Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

עבודה זו זכתה לתמיכה כספית של הנציבות לסחורות של גאורגיה עבור מזהה פרויקט ירקות# FP00016659. המחברים מודים ד"ר Pingsheng ג'י, אוניברסיטת ג'ורג'יה וד"ר אן דורנס, אוהיו סטייט למתן תרבויות טהורות של Phytophthora spp. אנו מודים גם לי וואנג וDeloris Veney על הסיוע הטכני שלהם לאורך כל המחקר.

1. זיהוי באתר של Phytophthora capsici ממים השקיה באמצעות לולאה ניידת מתווכת
<ol><li>הגדרת המשאבה והמסנן<ol>
<li>חבר בקבוקון סינון לצינור המחובר למשאבת יד כך שכאשר המשאבה תופעל, האוויר יימשך דרך הפה של בקבוקון הסינון.</li>
		<li>התאם את משפך בוכנר לתוך מעצור הגומי לפה בקבוקון הסינון והכנס את פיסת נייר הסינ...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops:+research+progress+and+management+challenges.">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li><li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water.">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li><li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water.">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li><li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov.">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li><li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens.">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici.">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici.">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li><li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani.">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).</li><li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

הבדיקה של מי השקיה עבור phytopathogens הוא צעד מכריע עבור מגדלים באמצעות בריכות השקיה ומים ממוחזרים27. בריכות השקיה מספקות מאגר וקרקע פורייה עבור מספר פיטופטוגנים כמו מי השקיה עודפים מופנה מהשדה אל הבריכה נושאת איתו כל פתוגנים שאולי היהנוכח 16,27. השיטה...

