Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

इस काम को जॉर्जिया कमोडिटी कमीशन फॉर मज़ेज प्रोजेक्ट आईडी # FP00016659 की वित्तीय मदद मिली। लेखकों ने फाइटोफथोरा एसपीपीकी शुद्ध संस्कृतियों को उपलब्ध कराने के लिए जॉर्जिया विश्वविद्यालय के डॉ पिंगशेंग जी और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी के डॉ ऐनी डोरेंस का शुक्रिया अदा किया । हम पूरे अध्ययन में उनकी तकनीकी सहायता के लिए ली वांग और डेलोरिस वेनी को भी धन्यवाद देते हैं ।

1. पोर्टेबल लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन का उपयोग करके सिंचाई के पानी से फाइटोफथोरा कैप्सिकी का ऑन-साइट डिटेक्शन
<ol><li>पंप और फिल्टर की स्थापना<ol>
<li>एक ट्यूब है कि एक हैंडपंप से जुड़ा हुआ है ताकि जब...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops:+research+progress+and+management+challenges.">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li><li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water.">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li><li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water.">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li><li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov.">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li><li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens.">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici.">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici.">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li><li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani.">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).</li><li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

फाइटोपैथोजन के लिए सिंचाई के पानी की जांच सिंचाई तालाबों और पुनर्नवीनीकरणजलका उपयोग करने वाले उत्पादकों के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । सिंचाई तालाब कई फाइटोपैथोजन के लिए एक जलाशय और प्रजनन स?...

