Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
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Este trabalho recebeu o apoio financeiro da Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID# FP000016659. Os autores agradecem ao Dr. Pingsheng Ji, universidade da Geórgia e à Phytophthora sppDra. Agradecemos também li Wang e Deloris Veney por sua assistência técnica durante todo o estudo.

1. Detecção no local de Phytophthora capsici da água de irrigação usando amplificação isotérmica mediada por loop portátil
<ol><li>Configuração da bomba e do filtro<ol>
<li>Conecte um frasco de filtragem a um tubo conectado a uma bomba de mão para que, quando a bomba for ativada, o ar seja puxado pela boca do frasco filtrante.</li>
		<li>Coloque o funil Buchner na rolha de borracha na boca do frasco filtrante e coloque o pedaço de papel filtro de tamanho apropriado no funil Buchner para que o ar s...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. 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H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

O teste da água de irrigação para fitopatógenos é um passo crucial para os produtores que utilizam lagoas de irrigação e água reciclada27. As lagoas de irrigação fornecem um reservatório e um terreno fértil para uma série de fitopatógenos, uma vez que o excesso de água de irrigação é direcionado do campo para a lagoa carregando consigo quaisquer patógenos que possam ter estado presentes16,,27. O método tradicional de de...

A reciclagem de água em fazendas e viveiros está se tornando cada vez mais popular devido ao aumento dos custos de água e preocupações ambientais por trás do uso da água. Muitos métodos de irrigação foram desenvolvidos para os produtores reduzirem a propagação e a ocorrência de doenças vegetais. Independentemente da fonte da água (irrigação ou precipitação), o escoamento é gerado, e muitos produtores de hortaliças e berçários têm uma lagoa para coletar e reciclar o escoamento1. Isso cria um reservatório para possível acúmulo de patógenos favorecendo a disseminação de patógenos quando a água reciclada é usada para irrigar as culturas2,,3,4. Os patógenos vegetais oomycete se beneficiam particularmente dessa prática, pois os zoosporos se acumularão na água e o esporo dispersivo primário é auto-motil, mas requer água superficial5,,6,,7. Phytophthora capsici é um patógeno oomycete que afeta um número significativo de culturas solanáceas e cucurbitas de diferentes maneiras8. Muitas vezes, os sintomas são amortecimento de mudas, raízes e podridão da coroa; no entanto, em culturas como pepino, abóbora, melão, abóbora, melancia, berinjela e pimenta, colheitas inteiras podem ser perdidas devido à podridão de frutas9. Embora existam métodos conhecidos de detecção desse patógeno vegetal, a maioria requer uma infecção que já tenha ocorrido, o que é tarde demais para que quaisquer fungicidas preventivos tenham um efeito significativo10.
O método tradicional de teste da água de irrigação para a detecção e diagnóstico de microrganismos direcionados é uma abordagem antiquada quando a velocidade e a sensibilidade são cruciais para o sucesso e a produção rentável da cultura11,12. O tecido vegetal suscetível ao patógeno-alvo (por exemplo, berinjela para P. capsici) é anexado a uma armadilha modificada que é suspensa em uma lagoa de irrigação por um período prolongado antes de ser removida e inspecionada para infecção. As amostras do tecido vegetal são então banhadas em mídia semi-seletiva (PARPH) e incubadas para o crescimento da cultura, em seguida, a identificação morfológica é realizada usando um microscópio composto13. Existem outros métodos de detecção semelhantes para outros patógenos vegetais usando mídia seletiva e emplacando pequenas quantidades de água contaminada antes de sub-cultivo14,15. Esses métodos requerem entre 2 e 6 semanas, várias rodadas de subcultura para isolar o organismo, e experimentam em diagnósticos de Phytophthora para serem capazes de reconhecer os principais caracteres morfológicos de cada espécie. Esses métodos tradicionais não funcionam bem para detecção de água de irrigação contaminada por P. capsici devido a fatores como a interferência de outros microrganismos que também estão presentes nas fontes de água. Alguns microrganismos de rápido crescimento, como pythium spp. e bactérias transmitidas pela água podem crescer demais na placa tornando P. capsici indetectável16,17.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um método molecular sensível e específico que possa ser utilizado tanto em ambientes de campo quanto em laboratório para detectar zoospores P. capsici na água de irrigação. O protocolo inclui o desenvolvimento de um novo primer de amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) capaz de amplificar especificamente P. capsici, baseado em um fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici18,19. Um primer LAMP previamente desenvolvido de Dong et al. (2015) foi utilizado em comparação com o ensaio que foi desenvolvido para este estudo20.
O ensaio LAMP é uma forma relativamente nova de detecção molecular que tem sido demonstrada ser mais rápida, sensível e específica do que a reação convencional de cadeia de polimerase (PCR)21. Em geral, os ensaios convencionais de PCR não podem detectar menos de 500 cópias (1,25 pg/μL); em contraste, estudos anteriores mostraram que a sensibilidade da LÂMPADA pode ser 10 a 1.000 vezes maior que a pcr convencional e pode facilmente detectar até mesmo 1 fg/μL de DNA genômico22,23. Além disso, o ensaio pode ser realizado rapidamente (muitas vezes em 30 minutos) e no local (no campo) usando um bloco de aquecimento portátil para amplificação e um corante colorimétrico que muda de cor para uma amostra positiva (removendo a necessidade de eletroforese). Neste estudo, comparamos a sensibilidade dos ensaios PCR e LAMP utilizando um método de extração de filtro. O método de detecção proposto permite que pesquisadores e agentes de extensão detectem facilmente a presença de esporos de P. capsici de diferentes fontes de água em menos de duas horas. O ensaio é provado ser mais sensível do que o PCR convencional e foi validado in situ detectando a presença do patógeno na água de irrigação usada por um produtor. Este método de detecção permitirá que os produtores estimem a presença e a densidade populacional do patógeno em várias fontes de água que estão sendo utilizadas para irrigação, prevenindo surtos devastadores e perdas econômicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

