Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
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Ces travaux ont reçu le soutien financier du projet ID# FP00016659 de la Georgia Commodity Commission for Vegetables. Les auteurs remercient le Dr Pingsheng Ji, Université de Géorgie et le Dr Anne Dorrance, Ohio State University pour fournir des cultures pures de Phytophthora spp. Nous remercions également Li Wang et Deloris Veney pour leur assistance technique tout au long de l’étude.

1. Détection sur place de Phytophthora capsici à partir de l’eau d’irrigation à l’aide d’une amplification isothermique à médiation en boucle
<ol><li>Configuration de la pompe et du filtre<ol>
<li>Attachez une fiole filtrante à un tube qui est relié à une pompe à main de sorte que lorsque la pompe est activée, l’air sera tiré par la bouche de la fiole filtrante.</li>
		<li>Placez l’entonnoir Buchner dans le bouchon en caoutchouc à la bouche de la fiole filtrante et placez le morceau de ...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops:+research+progress+and+management+challenges.">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li><li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water.">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li><li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water.">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li><li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov.">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li><li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens.">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici.">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici.">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li><li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani.">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).</li><li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

L’essai de l’eau d’irrigation pour les phytopathogènes est une étape cruciale pour les producteurs utilisant des étangs d’irrigation et de l’eau recyclée27. Les étangs d’irrigation fournissent un réservoir et un terrain de reproduction pour un certain nombre de phytopathogènes car l’excès d’eau d’irrigation est dirigé du champ à l’étang transportant avec lui tous les agents pathogènes qui peuvent avoir été présents16,<sup class=...