מיחזור מים בחוות ובפעוטונים הופך פופולרי יותר ויותר בשל העלייה בעלויות המים וחששות סביבתיים מאחורי השימוש במים. שיטות השקיה רבות פותחו עבור מגדלים כדי להפחית את ההתפשטות וההתרחשות של מחלת הצמח. ללא קשר למקור המים (השקיה או משקעים), ההתנקזות נוצרת, ומגדלי ירקות ופעוטונים רבים יש בריכה לאסוף ולמחזר runoff1. זה יוצר מאגר להצטברות פתוגן אפשרית לטובת התפשטות פתוגנים כאשר המים הממוחזרים משמשים להשקיהיבולים 2,,3,,4. פתוגנים צמחיים Oomycete במיוחד ליהנות מנהג זה כמו zoospores יצטברו במים נבגים פיזור העיקרי הוא מוטיב עצמי, אבל דורש מים פניהשטח 5,6,7. Phytophthora capsici הוא פתוגן oomycete המשפיע על מספר משמעותי של גידולי solanaceous ו cucurbit בדרכים שונות8. לעתים קרובות, הסימפטומים הם שיכוך-off של שתילים, שורש וכתר ריקבון; עם זאת, בגידולים כגון מלפפון, סקווש, מלון, דלעת, אבטיח, חצילים ופלפל, יבולים שלמים עלולים ללכת לאיבוד עקב ריקבון פירות9. למרות שיש שיטות ידועות של זיהוי פתוגן צמח זה, רוב דורשים זיהום כבר התרחש וזה מאוחר מדי עבור כל פטריות מונעות יש השפעה משמעותית10.
השיטה המסורתית כדי לבדוק מי השקיה לזיהוי ואבחן של מיקרואורגניזמים ממוקדים היא גישה מיושנת כאשר מהירות ורגישות הם קריטיים להצלחה וייצור יבולרווחי 11,12. רקמת הצמח רגישה לפתוגן ממוקד (למשל, חציל עבור P. capsici)מחובר למלכודת שונה כי הוא מושעה בבריכה השקיה לתקופה ממושכת לפני שהוסר ונבדק לזיהום. דגימות מרקמות הצמח מצופה לאחר מכן על מדיה סלקטיבית למחצה (PARPH) ודגירה לצמיחת תרבות, אז זיהוי מורפולוגי מתבצע באמצעות מיקרוסקופמורכב 13. ישנן שיטות זיהוי דומות אחרות עבור פתוגנים צמחיים אחרים באמצעות מדיה סלקטיבית ציפוי כמויות קטנות של מים מזוהמים לפני תת culturing14,15. שיטות אלה דורשות בין 2 ל 6 שבועות, מספר סיבובים של תת-culturing כדי לבודד את האורגניזם, וניסיון על אבחון Phytophthora כדי להיות מסוגל לזהות את התווים המורפולוגיים העיקריים של כל מין. שיטות מסורתיות אלה אינן פועלות היטב לזיהוי מי השקיה מזוהמים על ידי P. capsici בשל גורמים כגון הפרעה על ידי מיקרואורגניזמים אחרים כי הם גם נוכחים במקורות המים. כמה מיקרואורגניזמים הגדלים במהירות כמו Pythium spp. וחיידקים הנישאות במים יכולים לגדול יתר על המידה על הצלחת מה שהופך P. capsici בלתי ניתן לגילוי16,17.
מטרת מחקר זה הייתה לפתח שיטה מולקולרית רגישה וספציפית שניתן להשתמש בה הן בהגדרות שדה והן במעבדה כדי לזהות גני חיות P. capsici במים השקיה. הפרוטוקול כולל פיתוח של פריימר איזותרמי (LAMP) חדשני בתיווך לולאה (LAMP) מסוגל להגביר באופן ספציפי P. capsici, בהתבסס על 1121 בסיס זוג (bp) קטע של P. capsici18,19. פריימר LAMP שפותח בעבר מתוך דונג ואח '. (2015) שימש בהשוואה ל- assay שפותחה עבור מחקר זה20.
אביזר ה-LAMP הוא צורה חדשה יחסית של זיהוי מולקולרי שהוכח להיות מהיר יותר, רגיש, וספציפי יותר מאשר תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית (PCR)21. באופן כללי, מחשבים קונבנציונליים PCR אין אפשרות לזהות תחת 500 עותקים (1.25 pg/μL); לעומת זאת, מחקרים קודמים הראו כי הרגישות של LAMP יכול להיות 10 עד 1,000 פעמים גבוה יותר מאשר PCR קונבנציונלי והוא יכול בקלות לזהות אפילו 1 fg / μL של DNAגנומי 22,23. בנוסף, ניתן לבצע את ההתאסה במהירות (לעתים קרובות ב-30 דקות) ובאתר (בשטח) באמצעות בלוק חימום נייד להגדלה וצבע צבעוני שמשנה צבע לדוגמה חיובית (הסרת הצורך באלקטרופורזה). במחקר זה, השווינו את הרגישות של PCR ו- LAMP assays באמצעות שיטת חילוץ מסנן. שיטת הזיהוי המוצעת מאפשרת לחוקרים ולסוכני הרחבה לזהות בקלות את נוכחותם של נבגים מסוג P. capsici ממקורות מים שונים בתוך פחות משעתיים. ההסתה הוכחה כרגישה יותר מאשר PCR קונבנציונלי, אומתה ב- situ על ידי זיהוי הנוכחות של הפתוגן במים השקיה בשימוש על ידי מגדל. שיטת איתור זו תאפשר למגדלים להעריך את הנוכחות וצפיפות האוכלוסין של הפתוגן במקורות מים שונים המשמשים להשקיה, מניעת התפרצויות הרסניות והפסדים כלכליים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

Phytophthora capsici הוא פתוגן oomycete הרסני המשפיע על גידולים solanaceous ו cucurbit חשובים רבים גרימת הפסדים כלכליים משמעותיים בייצור ירקות מדי שנה. Phytophthora capsici הוא קרקע נישאת ובעיה מתמשכת בשדות ירקות בשל מבני ההישרדות ארוכת החיים שלה (oospores ו כלמידוספורים) המתנגדים לבליה והשפלה. שיטת הפיזור העיקרית היא באמצעות ייצור של zoospores, שהם חד-תאי, נבגים מנוקבים שיכולים לשחות דרך סרטים דקים של מים הנוכחים על משטחים או נקבוביות אדמה מלאות מים יכול להצטבר בשלוליות ובריכות. לכן, בריכות השקיה יכול להיות מקור של פתוגן ונקודות ראשוניות של התפרצויות מחלה. זיהוי של P. capsici במים השקיה קשה באמצעות שיטות מסורתיות מבוססות תרבות כי מיקרואורגניזמים אחרים נוכחים בסביבה, כגון Pythium spp., בדרך כלל overgrow P. capsici מה שהופך אותו בלתי ניתן לגילוי. כדי לקבוע את הנוכחות של נבגים P. capsici במקורות מים (מי השקיה, runoff, וכו '), פיתחנו עבודת נייר מסנן מבוססת משאבת יד (8-10 μm) שיטה הלוכדת נבגים של הפתוגן (zoospores) ומאוחר יותר משמש כדי להגביר את ה-DNA של הפתוגן באמצעות לולאה רומן מתווכת תוגרה (LAMP) essay שנועדה להגבר ספציפי של P capsici. שיטה זו יכולה להגביר ולזהות DNA מריכוז נמוך כמו 1.2 x 102 zoospores / מ"ל, שהוא 40 פעמים רגיש יותר מאשר PCR קונבנציונלי. לא הושגה ההגדלה צולבת בעת בדיקת מינים קרובים. LAMP בוצעה גם באמצעות צבע LAMP מאסטר לערבב צבע צבע, הצגת תוצאות כי ניתן לקרוא בעין בלתי לזיהוי מהיר באתר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם פתוגנים אחרים השוכן, לצבור, או מפוזרים באמצעות מערכות השקיה מזוהמות.