Phytophthora capsici é um patógeno oomycete devastador que afeta muitas culturas solanáceas e cucurbits importantes, causando perdas econômicas significativas na produção de vegetais anualmente. Phytophthora capsici é transmitida pelo solo e um problema persistente nos campos vegetais devido às suas estruturas de sobrevivência de longa duração (oosporos e clamídias) que resistem ao intemperamento e degradação. O principal método de dispersão é através da produção de zoosporos, que são esporos sinalizados de célula única que podem nadar através de filmes finos de água presentes em superfícies ou em poros de solo cheios de água e podem se acumular em poças e lagoas. Portanto, as lagoas de irrigação podem ser uma fonte do patógeno e dos pontos iniciais de surtos da doença. A detecção de P. capsici na água de irrigação é difícil usando métodos tradicionais baseados em cultura porque outros microrganismos presentes no ambiente, como pythium spp., geralmente superreceu P. capsici tornando-o indetectável. Para determinar a presença de esporos de P. capsici em fontes de água (água de irrigação, escoamento, etc.), desenvolvemos um método de filtro à base de bomba manual (8-10 μm) que captura os esporos do patógeno (zoospores) e é posteriormente usado para amplificar o DNA do patógeno através de um novo ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) projetado para a amplificação específica de P. Este método pode amplificar e detectar DNA a partir de uma concentração tão baixa quanto 1,2 x 102 zoospores/mL, que é 40 vezes mais sensível do que o PCR convencional. Não foi obtida amplificação cruzada ao testar espécies intimamente relacionadas. A LÂMPADA também foi realizada utilizando um corante de mistura mestre lampimétrica, exibindo resultados que poderiam ser lidos a olho nu para detecção rápida no local. Este protocolo pode ser adaptado a outros patógenos que residem, acumulam ou são dispersos através de sistemas de irrigação contaminados.

Otimização do método LAMP Neste estudo, detectamos a presença de Phytophthora capsici na água de irrigação usando um ensaio portátil de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP). Primeiro, o ensaio lampião proposto foi otimizado testando diferentes concentrações de primer lamp [F3, B3 (0,1-0,5 μM cada); LF, LB (0,5-1,0 μM cada) e FIP, BIP (0,8-2,4 μM cada)], durações (30-70 min) e temperaturas (55-70 °C). O mix final de primer LAMP utilizado neste estudo foi: 0,2 μM...

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Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Desenvolvemos um método para detectar zoospores Phytophthora capsici em fontes de água usando um método de extração de DNA de papel filtro juntamente com um ensaio de amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) que pode ser analisado no campo ou no laboratório.

Detecção de Phytophthora capsici em água de irrigação usando amplificação isotérmica mediada por loop

