Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Dette arbeidet fikk økonomisk støtte fra Georgia Commodity Commission for Vegetables prosjekt ID # FP00016659. Forfatterne takker Dr. Pingsheng Ji, University of Georgia og Dr. Anne Dorrance, Ohio State University for å gi rene kulturer av Phytophthora spp. Vi takker også Li Wang og Deloris Veney for deres tekniske hjelp gjennom hele studien.

1. På stedet påvisning av Phytophthora capsici fra vanning vanning vann ved hjelp av bærbar loop-mediert isotermisk forsterkning
<ol><li>Sette opp pumpen og filteret<ol>
<li>Fest en filtreringskolbe til et rør som er koblet til en håndpumpe, slik at når pumpen er aktivert, trekkes luft inn gjennom munnen på filtreringskolben.</li>
		<li>Monter Buchner-trakten i gummiproppen til munningen av filtreringsflasken og monter det passende størrelsesfilterpapiret i Buchner-trakten slik at luft trekkes gjennom ...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops:+research+progress+and+management+challenges.">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li><li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water.">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li><li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water.">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li><li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov.">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li><li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens.">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici.">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici.">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li><li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani.">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).</li><li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

Testing av vanning vann for fytopathogens er et avgjørende skritt for dyrkere ved hjelp av vanning dammer og resirkulert vann27. Vanning dammer gir et reservoar og avlsmiljø for en rekke fytopatogener som overflødig vanning vanning vann er rettet fra feltet til dammen bærer med seg noen patogener som kan ha vært tilstede 16,27. Den tradisjonelle metoden for påvisning av plantepatogener i en stor vannkilde er å sette en agn for patog...

Resirkulering av vann i gårder og barnehager blir stadig mer populært på grunn av økningen i vannkostnader og miljøhensyn bak vannforbruket. Mange vanningsmetoder er utviklet for dyrkere for å redusere spredningen og forekomsten av plantesykdom. Uavhengig av kilden til vannet (vanning eller nedbør), genereres avrenning, og mange grønnsaks- og barnehagedyrkere har en dam å samle og resirkulere avrenning1. Dette skaper et reservoar for mulig patogenakkumulering som favoriserer spredningen av patogener når resirkulert vann brukes til å vanneavlinger 2,,3,,4. Oomycete plante patogener spesielt dra nytte av denne praksisen som zoospores vil akkumuleres i vann og den primære dispersive spore er selvmotil, men krever overflatevann5,,6,,7. Phytophthora capsici er et oomycete patogen som påvirker et betydelig antall solanaceous og cucurbit avlinger på forskjellige måter8. Ofte er symptomene demping av frøplanter, rot og kroneråte; Men i avlinger som agurk, squash, melon, gresskar, vannmelon, aubergine og pepper, kan hele avlinger gå tapt på grunn av fruktråte9. Selv om det finnes kjente metoder for å oppdage dette plantepatogenet, krever de fleste en infeksjon som allerede har funnet sted, noe som er for sent for at forebyggende soppmidler har en betydelig effekt10.
Den tradisjonelle metoden for å teste vanningsvann for deteksjon og diagnose av målrettede mikroorganismer er en foreldet tilnærming når hastighet og følsomhet er avgjørende for suksess og lønnsom avlingsproduksjon11,,12. Plantevev utsatt for det målrettede patogenet (f.eks. aubergine for P. capsici) er festet til en modifisert felle som er suspendert i en vanningsdam i lengre periode før den fjernes og inspiseres for infeksjon. Prøver fra plantevevet blir deretter belagt på halvselektive medier (PARPH) og inkubert for kulturvekst, deretter utføres morfologisk identifikasjon ved hjelp av et sammensatt mikroskop13. Det finnes andre lignende deteksjonsmetoder for andre plantepatogener ved hjelp av selektive medier og plating små mengder forurenset vann før sub-culturing14,15. Disse metodene krever alt fra 2 til 6 uker, flere runder med sub-culturing for å isolere organismen, og erfaring på Phytophthora diagnostikk for å kunne gjenkjenne de viktigste morfologiske tegnene til hver art. Disse tradisjonelle metodene fungerer ikke godt for påvisning av vanningsvann forurenset av P. capsici på grunn av faktorer som interferens av andre mikroorganismer som også finnes i vannkildene. Noen raskt voksende mikroorganismer som Pythium spp. og vannbårne bakterier kan overgrow på platen gjør P. capsici undetectable16,17.
Formålet med denne studien var å utvikle en sensitiv og spesifikk molekylær metode som kan brukes i både felt- og laboratorieinnstillinger for å oppdage P. capsici zoospores i vanningsvann. Protokollen inkluderer utvikling av en ny loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) primer satt i stand til å spesifikt forsterke P. capsici, basert på en 1121-base par (bp) fragment av P. capsici18,19. En tidligere utviklet LAMP primer fra Dong et al. (2015) ble brukt i forhold til analysen som ble utviklet for denne studien20.
LAMP-analysen er en relativt ny form for molekylær deteksjon som har vist seg å være raskere, følsom og spesifikk enn konvensjonell polymerasekjedereaksjon (PCR)21. Generelt kan ikke konvensjonelle PCR-analyser oppdages under 500 kopier (1,25 pg/μL); I motsetning har tidligere studier vist at følsomheten til LAMP kan være 10 til 1000 ganger høyere enn konvensjonell PCR og kan lett oppdage selv 1 fg / μL genomisk DNA22,23. I tillegg kan analysen utføres raskt (ofte i 30 min) og på stedet (i feltet) ved hjelp av en bærbar varmeblokk for forsterkning og et kolorimetrisk fargestoff som endrer farge for en positiv prøve (fjerne behovet for elektroforese). I denne studien sammenlignet vi følsomheten til PCR- og LAMP-analyser ved hjelp av en filterekstraksjonsmetode. Den foreslåtte deteksjonsmetoden gjør det mulig for forskere og utvidelsesmidler å enkelt oppdage tilstedeværelsen av P. capsici sporer fra forskjellige vannkilder på mindre enn to timer. Analysen er bevist å være mer følsom enn konvensjonell PCR og ble validert in situ ved å oppdage tilstedeværelsen av patogenet i vanningsvannet som brukes av en dyrker. Denne påvisningsmetoden vil tillate dyrkere å estimere tilstedeværelsen og befolkningstettheten til patogenet i ulike vannkilder som brukes til vanning, og forhindrer ødeleggende utbrudd og økonomiske tap.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