खेतों और नर्सरी में पानी रीसाइक्लिंग पानी की लागत में वृद्धि और पानी के उपयोग के पीछे पर्यावरण चिंताओं के कारण तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है । पौधों की बीमारी के फैलाव और घटना को कम करने के लिए उत्पादकों के लिए कई सिंचाई विधियां विकसित की गई हैं । पानी (सिंचाई या वर्षा) के स्रोत के बावजूद, अपवाह उत्पन्न होता है, और कई सब्जी और नर्सरी उत्पादकों के पास अपवाह1को इकट्ठा करने और रीसायकल करने के लिए एक तालाब है। यह संभावित रोगजनक संचय के लिए एक जलाशय बनाता है जो रोगजनकों के प्रसार के पक्ष में होता है जब पुनर्नवीनीकरण पानी का उपयोग फसलों की सिंचाई के लिए किया जाता है2,3,4. ओमिसेट पौधे के रोगजनक विशेष रूप से इस अभ्यास से लाभान्वित होते हैं क्योंकि चिड़ियाघर के बीजाणु पानी में जमा हो जाएंगे और प्राथमिक फैलाव बीजाणु आत्म-गतिशील होता है लेकिन इसके लिए सतही जल5,,6,7कीआवश्यकता होती है। फाइटोफथोरा कैप्सिकी एक ओमोफिसेट रोगजनक है जो विभिन्न तरीकों से काफी संख्या में सोलनसियस और क्यूकरबिट फसलों को प्रभावित करता है8. अक्सर, लक्षण रोपण, जड़ और मुकुट सड़ांध के बंद होते हैं; हालांकि, ककड़ी, स्क्वैश, तरबूज, कद्दू, तरबूज, बैंगन और काली मिर्च के रूप में फसलों में, पूरी फसल फल सड़ांध9के कारण खो सकता है . यद्यपि इस पौधे के रोगजनक का पता लगाने के ज्ञात तरीके हैं, अधिकांश को पहले से ही संक्रमण की आवश्यकता होती है जो किसी भी निवारक कवकनाशकों के लिए बहुत देर हो चुकी है10महत्वपूर्ण प्रभाव है।
लक्षित सूक्ष्मजीवों का पता लगाने और निदान के लिए सिंचाई के पानी का परीक्षण करने की पारंपरिक विधि एक प्राचीन दृष्टिकोण है जब गति और संवेदनशीलता सफलता और लाभदायक फसल उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है11,12. लक्षित रोगजनक के लिए अतिसंवेदनशील पौधे के ऊतक (उदाहरण के लिए, पी कैप्सिकीके लिए बैंगन) एक संशोधित जाल से जुड़ा हुआ है जिसे संक्रमण के लिए हटाया और निरीक्षण करने से पहले विस्तारित अवधि के लिए सिंचाई तालाब में निलंबित कर दिया जाता है। पौधे के ऊतकों से नमूने फिर अर्ध-चयनात्मक मीडिया (PARPH) पर चढ़ाया जाता है और संस्कृति के विकास के लिए इनक्यूबेटेड होता है, फिर यौगिक माइक्रोस्कोप13का उपयोग करके रूपात्मक पहचान की जाती है। चुनिंदा मीडिया का उपयोग करके अन्य पौधों के रोगजनकों के लिए अन्य समान पहचान के तरीके हैं और14,,15से पहले दूषित पानी की थोड़ी मात्रा में चढ़ाना है। इन तरीकों को 2 से 6 सप्ताह तक कहीं भी आवश्यकता होती है, जीव को अलग करने के लिए उप-संस्कृति के कई दौर, और प्रत्येक प्रजाति के प्रमुख रूपात्मक पात्रों को पहचानने में सक्षम होने के लिए फाइटोफथोरा निदान पर अनुभव। ये पारंपरिक तरीके जल स्रोतों में मौजूद अन्य सूक्ष्मजीवों के हस्तक्षेप जैसे कारकों के कारण पी कैप्सी द्वारा दूषित सिंचाई जल का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करते हैं । पिथियम एसपीपी और जल जनित जीवाणु जैसे कुछ तेजी से बढ़ते सूक्ष्मजीव प्लेट पर अधिक वृद्धि कर सकते हैं जिससे पी कैप्सिकी अज्ञेय16,,17हो सकती है ।
इस अध्ययन का उद्देश्य एक संवेदनशील और विशिष्ट आणविक विधि विकसित करना था जिसका उपयोग सिंचाई के पानी में पी कैप्सी चिड़ियाघरों का पता लगाने के लिए क्षेत्र और प्रयोगशाला दोनों सेटिंग्स में किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में पी कैप्सिकी,18, 19 के 1121-बेस जोड़ी (बीपी) टुकड़े के आधार पर विशेष रूप से पी कैप्सिकीको बढ़ाने में सक्षम एक उपन्यास लूप-मध्यस्थता इसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) प्राइमर का विकास शामिल19 है।18 डोंग एट अल (2015) से पहले विकसित लैंप प्राइमर का उपयोग इस अध्ययन20के लिए विकसित की गई परख की तुलना में किया गया था।
लैंप परख आणविक पहचान का एक अपेक्षाकृत नया रूप है जिसे पारंपरिक पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)21की तुलना में अधिक तेजी से, संवेदनशील और विशिष्ट होने का प्रदर्शन किया गया है। सामान्य तौर पर, पारंपरिक पीसीआर परख 500 प्रतियों (1.25 स्नातकोत्तर/μL) के तहत पता नहीं लगा सकता है; इसके विपरीत, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि लैंप की संवेदनशीलता पारंपरिक पीसीआर की तुलना में 10 से 1,000 गुना अधिक हो सकती है और आसानी से जीनोमिक डीएनए22, 23,23के 1 fg/μL का भी पता लगा सकती है। इसके अतिरिक्त, परख तेजी से किया जा सकता है (अक्सर 30 मिनट में) और साइट पर (क्षेत्र में) प्रवर्धन के लिए एक पोर्टेबल हीटिंग ब्लॉक और एक कोलोरिमेट्रिक डाई का उपयोग करके जो एक सकारात्मक नमूने के लिए रंग बदलता है (इलेक्ट्रोफोरेसिस की आवश्यकता को हटाना)। इस अध्ययन में, हमने फिल्टर निष्कर्षण विधि का उपयोग करके पीसीआर और लैंप की संवेदनशीलता की तुलना की। प्रस्तावित पहचान विधि शोधकर्ताओं और विस्तार एजेंटों को आसानी से दो घंटे से भी कम समय में विभिन्न जल स्रोतों से पी कैप्सी बीजाणुओं की उपस्थिति का पता लगाने की अनुमति देती है । परख पारंपरिक पीसीआर की तुलना में अधिक संवेदनशील साबित होती है और एक उत्पादक द्वारा उपयोग किए जाने वाले सिंचाई पानी में रोगजनक की उपस्थिति का पता लगाकर सीटू में मान्य किया गया था। यह पता लगाने की विधि उत्पादकों को सिंचाई के लिए इस्तेमाल किए जा रहे विभिन्न जल स्रोतों में रोगजनक की उपस्थिति और जनसंख्या घनत्व का अनुमान लगाने की अनुमति देगी, जिससे विनाशकारी प्रकोपों और आर्थिक नुकसान को रोका जा सकेगा ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