אופטימיזציה של שיטת LAMP במחקר זה, זיהינו את הנוכחות של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה ניידת מתווכת גברה isothermal (LAMP) assay. ראשית, תסוואי LAMP המוצע היה אופטימיזציה על ידי בדיקת ריכוזי פריימר LAMP שונים [F3, B3 (0.1–0.5 μM כל אחד); LF, LB (0.5–1.0 μM כל אחד) ו- FIP, BIP (0.8–2.4 μM כל אחד)], משכים (30-70 דקו...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

פיתחנו שיטה לזיהוי zoospores capsici Phytophthora במקורות מים באמצעות שיטת הפקת DNA נייר מסנן יחד עם לולאה בתיווך isothermal תוגבר (LAMP) essay שניתן לנתח בתחום או במעבדה.

זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

זיהוי פיטופתוגן הוא צעד מכריע בניהול מחלות צמחים. פרוטוקול זה מספק שיטת זיהוי מהירה לזיהום מי השקיה עקב פתוגן לוחם נפוץ המועבר במים. באמצעות טכניקה זו, פתוגן ספציפי, כגון Phytophthora capcici, ניתן לעבד ולזהות במהירות מהנפח הגדול שלנו של מי השקיה תוך שמירה על האתר.הדגמת ההליך יהיה אוון הדסון, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, ו Sumyya Waliullah, חוקר PostDoctoral מהמעבדה של ד"ר Pingxi G להקים משאבה ומסנן עבור באתר Phytophthora capcici זיהוי מי השקיה. חבר בקבוק סינון לצינור המחובר למשאבת יד והתאים משפך בוכנר לתוך פקק הגומי בפה של בקבוק הסינון. לאחר מכן התאם פיסת נייר סינון בגודל מתאים עם גודל שימור של 15 מיקרון לתוך המשפך.כדי להשיג דגימות מים לאסוף מי השקיה מהמקור היעד. המים עשויים להיות כמויות קטנות של פסולת, אבל לא מעים משמעותיים או אדמה. יוצקים לאט בין 50 ל -1000 מיליליטר של מי בדיקה על נייר המסנן בתוך המשפך תוך שימוש במשאבת היד כדי ליצור יניקה כדי למשוך את המים דרך המשפך.כאשר כל המים מסוננים, השתמש במדפים כדי להסיר את נייר הסינון מהמשפך. ולהשתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך את הנייר לחתיכות קטנות. טביעה שמונה עד 12 חתיכות נייר ב 400 microliters של חיץ החילוץ בצינור 1.5 מיליליטר עבור דגירה חמש דקות בטמפרטורת החדר.מערבולת או להתסיס את הנייר בדרך אחרת במשך 10 שניות פעם בדקה. בסוף הדגירה, השתמש במדפים כדי להסיר את הנייר עם חיץ קטן ככל האפשר. ולחזור על הרישיון עם הסט הבא של חתיכות נייר מסנן.עבור מיצוי DNA מדגימות נייר המסנן הוסיף 20 microliters של proteinase K ו 10 microliters של 10 ננוגרם לכל RNAs microliter לדגימה מדי דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות עם מערבולת או רועד כל שלוש דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים במאגר מחייב לדגימה ומערבבים היטב על ידי טלטול. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הצינור ואת מתלה המפריד המגנטי במשך שתי דקות לפני הסרת והשליכת העל-טבעי.מוציאים את הצינור מהמפריד המגנטי ומשעה מחדש במרץ את חרוזים ב 500 microliters של חיץ לשטוף. לאחר 30 שניות להחזיר את הצינור למגנט ולחכות שתי דקות לפני השלכת supernatant. חזור על הכביסה עם 500 microliters של חיץ לשטוף מדי 500 microliters של 80% אתנול כפי שהוכח רק.ואוויר להניע את גלולת חרוז מגנטי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה מחדש להשעות את חרוזים ב 50 microliters של חיץ אלוט עם צינורות במשך דקה אחת לפני הצבת הצינור בחזרה על המגנט במשך שתי דקות כדי לאפשר איסוף של supernatant. לאחר הכנת תערובת פריימר LAMP כפי שצוין בטבלה, להוסיף ב 2.5 microliters של פרימר לערבב 12.5 microliters של מאסטרמיקס LAMP לבה אחד microliter של DNA שחולצו ותשעה microliters של מים מזוקקים כפולים לצינור PCR ולהגדיר שליטה חיובית אחת שלילית אחת.