Phytophthora capsici er et ødeleggende oomycete patogen som påvirker mange viktige solanaceous og cucurbit avlinger forårsaker betydelige økonomiske tap i vegetabilsk produksjon årlig. Phytophthora capsici er jordbåren og et vedvarende problem i vegetabilske felt på grunn av sine langvarige overlevelsesstrukturer (oospores og klamydospores) som motstår forvitring og nedbrytning. Den viktigste metoden for spredning er gjennom produksjon av dyrespores, som er encellede, flagellated sporer som kan svømme gjennom tynne filmer av vann tilstede på overflater eller i vannfylte jordporer og kan akkumuleres i pytter og dammer. Derfor kan vanningsdammer være en kilde til patogenet og de første punktene av sykdomsutbrudd. Påvisning av P. capsici i vanning vanning vann er vanskelig å bruke tradisjonelle kulturbaserte metoder fordi andre mikroorganismer tilstede i miljøet, for eksempel Pythium spp., vanligvis overgrow P. capsici gjør det umulig å oppdage. For å bestemme tilstedeværelsen av P. capsici sporer i vannkilder (vanning vann, avrenning, etc.), utviklet vi en håndpumpebasert filterpapir (8-10 μm) metode som fanger patogenets sporer (zoospores) og brukes senere til å forsterke patogenets DNA gjennom en ny loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) analyse designet for den spesifikke forsterkningen av P. capsici. Denne metoden kan forsterke og oppdage DNA fra en konsentrasjon så lavt som 1,2 x 102 zoospores / ml, som er 40 ganger mer følsom enn konvensjonell PCR. Ingen kryssforsterkning ble oppnådd ved testing av nært beslektede arter. LAMP ble også utført ved hjelp av en kolorimetrisk LAMP master mix fargestoff, viser resultater som kan leses med det blotte øye for rask deteksjon på stedet. Denne protokollen kan tilpasses andre patogener som bor, akkumuleres eller spres via forurensede vanningssystemer.