फाइटोफथोरा कैप्सिकी एक विनाशकारी ओमीसेट रोगजनक है जो कई महत्वपूर्ण सोलनसियस और कुकुरबिट फसलों को प्रभावित करता है जिससे सब्जी उत्पादन में सालाना महत्वपूर्ण आर्थिक नुकसान होता है। फाइटोफथोरा कैप्सिकी मिट्टी जनित है और सब्जी के खेतों में एक लगातार समस्या है क्योंकि इसकी लंबे समय से जीवित रहने वाली जीवित संरचनाओं (ओस्पोर और क्लैमाइडोसपोर्स) के कारण मौसम और गिरावट का विरोध होता है। फैलाव की मुख्य विधि चिड़ियाघरों के उत्पादन के माध्यम से है, जो एकल कोशिकीय, ध्वजारोहण बीजाणु हैं जो सतहों पर या पानी से भरे मिट्टी के छिद्रों में मौजूद पानी की पतली फिल्मों के माध्यम से तैर सकते हैं और पोखर और तालाबों में जमा हो सकते हैं। इसलिए सिंचाई तालाब रोगजनक और रोग फैलने के शुरुआती बिंदुओं का स्रोत हो सकते हैं। सिंचाई के पानी में पी कैप्सिकी का पता लगाना पारंपरिक संस्कृति आधारित तरीकों का उपयोग करना मुश्किल है क्योंकि पर्यावरण में मौजूद अन्य सूक्ष्मजीव, जैसे पाइथियम एसपीपी, आमतौर पर ओवरग्रो पी कैप्सिकी इसे अज्ञेय बनाता है। पी की उपस्थिति निर्धारित करना। जल स्रोतों (सिंचाई जल, अपवाह, आदि) में शिमला मिर्च बीजाणु, हमने एक हैंडपंप-आधारित फिल्टर पेपर (8-10 माइक्रोन) विधि विकसित की जो रोगजनक के बीजाणुओं (चिड़ियाघरों) को कैप्चर करती है और बाद में पी के विशिष्ट प्रवर्धन के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास लूप-मध्यस्थता आइसोथेरमल एम्पलीफिकेशन (लैंप) परख के माध्यम से रोगजनक के डीएनए को बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह विधि 1.2 x 10 2 चिड़ियाघरों/एमएल2 के रूप में कम एकाग्रता से डीएनए को बढ़ाना और पता लगा सकती है, जो पारंपरिक पीसीआर की तुलना में ४० गुना अधिक संवेदनशील है । बारीकी से संबंधित प्रजातियों का परीक्षण करते समय कोई क्रॉस-प्रवर्धन प्राप्त नहीं किया गया था। लैंप को एक कोलोरिमेट्रिक लैंप मास्टर मिक्स डाई का उपयोग करके भी किया गया था, जिसमें उन परिणामों को प्रदर्शित किया गया था जिन्हें ऑन-साइट रैपिड डिटेक्शन के लिए नग्न आंखों से पढ़ा जा सकता था। इस प्रोटोकॉल को अन्य रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो दूषित सिंचाई प्रणालियों के माध्यम से रहते हैं, जमा होते हैं या फैलाए जाते हैं।

दीपक विधि का अनुकूलन इस अध्ययन में, हमने पोर्टेबल लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) परख का उपयोग करके सिंचाई के पानी में फाइटोफथोरा कैप्सिकी की उपस्थिति का पता लगाया। सबसे पहले, प्रस्...

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Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

हमने एक फिल्टर पेपर डीएनए निष्कर्षण विधि का उपयोग करके जल स्रोतों में फाइटोफथोरा कैप्सपोर का पता लगाने के लिए एक विधि विकसित की है, जिसमें लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) परख है जिसका विश्लेषण क्षेत्र में या प्रयोगशाला में किया जा सकता है।

लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन का उपयोग करके सिंचाई जल में फाइटोफथोरा कैप्सिकी का पता लगाना