הדגירה כל הדגימות בבלוג חום 64 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות או מכשיר הגברה ג'יני שלוש בסוף הדגירה, עומס של חמישה microliters של כל דגימה מוגברת על 1% agarose ג'ל תמונה הרצועות וכתוצאה מכך על מכונת הדמיה אולטרה סגולה. אם נעשה שימוש בצבע קלורימטרי, הצג את שינוי הצבע כדי לקבוע את התוצאות כחיוביות או שליליות. אם נעשה שימוש בכלי הגברה נייד, הצג את גרף ההגברה על המסך כדי לקבוע את התוצאות.הזמן האופטי להפעלת מישן LAMP ב 64 מעלות הוא 45 דקות, כמו הריכוזים הנמוכים ביותר שהיו חיוביים לגילוי אינם מוגברים עד 40 דקות, בעוד ריכוזים גבוהים יותר מוגברים ב 20 דקות. הגברה ניתן לאשר על 1% ג'ל agarose שכותרתו עם כתם חומצה גרעינית. כפי שמודגם PCR קונבנציונלי הוא 40 פעמים פחות רגיש מאשר LAMP.גילוי 4.8 פעמים 10 לגני החיות השלישיים לריכוזים מיליליטר בנמוך ביותר. בניתוח זה נאספו דגימות מים משבע בריכות המשמשות לייצור ירקות מסחרי במחוז טיפט, ג'ורג'יה. שלושה מהם הפגינו תוצאות חיוביות של LAMP.כאשר הדגימות נבדקו על ידי PCR קונבנציונלי עם זאת, zoospores זוהו רק באחת משלוש דגימות חיוביות. בטבלה זו, ההבדלים בין שיטות זיהוי באמצעות משתנים כגון רגישות, זמן, הכנה נדרשת, חומרים ועלות מסוכמים. LAMP היא השיטה הזולה ביותר מבין השיטות שנבדקו, והיא גם המהירה ביותר, הדורשת רק 30 עד 60 דקות להגברה בהשוואה להגברת PCR קונבנציונלית.באמצעות פרוטוקול זה DNA שחולצו פתוגנים הקשורים קשר הדוק UMI זרעי תוצאות אין זיהוי עבור כל הדגימות, המאשר את הספציפיות של פריימרים. הקפד לא לשפוך את המים מדגם מהר מדי להיזהר בעת הוספת DNA שחולצו צינורות LAMP כדי להגביל את הזיהום. לאחר שפותחו פתוגנים אחרים המועברים במים, ניתן להתאים את שיטות הסינון וחומצת המנורה לפתוגנים אחרים.

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

מבוסס נייר Colorimetric איתור של<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt;,<em&gt; סלמונלה</em&gt; Spp., ו<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; מכמויות גדולות של מים לחקלאות

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

נקבע מעבדה זרחן שטף מאגם המשקעים כמדד לטעינה הפנימית זרחן

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

מבדק נפח קטן להערכה בקטריאלי / הפיטופלנקטון Co-תרבות שימוש במים-Pulse-Amplitude-אופנן (WATER-PAM) Fluorometry

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; Spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

סיקור הפעילות האנדוקרינית במים באמצעות מסחרי-זמין<em&gt; במבחנה</em&gt; Transactivation bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

פשוט לשתול טכניקה מחדש הקמת עצי שבו מתרחשת בתדירות מושאן

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication בדיקות של התאמת הסביבה זרם עבור צעירים מים מתוקים פנינה מולים בשיטות בחשיפה באתרו

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

אופטימיזציה הליך לקביעת ספיחה של Phosphonates על גבי הידרוקסיד Ferric פרטנית באמצעות שיטה נחישות זרחן מיניאטורי

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...