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

A detecção de fitopatógeno é um passo crucial no gerenciamento de doenças vegetais. Este protocolo fornece um método de detecção rápida para contaminação da água de irrigação devido a um patógeno comum de caça transmitido pela água. Usando esta técnica, patógenos específicos, como Phytophthora capcici, podem ser processados e rapidamente detectados a partir do nosso grande volume de água de irrigação enquanto permanece no local.Demonstrando o procedimento estarão Owen Hudson, um estudante de mestrado do meu laboratório, e Sumyya Waliullah, pesquisadora de pós-doutorado do laboratório do Dr.Pingxi G para configurar uma bomba e filtro para detecção de Phytophthora capcici no local na água de irrigação. Conecte um frasco de filtragem a um tubo conectado a uma bomba de mão e coloque o funil buchner na rolha de borracha na boca do frasco filtrante. Em seguida, encaixe um pedaço de papel filtro de tamanho apropriado com um tamanho de retenção de 15 mícrons no funil.Para obter amostras de água, coletar água de irrigação da fonte alvo. A água pode ter pequenas quantidades de detritos, mas não sedimentos ou solo significativos. Despeje lentamente entre 50 a 1000 mililitros de água de teste sobre o papel filtro dentro do funil enquanto usa a bomba de mão para criar uma sucção para puxar a água através do funil.Quando toda a água tiver sido filtrada, use fórceps para remover o papel filtro do funil. E use uma tesoura estéril para cortar o papel em pequenos pedaços. Submerse de oito a 12 pedaços de papel em 400 microliters de tampão de extração em um tubo de 1,5 mililitro para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente.Vórtice ou agitar o papel por 10 segundos uma vez a cada minuto. No final da incubação, use fórceps para remover o papel com o mínimo de tampão possível. E repita a licença com o próximo conjunto de peças de papel filtro.Para extração de DNA das amostras de papel filtro adicionou 20 microliters de proteinase K e 10 microliters de 10 nanogramas por RNAs microliter à amostra também e incubar a solução à temperatura ambiente por 15 minutos com vórtice ou tremendo a cada três minutos. No final da incubação, adicione 500 microliters de contas magnéticas em tampão de ligação à amostra e misture bem tremendo. Após cinco minutos em temperatura ambiente, coloque o tubo e o rack separador magnético por dois minutos antes de remover e descartar o supernatante.Remova o tubo do separador magnético e suspenda vigorosamente as contas em 500 microliters de tampão de lavagem. Após 30 segundos, devolva o tubo ao ímã e espere dois minutos antes de descartar o supernatante. Repita a lavagem com 500 microliters de tampão de lavagem também e 500 microliters de 80% de etanol como acabou de demonstrar.E o ar conduz a pelota magnética por 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação suspenda as contas em 50 microliters de tampão de elução com pipetação por um minuto antes de colocar o tubo de volta no ímã por dois minutos para permitir a coleta do supernatante. Após a preparação da mistura de primer LAMP como indicado na tabela, adicione 2,5 microliters de primer mix 12,5 microliters de uma lâmpada de lava mastermix um microliter de DNA extraído e nove microliters de água dupla destilada a um tubo PCR e configurar um controle positivo e um negativo.incubar todas as amostras em um blog de calor de 64 graus Celsius por 45 minutos ou o gênio três instrumentos de amplificação no final da incubação, uma carga de cinco microliters de cada amostra amplificada em um gel de 1%agarose e imagem das bandas resultantes em uma máquina de imagem ultravioleta. Se for utilizado um corante calorimétrico, veja a mudança de cor para determinar os resultados como positivos ou negativos. Se um instrumento de amplificação portátil foi usado, visualize o gráfico de amplificação na tela para determinar os resultados.O tempo óptico para executar o ensaio LAMP a 64 graus é de 45 minutos, já que as concentrações mais baixas que foram positivas para detecção não são amplificadas até 40 minutos, enquanto concentrações mais altas são amplificadas em 20 minutos. A amplificação pode ser confirmada em um gel de 1%agarose rotulado com uma mancha de ácido nucleico. Como ilustrado o PCR convencional é 40 vezes menos sensível que o LAMP.Detectando 4,8 vezes 10 para o terceiro zoospores por mililitro concentrações no menor. Nesta análise, foram coletadas amostras de água de sete lagoas utilizadas para produção comercial de vegetais no Condado de Tift, Geórgia. Três dos quais demonstraram resultados positivos da LAMP.Quando as amostras foram testadas por PCR convencional, no entanto, os zoospores foram detectados em apenas uma das três amostras positivas. Nesta tabela, são resumidas as diferenças entre os métodos de detecção utilizando variáveis como sensibilidade, tempo, preparação necessária, materiais e custo. LAMP é o método mais barato entre os métodos testados, e também é o mais rápido, exigindo apenas 30 a 60 minutos para amplificação em comparação com a amplificação convencional do PCR.O uso deste DNA de protocolo extraído de patógenos de sementes umi intimamente relacionados resulta em nenhuma detecção para nenhuma das amostras, confirmando a especificidade dos primers. Certifique-se de não derramar a água da amostra muito rápido e tenha cuidado ao adicionar DNA extraído aos tubos da LÂMPADA para limitar a contaminação. Uma vez que outros patógenos transmitidos pela água tenham seus conjuntos específicos de primer desenvolvidos, os métodos de filtração e ácido de lâmpada podem ser adaptados para outros patógenos.

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Papel colorimétrico à base de Detecção de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; A partir de grandes volumes de água Agrícola

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Ambiente

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Determinados pelo Laboratório Fósforo Flux do Lago Sedimentos como medida de Fósforo Interno Carregando

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

A Volume Bioassay pequeno para avaliar Bacteriana / fitoplâncton Co-cultura utilizando água-Pulse-Amplitude Modulada (água-PAM) Fluorometria

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente<em&gt; In Vitro</em&gt; Transativação Bioensaios

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

Uma simples técnica de plantação para restabelecer as árvores onde ocorre a inundação frequente

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindicação teste de adequação de ambiente de fluxo para jovens de água doce da pérola mexilhões usando métodos de exposição em Situ

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

Procedimento otimizado para determinar a adsorção de fosfonatos para Granular hidróxido férrico, usando um método de determinação de fósforo miniaturizado

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...