Le recyclage de l’eau dans les fermes et les pépinières est de plus en plus populaire en raison de l’augmentation des coûts de l’eau et des préoccupations environnementales liées à l’utilisation de l’eau. De nombreuses méthodes d’irrigation ont été mises au point pour permettre aux producteurs de réduire la propagation et l’apparition des maladies végétales. Indépendamment de la source de l’eau (irrigation ou précipitations), le ruissellement est généré, et de nombreux producteurs de légumes et de pépinières ont un étang pour recueillir et recycler le ruissellement1. Cela crée un réservoir pour l’accumulation possible de pathogènes favorisant la propagation des agents pathogènes lorsque l’eau recyclée est utilisée pour irriguer les cultures2,3,4. Les agents pathogènes des plantes d’Oomycète bénéficient particulièrement de cette pratique car les zoospores s’accumuleront dans l’eau et la spore dispersive primaire est auto-motile mais nécessite l’eau de surface5,6,7. Phytophthora capsici est un pathogène oomycéte qui affecte un nombre important de cultures solanacées et cucurbitées de différentes façons8. Souvent, les symptômes sont l’amortissement des semis, de la racine et de la pourriture de la couronne; toutefois, dans les cultures telles que le concombre, la courge, le melon, la citrouille, la pastèque, l’aubergine et le poivre, des récoltes entières peuvent être perdues en raison de la pourriture des fruits9. Bien qu’il existe des méthodes connues de détection de ce pathogène végétal, la plupart exigent qu’une infection ait déjà eu lieu, ce qui est trop tard pour que les fongicides préventifs aient un effet significatif10.
La méthode traditionnelle pour tester l’eau d’irrigation pour la détection et le diagnostic de micro-organismes ciblés est une approche désuète lorsque la vitesse et la sensibilité sont cruciales pour le succès et la production agricole rentable11,12. Les tissus végétaux sensibles à l’agent pathogène ciblé (p. ex., l’aubergine pour P. capsici)sont attachés à un piège modifié qui est suspendu dans un étang d’irrigation pendant une période prolongée avant d’être enlevé et inspecté pour détecter l’infection. Les échantillons prélevés sur le tissu végétal sont ensuite plaqués sur des milieux semi-sélectifs (PARPH) et incubés pour la croissance de la culture, puis l’identification morphologique est effectuée à l’aide d’un microscope composé13. Il existe d’autres méthodes de détection similaires pour d’autres agents pathogènes végétaux utilisant des milieux sélectifs et en plaisantant de petites quantités d’eau contaminée avant de sous-cultiver14,15. Ces méthodes nécessitent entre 2 et 6 semaines, plusieurs cycles de sous-culture pour isoler l’organisme, et l’expérience sur les diagnostics phytophthora pour être en mesure de reconnaître les caractères morphologiques clés de chaque espèce. Ces méthodes traditionnelles ne fonctionnent pas bien pour la détection de l’eau d’irrigation contaminée par P. capsici en raison de facteurs tels que l’interférence par d’autres micro-organismes qui sont également présents dans les sources d’eau. Certains micro-organismes à croissance rapide comme Pythium spp. et les bactéries d’origine hydrique peuvent surgrow sur la plaque rendant P. capsici indétectable16,17.
Le but de cette étude était de développer une méthode moléculaire sensible et spécifique qui peut être utilisée à la fois dans les milieux de terrain et de laboratoire pour détecter les zoospores P. capsici dans l’eau d’irrigation. Le protocole comprend le développement d’un nouvel ensemble d’amorces isothermiques médiés en boucle (LAMP) capable d’amplifier spécifiquement P. capsici, basé sur un fragment de 1121 paires de base (pb) de P. capsici18,19. Une amorce LAMP précédemment développée de Dong et coll. (2015) a été utilisée par rapport à l’essai qui a été développé pour cette étude20.