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

फाइटोपैथोजन डिटेक्शन पौधे रोग प्रबंधन में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह प्रोटोकॉल एक आम जलजनित लड़ाकू रोगजनक के कारण सिंचाई जल संदूषण के लिए एक तेजी से पता लगाने की विधि प्रदान करता है। इस तकनीक का उपयोग करके, फाइटोफथोरा कैपसीसीआई जैसे विशिष्ट रोगजनक को साइट पर शेष रहते हुए हमारी बड़ी मात्रा में सिंचाई पानी से संसाधित और तेजी से पता लगाया जा सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन ओवेन हडसन, मेरी प्रयोगशाला से एक परास्नातक छात्र, और सुम्या वलीउल्लाह, डॉ पिंगक्सी जी की प्रयोगशाला से एक पोस्टडॉक्टोरल शोधकर्ता के लिए एक पंप और साइट पर के लिए फिल्टर स्थापित किया जाएगा फाइटोफथोरा कैपसी सिंचाई के पानी में पता लगाने । एक हैंडपंप से जुड़े ट्यूब के लिए एक फ़िल्टरिंग फ्लास्क संलग्न करें और फ़िल्टरिंग फ्लास्क के मुंह में रबर डाट में बुचनर कीप फिट करें। फिर फ़नल में 15 माइक्रोन प्रतिधारण आकार के साथ फिल्टर पेपर का एक उचित आकार का टुकड़ा फिट करें।पानी के नमूने प्राप्त करने के लिए लक्षित स्रोत से सिंचाई का पानी एकत्र करना। पानी में मलबे की मात्रा कम हो सकती है, लेकिन महत्वपूर्ण तलछट या मिट्टी नहीं। धीरे-धीरे कीप के माध्यम से पानी खींचने के लिए एक सक्शन बनाने के लिए हैंडपंप का उपयोग करते समय कीप के अंदर फिल्टर पेपर पर परीक्षण पानी के 50 से 1000 मिलीलीटर के बीच डालना।जब सभी पानी फ़िल्टर हो गए हैं, तो फ़लप से फिल्टर पेपर को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। और छोटे टुकड़ों में कागज काटने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन पांच मिनट के लिए एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में निष्कर्षण बफर के ४०० माइक्रोलीटर में कागज के आठ से 12 टुकड़े जलमग्न ।भंवर या अन्यथा हर मिनट एक बार 10 सेकंड के लिए कागज उत्तेजित। इनक्यूबेशन के अंत में, जितना संभव हो उतना कम बफर के साथ पेपर को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। और फिल्टर कागज टुकड़े के अगले सेट के साथ लाइसेंस दोहराएं।फिल्टर पेपर नमूनों से डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रोटीन के 20 माइक्रोलीटर और 10 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर प्रति माइक्रोलीटर नमूना करने के लिए भी जोड़ा और भंवर या हर तीन मिनट हिला के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान इनक्यूबेट । इनक्यूबेशन के अंत में, नमूने के लिए बफर बाध्यकारी में चुंबकीय मोतियों के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और मिलाते हुए अच्छी तरह से मिश्रण करें। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के बाद, ट्यूब और चुंबकीय विभाजक रैक को हटाने और सुपरनैंट को त्यागने से पहले दो मिनट के लिए रखें।चुंबकीय विभाजक से ट्यूब निकालें और वॉश बफर के 500 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित करें। 30 सेकंड के बाद ट्यूब को चुंबक में वापस कर दें और सुपरनैंट को छोड़ने से पहले दो मिनट इंतजार करें। वॉश बफर के 500 माइक्रोलीटर के साथ वॉश को भी दोहराएं और 80% इथेनॉल के 500 माइक्रोलीटर के रूप में अभी प्रदर्शित किया गया है।और हवा कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए चुंबकीय मनका गोली ड्राइव । इनक्यूबेशन के अंत में दो मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब वापस रखने से पहले एक मिनट के लिए पाइपिंग के साथ elution बफर के ५० माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए supernatant के संग्रह की अनुमति है । लैंप प्राइमर मिश्रण तैयार करने के बाद जैसा कि तालिका में दर्शाया गया है, प्राइमर मिक्स के 2.5 माइक्रोलीटर में जोड़ें 12.5 माइक्रोलीटर एक लावा लैंप मास्टरमिक्स के एक माइक्रोलीटर निकाले गए डीएनए के एक माइक्रोलीटर और डबल आसुत पानी के नौ माइक्रोलीटर एक पीसीआर ट्यूब में और एक सकारात्मक और एक नकारात्मक नियंत्रण स्थापित करें।45 मिनट के लिए 64 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉग में सभी नमूनों को इनक्यूबेट करें या इनक्यूबेशन के अंत में जिन्न तीन प्रवर्धन उपकरण, प्रत्येक प्रवर्धित नमूने के पांच माइक्रोलीटर का एक लोड 1% एगर उठे जेल पर और एक पराबैंगनी इमेजिंग मशीन पर परिणामस्वरूप बैंड छवि। यदि एक कैलोरीमेट्रिक डाई का उपयोग किया गया था, तो परिणामों को सकारात्मक या नकारात्मक के रूप में निर्धारित करने के लिए रंग परिवर्तन देखें। यदि एक पोर्टेबल प्रवर्धन उपकरण का उपयोग किया गया था, तो परिणाम निर्धारित करने के लिए स्क्रीन पर प्रवर्धन ग्राफ देखें।64 डिग्री पर दीपक परख चलाने के लिए ऑप्टिकल समय 45 मिनट है, क्योंकि पता लगाने के लिए सकारात्मक थीं सबसे कम सांद्रता 40 मिनट तक परिलक्षित नहीं होती है, जबकि उच्च सांद्रता 20 मिनट में परिलक्षित होती है। प्रवर्धन एक नाभिक एसिड दाग के साथ लेबल एक 1% agarose जेल पर पुष्टि की जा सकती है । जैसा कि सचित्र पारंपरिक पीसीआर लैंप की तुलना में 40 गुना कम संवेदनशील है।सबसे कम पर मिलीलीटर सांद्रता प्रति तीसरे zoospores के लिए ४.८ गुना 10 का पता लगाने । इस विश्लेषण में, जॉर्जिया के टिफ्ट काउंटी में वाणिज्यिक सब्जी उत्पादन के लिए उपयोग किए जाने वाले सात तालाबों से पानी के नमूने एकत्र किए गए थे । जिनमें से तीन सकारात्मक दीपक परिणाम का प्रदर्शन किया ।जब पारंपरिक पीसीआर द्वारा नमूनों का परीक्षण किया गया, तो तीन सकारात्मक नमूनों में से केवल एक में चिड़ियाघरों का पता चला । इस तालिका में, संवेदनशीलता, समय, आवश्यक तैयारी, सामग्री और लागत जैसे चर का उपयोग करके पता लगाने के तरीकों के बीच अंतर संक्षेप में प्रस्तुत किया जाता है। लैंप परीक्षण विधियों के बीच सबसे कम खर्चीला तरीका है, और यह भी सबसे तेज है, पारंपरिक पीसीआर प्रवर्धन की तुलना में प्रवर्धन के लिए केवल 30 से 60 मिनट की आवश्यकता होती है।बारीकी से संबंधित UMI बीज रोगजनकों से निकाले गए इस प्रोटोकॉल डीएनए का उपयोग करने से किसी भी नमूने के लिए कोई पता नहीं चलता है, जो प्राइमर की विशिष्टता की पुष्टि करता है। सुनिश्चित करें कि नमूना पानी भी तेजी से नहीं डालना है और जब दीपक ट्यूबों के लिए निकाले गए डीएनए को जोड़ने के लिए संदूषण को सीमित करने के लिए सावधान रहना होगा । एक बार अन्य जलजनित रोगजनकों ने अपने विशिष्ट प्राइमर सेट विकसित किए हैं, तो निस्पंदन और लैंप एसिड विधियों को अन्य रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