Optimalisering av LAMP-metoden I denne studien oppdaget vi tilstedeværelsen av Phytophthora capsici i vanningsvann ved hjelp av en bærbar sløyfemediert isotermisk forsterkning (LAMP) analyse. Først ble den foreslåtte LAMP-analysen optimalisert ved å teste forskjellige LAMP-primerkonsentrasjoner [F3, B3 (0,1–0,5 μM hver); LF, LB (0,5–1,0 μM hver) og FIP, BIP (0,8–2,4 μM hver)], varigheter (30–70 min) og temperaturer (55–70 °C). Den endelige LAMP primerblandingen som ble bru...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Vi utviklet en metode for å oppdage Phytophthora capsici zoospores i vannkilder ved hjelp av en filterpapir DNA ekstraksjon metode kombinert med en loop-mediert isothermal forsterkning (LAMP) analyse som kan analyseres i feltet eller i laboratoriet.

Påvisning av Phytophthora capsici i vanning vanning vann ved hjelp av Loop-mediert isotermisk forsterkning

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Phytopathogen deteksjon er et avgjørende skritt i plantesykdomsbehandling. Denne protokollen gir en rask deteksjonsmetode for vanning vannforurensning på grunn av en vanlig vannbåren fighter patogen. Ved hjelp av denne teknikken kan spesifikt patogen, som Phytophthora capcici, behandles og oppdages raskt fra vårt store volum vanningsvann mens du er på stedet.Viser prosedyren vil være Owen Hudson, en Masters student fra laboratoriet mitt, og Sumyya Waliullah, en postdoktor forsker fra Dr.Pingxi G laboratorium for å sette opp en pumpe og filter for på stedet Phytophthora capcici deteksjon i vanning vann. Fest en filtreringskolbe til et rør som er koblet til en håndpumpe og montert buchnertrakt i gummiproppen i munnen på filtreringskolben. Monter deretter et filterpapir i riktig størrelse med en 15 mikron oppbevaringsstørrelse i trakten.For å få vannprøver samle vanning vann fra den målrettede kilden. Vannet kan ha små mengder rusk, men ikke betydelig sediment eller jord. Hell sakte mellom 50 og 1000 milliliter testvann over filterpapiret inne i trakten mens du bruker håndpumpen til å lage en suge for å trekke vannet gjennom trakten.Når alt vannet er filtrert, bruker du tang til å fjerne filterpapiret fra trakten. Og bruk steril saks for å kutte papiret i små biter. Senk åtte til 12 papirbiter i 400 mikroliter ekstraksjonsbuffer i et 1,5 milliliter rør i en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur.Vortex eller på annen måte røre papiret i 10 sekunder en gang hvert minutt. På slutten av inkubasjonen, bruk tang til å fjerne papiret med så lite buffer som mulig. Og gjenta lisensen med neste sett med filterpapirstykker.For DNA-ekstraksjon fra filterpapirprøvene la 20 mikroliter proteiner K og 10 mikroliter på 10 nanogram per mikroliter RNAer til prøven også og inkubere løsningen ved romtemperatur i 15 minutter med vortexing eller risting hvert tredje minutt. På slutten av inkubasjonen legger du til 500 mikroliter magnetiske perler i bindingsbuffer til prøven og bland godt ved å riste. Etter fem minutter ved romtemperatur plasserer du røret og magnetskillestativet i to minutter før du fjerner og kaster overnatanten.Fjern røret fra magnetseparatoren og trekk forsiktig perlene i 500 mikroliter vaskebuffer. Etter 30 sekunder går røret tilbake til magneten og venter to minutter før du kaster det overnaturlige. Gjenta vasken med 500 mikroliter vaskebuffer også og 500 mikroliter på 80% etanol som nettopp demonstrert.Og luftdeter den magnetiske perlepelleten i 15 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen re-suspendere perlene i 50 mikroliter av elution buffer med pipettering i ett minutt før du plasserer røret tilbake på magneten i to minutter for å tillate samling av supernatant. Etter å ha klargjørt LAMP primer mix som angitt i tabellen, tilsett på 2,5 mikroliter primer blanding 12,5 mikroliter av en lava LAMP mastermix en mikroliter av ekstrahert DNA og ni mikroliter av dobbelt destillert vann til et PCR-rør og sette opp en positiv og en negativ kontroll.inkubere alle prøvene i en 64 grader Celsius varmeblogg i 45 minutter eller genie tre forsterkningsinstrument på slutten av inkubasjonen, en last på fem mikroliter av hver forsterket prøve på en 1% agarose gel og bilde de resulterende båndene på en ultrafiolett bildemaskin. Hvis et kalorimetrisk fargestoff ble brukt, kan du se fargeendringen for å bestemme resultatene som positive eller negative. Hvis et bærbart forsterkningsinstrument ble brukt, kan du vise forsterkningsgrafen på skjermen for å finne resultatene.Den optiske tiden for å kjøre LAMP-analysen ved 64 grader er 45 minutter, da de laveste konsentrasjonene som var positive for deteksjon, ikke forsterkes før 40 minutter, mens høyere konsentrasjoner forsterkes ved 20 minutter. Forsterkning kan bekreftes på en 1% agarose gel merket med en nukleinsyre flekk. Som illustrert er konvensjonell PCR 40 ganger mindre følsom enn LAMP.Oppdage 4,8 ganger 10 til de tredje zoospores per milliliter konsentrasjoner på det laveste. I denne analysen ble vannprøver samlet inn fra syv dammer som brukes til kommersiell grønnsaksproduksjon i Tift County, Georgia. Tre av disse viste positive LAMP-resultater.Når prøvene ble testet av konvensjonelle PCR ble imidlertid dyresporer oppdaget i bare en av de tre positive prøvene. I denne tabellen oppsummeres forskjellene mellom gjenkjenningsmetoder ved hjelp av variabler som følsomhet, tid, nødvendig forberedelse, materialer og kostnader. LAMP er den billigste metoden blant de testede metodene, og er også den raskeste, som krever bare 30 til 60 minutter for forsterkning sammenlignet med konvensjonell PCR-forsterkning.Ved hjelp av denne protokollen DNA ekstrahert fra nært beslektede UMI frø patogener resulterer i ingen deteksjon for noen av prøvene, bekrefter spesifisitet av primere. Pass på at du ikke heller prøvevannet for fort og vær forsiktig når du legger ut ekstrahert DNA til LAMP-rørene for å begrense kontaminering. Når andre vannbårne patogener har fått sine spesifikke primersett utviklet, kan filtrerings- og lampesyremetodene tilpasses andre patogener.