L’essai LAMP est une forme relativement nouvelle de détection moléculaire qui s’est avérée plus rapide, plus sensible et plus spécifique que la réaction en chaîne conventionnelle de polymérase (PCR)21. En général, les tests PCR conventionnels ne peuvent pas détecter à moins de 500 copies (1,25 pg/μL); en revanche, des études antérieures ont montré que la sensibilité de LAMP peut être 10 à 1000 fois plus élevée que le PCR conventionnel et peut facilement détecter même 1 fg/μL d’ADN génomique22,23. En outre, l’essai peut être effectué rapidement (souvent en 30 min) et sur place (sur le terrain) en utilisant un bloc de chauffage portable pour l’amplification et un colorant colorimétrique qui change de couleur pour un échantillon positif (en supprimant le besoin d’électrophorèse). Dans cette étude, nous avons comparé la sensibilité des tests PCR et LAMP à l’aide d’une méthode d’extraction de filtre. La méthode de détection proposée permet aux chercheurs et aux agents d’extension de détecter facilement la présence de spores de P. capsici provenant de différentes sources d’eau en moins de deux heures. L’essai s’est avéré plus sensible que le PCR conventionnel et a été validé in situ en détectant la présence de l’agent pathogène dans l’eau d’irrigation utilisée par un producteur. Cette méthode de détection permettra aux producteurs d’estimer la présence et la densité de population de l’agent pathogène dans diverses sources d’eau qui sont utilisées pour l’irrigation, prévenir les flambées dévastatrices et les pertes économiques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

Phytophthora capsici est un pathogène dévastateur de l’oomycéte qui affecte de nombreuses importantes cultures de solanacée et de cucurbitacées causant des pertes économiques importantes dans la production végétale chaque année. Phytophthora capsici est transmis par le sol et un problème persistant dans les champs de légumes en raison de ses structures de survie à longue durée de vie (oospores et chlamydospores) qui résistent aux intempéries et à la dégradation. La principale méthode de dispersion consiste à produire des zoospores, qui sont des spores à unicellulaire et flagellées qui peuvent nager à travers de minces couches d’eau présentes sur les surfaces ou dans des pores de sol remplis d’eau et qui peuvent s’accumuler dans des flaques d’eau et des étangs. Par conséquent, les étangs d’irrigation peuvent être une source de l’agent pathogène et les premiers points d’éclosion de la maladie. La détection de P. capsici dans l’eau d’irrigation est difficile en utilisant des méthodes traditionnelles basées sur la culture parce que d’autres micro-organismes présents dans l’environnement, tels que Pythium spp., généralement surgrow P. capsici le rendant indétectable. Pour déterminer la présence de spores de P. capsici dans les sources d’eau (eau d’irrigation, ruissellement, etc.), nous avons mis au point une méthode de papier filtre à pompe manuelle (8-10 μm) qui capture les spores de P. capsici. l’agent pathogène (zoospores) et est plus tard utilisée pour amplifier l’ADN de l’agent pathogène par le biais d’une nouvelle amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle. Cette méthode peut amplifier et détecter l’ADN d’une concentration aussi faible que 1,2 x 102 zoospores/mL, qui est 40 fois plus sensible que le PCR conventionnel. Aucune amplification croisée n’a été obtenue lors de l’essai d’espèces étroitement apparentées. LAMP a également été réalisé à l’aide d’un colorant de mélange de maître de lampe colorimétrique, affichant des résultats qui pourraient être lus à l’œil nu pour la détection rapide sur place. Ce protocole pourrait être adapté à d’autres agents pathogènes qui résident, s’accumulent ou sont dispersés par des systèmes d’irrigation contaminés.

