drie daarvan toonden positieve LAMP-resultaten aan.Toen de monsters echter door conventionele PCR werden getest, werden in slechts één van de drie positieve monsters zoösporen aangetroffen. In deze tabel worden de verschillen tussen detectiemethoden met behulp van variabelen als gevoeligheid, tijd, vereiste voorbereiding, materialen en kosten samengevat. LAMP is de minst dure methode onder de geteste methoden, en is ook de snelste, die slechts 30 tot 60 minuten voor versterking in vergelijking met conventionele PCR versterking.Met behulp van dit protocol DNA gewonnen uit nauw verwante UMI zaad pathogenen resulteert in geen detectie voor een van de monsters, bevestiging van de specificiteit van de primers. Zorg ervoor dat u het monsterwater niet te snel giet en wees voorzichtig bij het toevoegen van geëxtraheerd DNA aan de LAMP-buizen om verontreiniging te beperken. Zodra andere watergedragen ziekteverwekkers hun specifieke primersets hebben laten ontwikkelen, kunnen de filtratie- en lampzuurmethoden worden aangepast voor andere ziekteverwekkers.

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

-Laboratorium bepaald Fosfor Flux van het meer van sedimenten als een interne maatregel Fosfor Laden

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

Een klein volume Bioassay om Bacteriële / Fytoplankton Co-cultuur Beoordeel met behulp van water-Pulse-amplitudegemoduleerde (WATER-PAM) fluorometrie

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening op hormonale activiteit in water met behulp van de handel verkrijgbare<em&gt; In Vitro</em&gt; Transactivering Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

Een eenvoudige aanplant techniek voor het opnieuw vaststellen van bomen waar frequente inundatie treedt op

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication testen van Stream milieu geschiktheid voor jonge zoetwater parel van mosselen met behulp van In Situ blootstelling methoden

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

Geoptimaliseerde Procedure voor de bepaling van de adsorptie van fosfonaten op granulaire Ferric Hydroxide met behulp van een methode fosfor sleutelbepaling verkleind

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...