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Papir-basert gjenkjenning av<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp.., Og<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Fra store mengder vann i landbruket

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Laboratory bestemt Fosfor Flux fra innsjøsedimentene som et mål på intern Fosfor Loading

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615. Måling av Enterovirus og Norovirus Forekomst i Water av Kultur- og RT-qPCR. I. Innsamling av virusprøver

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

Et lite volum Bioassay å Vurdere Bakteriell / Planteplankton Co-kultur Bruke VANN-Pulse-amplitydemodulerte (VANN PAM) Fluorometri

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615. Måling av Enterovirus og Norovirus Forekomst i Water av Kultur- og RT-qPCR. Del III. Virus Detection ved RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

En Duplex Digital PCR-analyse for Samtidig Kvantifisering av<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Og Human Fecal-forbundet HF183 Marker i Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for endokrin aktivitet i vann ved hjelp av kommersielt tilgjengelig<em&gt; In Vitro</em&gt; Trans bioassay

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

En enkel plante teknikk for å etablere trær hvor hyppig oversvømmelse oppstår

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing av strømmen miljø egnet for unge ferskvann perle blåskjell med i Situ eksponering metoder

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

Optimalisert prosedyre for å bestemme adsorpsjon av Phosphonates på detaljert Ferric hydroksid bruker miniatyriserte fosfor vilje metode

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...