Optimisation de la méthode LAMP Dans cette étude, nous avons détecté la présence de Phytophthora capsici dans l’eau d’irrigation à l’aide d’un test d’amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle portable. Tout d’abord, l’essai lamp proposé a été optimisé en testant différentes concentrations d’amorces de LAMP [F3, B3 (0,1–0,5 μM chacune); LF, LB (0,5–1,0 μM chacun) et FIP, BIP (0,8–2,4 μM chacun)], durées (30–70 min) et températures (55–7...

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Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Nous avons développé une méthode pour détecter phytophthora capsici zoospores dans les sources d’eau à l’aide d’une méthode d’extraction d’ADN de papier filtre couplée à un test d’amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle qui peut être analysé sur le terrain ou en laboratoire.

Détection de Phytophthora capsici dans l’eau d’irrigation à l’aide de l’amplification isothermique en loop-Mediated

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

La détection du phytopathogène est une étape cruciale dans la gestion des maladies végétales. Ce protocole fournit une méthode de détection rapide pour la contamination de l’eau d’irrigation due à un agent pathogène commun des chasseurs d’origine hydrique. En utilisant cette technique, des agents pathogènes spécifiques, tels que Phytophthora capcici, peuvent être traités et rapidement détectés à partir de notre grand volume d’eau d’irrigation tout en restant sur place.Owen Hudson, étudiant à la maîtrise de mon laboratoire, et Sumyya Waliullah, chercheur postdoctoral au laboratoire du Dr Pingxi G, feront la démonstration de la procédure afin de mettre en place une pompe et un filtre pour la détection phytophthora capcici sur place dans l’eau d’irrigation. Fixez un flacon filtrant à un tube relié à une pompe à main et un entonnoir buchner monté dans le bouchon en caoutchouc dans la bouche du flacon filtrant. Ensuite, placez un morceau de papier filtre de taille appropriée avec une taille de rétention de 15 microns dans l’entonnoir.Pour obtenir des échantillons d’eau recueillir l’eau d’irrigation de la source ciblée. L’eau peut avoir de petites quantités de débris, mais pas de sédiments ou de sol importants. Versez lentement entre 50 et 1000 millilitres d’eau d’essai sur le papier filtre à l’intérieur de l’entonnoir tout en utilisant la pompe à main pour créer une aspiration pour tirer l’eau à travers l’entonnoir.Lorsque toute l’eau a été filtrée, utilisez des forceps pour enlever le papier filtre de l’entonnoir. Et utilisez des ciseaux stériles pour couper le papier en petits morceaux. Submergez de huit à 12 morceaux de papier dans 400 microlitres de tampon d’extraction dans un tube de 1,5 millilitre pendant une incubation de cinq minutes à température ambiante.Vortex ou agiter le papier pendant 10 secondes une fois par minute. À la fin de l’incubation, utiliser des forceps pour enlever le papier avec le moins de tampon possible. Et répétez la licence avec la prochaine série de morceaux de papier filtre.Pour l’extraction de l’ADN à partir des échantillons de papier filtre ajouté 20 microlitres de proteinase K et 10 microlitres de 10 nanogrammes par microlitre ARN à l’échantillon aussi et incuber la solution à température ambiante pendant 15 minutes avec vortex ou secouant toutes les trois minutes. À la fin de l’incubation, ajouter 500 microlitres de perles magnétiques dans un tampon liant à l’échantillon et bien mélanger en secouant. Après cinq minutes à température ambiante, placer le tube et la grille du séparateur magnétique pendant deux minutes avant d’enlever et de jeter le supernatant.Retirez le tube du séparateur magnétique et suspendez vigoureusement les perles dans 500 microlitres de tampon de lavage. Après 30 secondes, remettre le tube à l’aimant et attendre deux minutes avant de jeter le surnatant. Répétez le lavage avec 500 microlitres de tampon de lavage aussi et 500 microlitres de 80% d’éthanol comme nous venons de le démontrer.Et l’air conduire la pastille de perles magnétiques pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, suspendre à nouveau les perles dans 50 microlitres de tampon d’élitution avec pipetting pendant une minute avant de remettre le tube sur l’aimant pendant deux minutes pour permettre la collecte du supernatant. Après avoir préparé le mélange d’amorce LAMP tel qu’indiqué dans le tableau, ajouter à 2,5 microlitres d’apprêt mélanger 12,5 microlitres d’un mastermix lamp lave un microlitre d’ADN extrait et neuf microlitres d’eau distillée double à un tube PCR et mettre en place un contrôle positif et un contrôle négatif.incuber tous les échantillons dans un blog de chaleur de 64 degrés Celsius pendant 45 minutes ou le génie trois instrument d’amplification à la fin de l’incubation, une charge de cinq microlitres de chaque échantillon amplifié sur un gel agarose de 1% et l’image des bandes résultantes sur une machine d’imagerie ultraviolette. Si un colorant calorimétrique a été utilisé, visualisez le changement de couleur pour déterminer les résultats comme positifs ou négatifs. Si un instrument portatif d’amplification a été utilisé, consultez le graphique d’amplification à l’écran pour déterminer les résultats.Le temps optique pour faire fonctionner l’essai LAMP à 64 degrés est de 45 minutes, car les concentrations les plus faibles qui étaient positives pour la détection ne sont pas amplifiées avant 40 minutes, tandis que les concentrations plus élevées sont amplifiées à 20 minutes. L’amplification peut être confirmée sur un gel d’agarose de 1% étiqueté avec une tache d’acide nucléique. Comme illustré PCR conventionnel est 40 fois moins sensible que LAMP.Détection 4,8 fois 10 à la troisième zoospores par millilitre concentrations au plus bas. Dans cette analyse, des échantillons d’eau ont été prélevés dans sept étangs utilisés pour la production commerciale de légumes dans le comté de Tift, en Géorgie. Trois d’entre nous ont démontré des résultats positifs pour lampadaire.Cependant, lorsque les échantillons ont été testés par pcr conventionnel, des zoospores ont été détectés dans un seul des trois échantillons positifs. Dans ce tableau, les différences entre les méthodes de détection utilisant des variables telles que la sensibilité, le temps, la préparation requise, les matériaux et le coût sont résumées. LAMP est la méthode la moins chère parmi les méthodes testées, et est également la plus rapide, ne nécessitant que 30 à 60 minutes pour l’amplification par rapport à l’amplification PCR classique.L’utilisation de cet ADN de protocole extrait des agents pathogènes étroitement liés de graine d’UMI n’a comme résultat aucune détection pour aucun des échantillons, confirmant la spécificité des amorces. Assurez-vous de ne pas verser l’eau de l’échantillon trop rapidement et soyez prudent lorsque vous ajoutez de l’ADN extrait aux tubes LAMP pour limiter la contamination. Une fois que d’autres agents pathogènes d’origine hydrique ont vu leurs ensembles d’amorce spécifiques mis au point, les méthodes de filtration et d’acide de lampe peuvent être adaptées à d’autres agents pathogènes.

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