वर्णमिति जांच के कागज आधारित<em&gt; कोलाई</em&gt;,<em&gt; साल्मोनेला</em&gt; एसपीपी., और<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em&gt; कृषि पानी की बड़ी मात्रा से

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

झील अवसादों से प्रयोगशाला निर्धारित फास्फोरस फ्लक्स आंतरिक फास्फोरस लोड का एक उपाय के रूप में

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

Enterovirus और संस्कृति और आर टी-qPCR के द्वारा जल में Norovirus घटना के लिए EPA विधि 1615. मापन। वायरस के नमूने की आई संग्रह

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

एक छोटी मात्रा Bioassay जल-पल्स आयाम संग्राहक (जल-पीएएम) Fluorometry का प्रयोग बैक्टीरियल / Phytoplankton सह संस्कृति का आकलन करने के लिए

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Enterovirus और संस्कृति और RT-qPCR द्वारा पानी में Norovirus घटना की ईपीए विधि 1615 मापन। भाग III। RT-qPCR द्वारा वायरस का पता लगाने

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

एक साथ मात्रा के लिए एक डुप्लेक्स डिजिटल पीसीआर परख<em&gt; उदर एसपीपी।</em&gt; और वाटर्स में मानव मल से जुड़े HF183 मार्कर

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

जल का उपयोग करने में अंतःस्रावी गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Transactivation bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

पुनः के लिए एक सरल रोपण तकनीक पेड़ जहां अक्सर सैलाब होता है की स्थापना

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

युवा मीठे पानी मोती Mussels के लिए धारा पर्यावरण उपयुक्तता का उपयोग करने के लिए

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

एक लघुकृत फास्फोरस निर्धारण विधि का उपयोग दानेदार घाट हीड्राकसीड पर Phosphonates के सोखना निर्धारित करने के लिए अनुकूलित प्रक्रिया

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...